- RNA CAN THIỆP LÊN GEN VP28 CỦA WSSV BIỂU HIỆN BẰNG BACULOVIRUS TÁI TỔ HỢP TRÊN TẾ BÀO. - RNA can thiệp (RNAi) hiện đang được sử dụng rất phổ biến để ức chế sự lây nhiễm của vi-rút. - Gen VP28 của WSSV được chọn làm gen mục tiêu để ức chế sự lây nhiễm WSSV ở tôm bằng RNAi. - Để đánh giá khả năng can thiệp của RNAi lên gen mục tiêu có biểu hiện ở mức độ cao, hiệu quả ức chế của dsRNA lên gen VP28 biểu hiện bằng baculovirus tái tổ hợp từ khởi điểm polyhedrin trên tế bào côn trùng được xác định. - Kết quả cho thấy hiệu quả ức chế gen mục tiêu đạt được ở mức 80-100%.. - RNA can thiệp (RNA interference-RNAi) hiện đang được sử dụng rất phổ biến trong nghiên cứu chức năng gen và ức chế sự sao chép của vi-rút ở người, động vật và thực vật (Haasnoot et al., 2003. - RNAi là quá trình sinh học xảy ra trong tế bào được kích hoạt bởi các RNA xoắn kép (double- stranded RNA-dsRNA). - Các dòng tế bào côn trùng được sử dụng rất phổ biến cho các nghiên cứu về chức năng của gen (Cherbas et al., 1994, Schneider &. - Blumenthal, 1978) và các baculovirus tái tổ hợp trên tế bào côn trùng như tế bào Spodoptera frugiperda(Sf) được cũng sử dụng rất phổ biến đề biểu hiện gen (Summers &. - Trong nghiên cứu này các gen VP28 của WSSV được chọn để biểu hiện bằng baculovirus tái tổ hợp (AcMNPV) trên tế bào côn trùng Spodoptera frugiperda và Drosophila melanogaster nhằm xác định hiệu quả can thiệp của dsRNA lên sự biểu hiện của gen này.. - 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nuôi tế bào. - Tế bào côn trùng Spodoptera frugiperda (Sf21) được nuôi ở 27 C trong chai nuôi tế bào 25cm 2 có chứa 4 ml môi trường Grace’s (Sf21) (Gibco BRL, Life Technologies) có bổ sung 10 % foetal bovine serum. - Qui trình cấy chuyển các dòng tế bào được thực hiện theo phương pháp của (Summers &. - 2.3 Baculovirus tái tổ hợp biểu hiện gen VP28 của WSSV 2.3.1 Tái tổ hợp AcMNPV-D/G-VP28. - Hệ thống biểu hiện gen baculovirus Bac-to-Bac (Invitrogen) được sử dụng để biểu hiện cùng lúc green fluorescent protein (GFP) từ khởi điểm p10 và gen VP28 của WSSV từ khởi điểm polyhedrin trên tế bào Sf21 (van Hulten et al., 2002).. - Một µl Fastbac-D/G-VP28 véctơ (300ng/ µl) (van Hulten et al., 2002) được đưa vào 50 μl tế bào khả nạp E. - Tế bào E. - 100 µl tế bào vi khuẩn sau đó được tán lên mặt đĩa thạch LB có chứa Bluo-gal (100 g/ml), IPTG (40 g/ml), kanamycin (50 g/ml), tetracyline (10. - 2.3.3 Chuyển nạp bacmid DNA vào tế bào Sf21 để tạo baculovirus tái tổ hợp Tế bào Sf21 được nuôi trong đĩa 96 giếng có chứa 2 ml môi trường Grace’s bổ sung 10 % FBS ở mật độ khoảng 0.5-1 x 10 6 tế bào/ml. - Ba ngày sau khi chuyển nạp, dung dịch nuôi tế bào côn trùng được thu và giữ ở 4 ºC.. - Tế bào Sf21 cells (1.2 x 10 7 tế bào) được nuôi trong chai 75 cm 2 ở 27˚C. - Sau khi nuôi qua đêm, dung dịch nuôi tế bào được rút bỏ và tế bào được gây nhiễm với 3 ml môi trường Grace’s có chứa 10 % FBS và baculovirus tái tổ hợp ở mức độ. - tế bào với 3 ml môi trường Grace’s có chứa 10 % FBS. - Tế bào Sf21 sau đó được chuyển sang ống nghiệm 10 ml và li tâm 2,000 vòng/phút trong 5 phút. - Dich chiết chứa vi-rút sau khi gây nhiễm với tế bào SF21 được pha loãng 10 lần từ 10 -1 đến 10 -9 trong ống eppendorf. - Sau đó 90 l tế bào Sf21 (mật độ 1.5 x 10 6 tế bào/ml trong môi trường Grace’s có bổ sung 10 % FBS) được cho vào các ống eppendorf có chứa vi-rút đã được pha loãng. - Tiếp đến, 10 l dung dịch vi-rút/tế bào được chia vào các giếng của đĩa 60 giếng. - Dãy giếng 6 cuối cùng của đĩa được cho vào (10 l/giếng) dung dịch tế bào không nhiễm vi-rút để làm đối chứng. - Hàm lượng pha loãng tối đa được xác định bằng cách quan sát hiệu ứng gây độc tế bào ở từng giếng dưới kính hiển vi. - Liều gây nhiễm 50% tế bào (TCID 50 /ml) được tính theo công thức của Reed và Muench (1938): TCID 50 /ml = 10 (a+x) *200, trong đó: a = log n. - n = độ pha loãng cao nhất mà số tế bào nhiễm vi-rút lớn hơn 50. - b = phần trăm số tế bào nhiễm vi-rút ở giếng có độ pha loãng n. - c = phần trăm số tế bào nhiễm vi-rút ở giếng có độ pha loãng n gấp 10 lần độ pha loãng n.. - 2.4 Chuyển nạp dsRNA vào tế bào côn trùng. - dsRNA (0.5 g/ml tế bào) được chuyển nạp vào tế bào côn trùng (khoảng 1 x 10 6 tế bào/ml) bằng dung dịch chuyển nạp Cellfectin (Invitrogen) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.. - 2.5 Xác định mức độ biểu hiện gen. - Hoạt tính của GFP (protein phát huỳnh quang) trên tế bào côn trùng được xác định bằng kính hiển vi quỳnh quang sau 24 và 48 giờ chuyển nạp véc tơ tái tổ hợp AcMNPV-D/G-VP28.. - 2.6 Đếm tế bào nhiễm vi-rút. - Tế bào nhiễm vi-rút và phần trăm số tế bào nhiễm (tế bào phát huỳnh quang) được xác định sau 48 giờ gây nhiễm bằng máy đếm tế bào phát huỳnh quang (fluorescence-activated cell sorter-FACS calibur, Becton Dickinson). - RNA được chiết tách từ tế bào Sf21 bằng dung dịch TriZol (Invitrogen) và cDNA được tạo bằng kit reverse transcriptase superscript III (Invitrogen) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. - 3.1 Gây nhiễm tế bào côn trùng với AcMNPV-WSSV VP28. - Hệ thống biểu hiện gen baculovirus Bac-to-Bac được sử dụng để tạo baculovirus tái tổ hợp biểu hiện gen VP28 của WSSV trên tế bào Sf21. - Các tế bào Sf21 nhiễm AcMNPV-WSSV-VP28 được trình bày ở hình 1.. - Hình 1: Tế bào SF21 phát huỳnh quang sau khi gây nhiễm baculovirus tái tổ hợp AcMNPV- WSSV VP28. - 3.2 dsRNA can thiệp baculovirus tái tổ hợp biểu hiện gen VP28 của WSSV trên tế bào Sf21. - Đề xác định sự ức chế lây nhiễm baculovirus tái tổ hợp trên tế bào côn trùng Sf21, dsRNA được thiết kế có trình tự tương đồng với gen phiên mã IE1 (dsRNA- AcMNPV-IE1) gen glycoprotein GP64 của baculovirus (dsRNA-AcMNPV-GP64) (Bảng 1). - dsRNA cũng được thiết kế có trình tự tương đồng với gen VP28 của WSSV (dsRNA-WSSV-VP28. - bảng 1) để xác định khả năng ức chế biểu hiện gen VP28 của baculovirus tái tổ hợp khi nhiễm vào tế bào côn trùng. - Các hàm lượng dsRNA khác nhau (50, 100 và 150 ng) được chuyển nạp vào 0.1 x 10 6 tế bào Sf21 để đánh. - (M.O.I = 0.001) sau khi chuyển nạp dsRNA 48 giờ. - Tế bào được chuyển nạp với nước và được gây nhiễm AcMNPV-GFP-VP28 để làm đối chứng. - Số lượng tế bào phát huỳnh quang được quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang sau 48 giờ gây nhiễm baculovirus. - Mức độ ức chế sự lây nhiễm được tính trên tỉ lệ số tế bào phát quang ở nghiệm thức có chuyển nạp dsRNA và nghiệm thức đối chứng.. - Hình 2: Ảnh hưởng của hàm lượng dsRNA lên sự nhiễm baculovirus trên tế bào côn trùng.. - Sự ức chế lây nhiễm hoàn toàn quan sát được ở nghiệm thức chuyển nạp 100 và 150ng dsRNA (Hình 2). - dsRNA có trình tự tương đồng với gen GP64 (dsRNA-AcMNPV-GP64) cũng ức chế sự lây nhiễm baculovirus theo hàm lượng dsRNA được chuyển nạp. - Mức độ ức chế giảm khoảng 41 % ở nghiệm thức chuyển nạp 50 ng dsRNA, tăng 65 % ở nghiệm thức chuyển nạp 100ng dsRNA và 77 % ở nghiệm thức chuyển nạp 150 ng dsRNA. - Nghiệm thức chuyển nạp dsRNA không đặc hiệu (150 ng dsRNA-luc) thì mức độ ức chế giảm khoảng 26 % so với nghiệm thức đối chứng. - Tuy nhiên, dsRNA-luc với hàm lượng 100 ng không ức chế lây nhiễm baculovirus (Hình 2). - Kết quả trên cho thấy hiệu quả ức chế tùy thuộc vào hàm lượng dsRNA.. - 3.3 dsRNA can thiệp sự biểu hiện gen VP28 của baculovirus tái tổ hợp. - Thí nghiệm được thực hiện để xác định khả năng ức chế lây nhiễm baculovirus tái tổ hợp của dsRNA có trình tự tương đồng với gen VP28 của WSSV (dsRNA- WSSV-VP28). - Tất cả các dsRNAs được chuyển nạp với hàm lượng 150 ng vào 10 5 tế bào Sf 21. - Sau khi chuyển nạp dsRNA 48 giờ, tế bào được gây nhiễm với AcMNPV-GFP-VP28 (M.O.I = 0.001). - Tế bào được. - chuyển nạp với nước và được gây nhiễm AcMNPV-GFP-VP28 để làm đối chứng.. - Số lượng tế bào phát huỳnh quang được quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang và máy đếm tế bào phát huỳnh quang sau 48 giờ gây nhiễm baculovirus. - Dựa trên tỉ lệ số tế bào phát quang ở nghiệm thức có chuyển nạp dsRNA và nghiệm thức đối chứng, mức độ ức chế sự lây nhiễm khoảng 98% được ghi nhận ở nghiệm thức chuyển nạp dsRNA-AcMNPV-IE1. - Nghiệm thức chuyển nạp dsRNA-AcMNPV- GP64 có khoảng 71. - Nghiệm thức chuyển nạp dsRNA-WSSV-VP28 có mức độ ức chế khoảng 59 % tương đương với nghiệm thức chuyển nạp dsRNA-luc (Hình 3).. - Hình 3: Kết quả phân tích FACS tế bào Sf21 sau 48 giờ nhiễm AcMNPV-GFP-VP28. - b) tế bào chuyển nạp dsRNA-luc. - c) tế bào chuyển nạp dsRNA-AcMNPV-GP64 và nhiễm baculovirus. - d) tế bào chuyển nạp dsRNA-AcMNPV-IE1 và nhiễm baculovirus. - tế bào chuyển nạp dsRNA-VP28 và nhiễm baculovirus. - Hiệu quả ức chế nhiễm baculovirus biểu hiện gen VP28 của dsRNA-VP28 được xác định qua mức độ biểu hiện của RNA thông tin của gen VP28 (tRNA VP28) được đánh giá bằng RT-PCR sử dụng RNA chiết tách từ tế bào Sf21 thí nghiệm và mồi phát hiện gen VP28 (bảng 1). - agarose cho thấy mức độ biểu hiện của tRNA VP28 ở tế bào Sf21 được chuyển nạp dsRNA-WSSV-VP28 giảm rỏ rệt so với tế bào ở các nghiệm thức khác (Hình 4). - Từ kết quả này có thể kết luận dsRNA-WSSV-VP28 có khả năng ức chế sự biểu hiện RNA thông tin của gen VP28. - Như đã dự đoán, mức độ biểu hiện RNA thông tin của gen VP28 ở nghiệm thức chuyển nạp dsRNA-AcMNPV-IE1 cũng giảm rõ rệt vì dsRNA này gây ức chế rõ rệt sự lây nhiễm baculovirus. - Mức độ biểu hiện RNA thông tin của gen VP28 dsRNA-AcMNPV-GP64 thì thấp hơn và dsRNA-luc không đặc hiệu thì không có khả năng ức chế biểu hiện RNA thông tin của gen VP28.. - 1) tế bào chuyển nạp nước và nhiễm baculovirus. - 2) tế bào chuyển nạp dsRNA-WSSV-VP28 và nhiễm baculovirus. - 3) tế bào chuyển nạp dsRNA-AcMNPV-IE1 và nhiễm baculovirus. - 4) tế bào chuyển nạp dsRNA-AcMNPV-GP64 và nhiễm baculovirus. - 5) tế bào chuyển nạp dsRNA-luc và. - 6) tế bào chuyển nạp nước và không nhiễm baculovirus. - Kết quả từ nghiên cứu này cho thấy dsRNA có thể ức chế sự lây nhiễm vi-rút có gen có trình tự tương đồng. - Mức độ ức chế của RNAi được đánh giá qua sự biểu hiện gen ở mức độ cao. - Rõ ràng dsRNA tương đồng với gen phiên mã (IE1) và gen glycoprotein (GP64) của AcMNPV có thể ức chế sự lây nhiễm của baculovirus trên tế bào Sf21. - IE1 là gen cần thiết cho sự khởi đầu của quá trình phiên mã của một số gen sớm ở baculovirus và vì thế ức chế biểu hiện gen IE1 sẽ dẫn đến ức chế sự sao chép của vi-rút (Kovacs et al., 1991). - Các thí nghiệm trong nghiên cứu này xác định khả năng ức chế hoàn toàn sự lây nhiễm vi-rút của dsRNA-AcMNPV- IE1. - Gen GP64 của AcMNPV là gen cần thiết cho cấu trúc protein của virion giúp cho sự trưởng thành của vi-rút trong tế bào bị nhiễm và d8e63 nhiễm vào tế bào khác (Monsma et al., 1996). - Cho nên, khi gen GP64 bị ức chế biểu hiện thì sự hình thành baculovirus cũng bị ức chế dẫn đến sự ức chế khả năng lây nhiễm của chúng. - (2003) cho thấy dsRNAs tương đồng với gen IE1 và GP64 của AcMNPVcó thể ức chế sự lây nhiễm của baculovirus trong tế bào. - Kết quả của nghiên cứu này, bên cạnh trình tự của các dsRNA thì khả năng ức chế sự lây nhiễm vi-rút còn tùy thuộc vào hàm lượng dsRNA sử dụng mà các nghiên cứu trước đây chưa đề cập đến (Means et al., 2003. - (2005) đã chứng minh rằng khi chuyển nạp siRNA tương đồng với gen VP28 của WSSV hoặc siRNA tương đồng với gen GFP vào tế bào Sf21 sẽ gây ức chế baculovirus biểu hiện các gen này nhưng không làm ức chế sự lây nhiễm vi-rút. - Cùng với sự giảm đi của mức độ nhiễm vi-rút, mức độ biểu hiện RNA thông tin của gen VP28 ở nghiệm thức có dsRNA-VP28 cũng giảm rõ rệt.. - Điều này cho thấy, ngoài hiệu ứng không đặc hiệu của dsRNA lên sự sao chép của vi-rút còn có sự ức chế đặc hiệu lên biểu hiện của gen VP28. - Kết quả nghiên cứu cho thấy hiệu quả ức chế gen VP28 của WSSV gây bệnh ở tôm bằng dsRNA trong điều kiện in vitro. - dsRNA có trình tự tương đồng với gen VP28 WSSV có thể can thiệp từ 80-100% sự biểu hiện của gen VP28 biểu hiện bằng baculovirus tái tổ hợp