- RỐI LOẠN KHẢ NĂNG VẬN ĐỘNG TRÊN MÔ HÌNH RUỒI GIẤM BIỂU HIỆN PROTEIN ALPHA-SYNUCLEIN. - Từ khóa: bệnh Parkinson, ruồi giấm, alpha-synuclein.. - Có nhiều yếu tố nguy cơ gây bệnh Parkinson, trong đó yếu tố di truyền liên quan tới biểu hiện bất thường của protein alpha-synuclein được coi là nguyên nhân chính dẫn đến sự khởi phát sớm của bệnh. - Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng hệ thống GAL4/UAS với mục đích biểu hiện protein alpha-synuclein tại mô não và đánh giá mức độ ảnh hưởng của protein này lên khả năng vận động và tuổi thọ của mô hình ruồi giấm. - Kết quả cho thấy ruồi giấm biểu hiện protein alpha-synuclein bị rối loạn khả năng vận động ở cả giai đoạn ấu trùng và trưởng thành, mức độ suy giảm vận động tăng dần theo tuổi. - Bệnh Parkinson (Parkinson Disease – PD) có biểu hiện rối loạn vận động phổ biến nhất và là bệnh thoái hóa thần kinh phổ biến thứ hai sau bệnh Alzheimer, với khoảng 1% dân số trên thế giới ở độ tuổi 65 mắc bệnh và tăng lên gần 5% ở tuổi 85. - Thể Lewy là cấu trúc có dạng hình cầu và ưa axit, bắt màu mạnh khi dùng hóa chất nhuộm cho protein alpha-synuclein. - Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra mối liên quan giữa biểu hiện lâm sàng của bệnh Parkinson với việc lắng đọng protein alpha-synuclein nằm ngoài vùng chất đen của não. - Protein alpha-synuclein được mã hóa bởi gen SNCA (Synuclein Alpha), một trong ba gen thuộc họ synuclein (α, β, γ) ở người. - 6,7 Alpha-synuclein có chức năng trong việc giải phóng các chất dẫn truyền thần kinh. - 8 Sự dẫn truyền thần kinh sẽ bị nhiễu loạn nếu protein này biểu hiện quá mức. - Các đột biến điểm này dẫn tới việc tổng hợp nên protein alpha-synuclein sai hỏng, làm gián đoạn hoạt động bình thường của tế bào thần kinh, khiến dopamine tích lũy tới mức độc hại, từ đó làm chết các tế bào dopamine. - Alpha-synuclein đột biến cũng có thể làm nhiễu loạn sự dẫn truyền các xung điện thần kinh qua synap, gây ra các biểu hiện rối loạn vận động, giảm trí nhớ ở bệnh nhân Parkinson. - biểu hiện protein alpha-synuclein tại mô não của ruồi giấm, đồng thời đánh giá ảnh hưởng lên khả năng vận động (ở cả giai đoạn ấu trùng và giai đoạn trưởng thành) và tuổi thọ của ruồi trong mối liên quan đến bệnh Parkinson. - Đây là hướng nghiên cứu hoàn toàn mới tại Việt Nam, góp phần củng cố bằng chứng về vai trò của alpha-synuclein trong sinh bệnh học Parkinson, đồng thời càng làm đa dạng các mô hình ứng dụng trong sàng lọc thuốc điều trị bệnh.. - Nghiên cứu sử dụng các dòng ruồi giấm chuyển gen thu thập từ các trung tâm lưu trữ lớn trên thế giới bao gồm:. - Dòng driver: định hướng biểu hiện protein GAL4 tại mô não ruồi giấm. - Dòng bệnh: ruồi giấm biểu hiện gen SNCA mã hoá cho protein alpha-synuclein mang đột biến A30P của người. - Dòng đối chứng: mang gen biểu hiện protein GFP. - Ruồi giấm được nuôi trong môi trường thức ăn cơ bản bao gồm 0,65% agarose, 10%. - Phương pháp biểu hiện protein alpha- synuclein trên não của ruồi giấm.. - Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành biểu hiện protein alpha-synuclein trên mô não của ruồi giấm sử dụng hệ thống điều hoà biểu hiện gen GAL4/UAS. - Nhờ đó protein alpha-synuclein được tạo ra và biểu hiện trên mô não của ruồi giấm.. - Ruồi giấm được nuôi trong môi trường thức ăn cơ bản bao gồm 0,65%. - Phương pháp biểu hiện protein alpha-synuclein trên não của ruồi giấm Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành biểu hiện protein alpha-synuclein trên mô não của ruồi giấm sử dụng hệ thống điều hoà biểu hiện gen GAL4/UAS. - Phép lai 2: tạo dòng bệnh biểu hiện protein alpha-synuclein:. - Ruồi giấm sau khi lai tạo sẽ được sử dụng cho một loạt các thí nghiệm đánh giá hành vi trong mối liên quan với bệnh Parkinson. - Xác định biểu hiện của protein alpha- synuclein trên não ruồi bằng phương pháp nhuộm miễn dịch huỳnh quang.. - Thí nghiệm được tiến hành trên não của ấu trùng ruồi giấm ngày 3. - Mô não sau khi xử lý được ủ với kháng thể bậc 1 (Anti-mouse alpha-synuclein –ProteinTech, tỷ lệ 1:200 trong NGS 10%) ở 4ºC trong 16h. - Phương pháp đánh giá khả năng vận động của ruồi giấm ở giai đoạn ấu trùng bằng thử nghiệm bò trườn (Crawling assay). - Quy trình được tiến hành dựa theo mô tả trong nghiên cứu của Nichols và cộng sự 9 với mục đích đánh giá khả năng vận động của ấu trùng ruồi giấm biểu hiện protein alpha-synuclein thông qua đánh giá vận tốc trung bình và hình dạng đường di chuyển của ấu trùng. - để ghi lại hình ảnh vận động của ấu trùng. - Phương pháp đánh giá khả năng vận động ở ruồi giấm trưởng thành (Climbing assay). - Thiết kế thí nghiệm được dựa trên nghiên cứu của Surya TM và cộng sự (2015) với mục đích đánh giá khả năng vận động của ruồi giấm biểu hiện protein alpha-synuclein tại mô não.. - Thí nghiệm dựa trên tập tính trèo ngược chiều trọng lực khi có lực tác động cùng chiều trọng lực của ruồi giấm. - Ruồi giấm được lựa chọn làm thí nghiệm sẽ được gây mê bằng CO 2 sau đó được chuyển vào mỗi ống thủy tinh (15 – 20 ruồi/ ống) có chia vạch từ 1 đến 5, mỗi vạch cách nhau 2 cm. - Phương pháp đánh giá tuổi thọ của ruồi giấm (Viability assay). - Thí nghiệm được xây dựng theo nghiên cứu của Antonio LR và cộng sự để xác định ảnh hưởng của alpha-synuclein lên tuổi thọ của ruồi giấm. - Theo đó, 40 cá thể ruồi giấm trưởng thành ở mỗi dòng chứng và bệnh được nuôi trong điều kiện tiêu chuẩn. - Kết quả của thí nghiệm đánh giá tuổi thọ của ruồi giấm được tổng hợp bằng Microsoft Excel và phân tích bằng phần mềm GraphPad Prism 7. - Nghiên cứu này được thực hiên trên ruồi giấm chuyển gen và chưa có thử nghiệm trên các đối tượng khác. - Biểu hiện protein alpha-synuclein trên não của ruồi giấm. - Trong nghiên cứu này, chúng tôi xây dựng mô hình PD trên ruồi giấm bằng biểu hiện protein alpha-synuclein ở não ruồi thông qua hệ thống biểu hiện gen GAL4/UAS. - Phương pháp nhuộm miễn dịch huỳnh quang với kháng thể đặc hiệu được sử dụng để kiểm chứng sự biểu hiện của protein alpha-synuclein trên mô não ruồi. - Kết quả nhuộm miễn dịch huỳnh quang xác định biểu hiện của protein alpha-synuclein trên não ấu trùng ruồi giấm ngày 3 của nhóm chứng (elav>GFP-CD8) và nhóm bệnh (elav>SNCA) lần lượt chụp dưới ánh sáng trắng (A;C) và dưới ánh sáng huỳnh quang bước sóng 546nm (B;D). - Mũi tên chỉ vị trí biểu hiện của alpha-synuclein trên não ấu trùng ruồi giấm.. - Kết quả nhuộm miễn dịch huỳnh quang cho thấy, ở nhóm bệnh lý thu được tín hiệu huỳnh quang sáng và rõ nét tại hai bán cầu não của ấu trùng ruồi giấm ngày 3,. - Kết quả nhuộm miễn dịch huỳnh quang xác định biểu hiện của protein alpha-synuclein trên não ấu trùng ruồi giấm ngày 3 của nhóm chứng (elav>GFP-CD8) và nhóm bệnh (elav>SNCA) lần lượt chụp dưới ánh sáng trắng (A;C) và dưới ánh sáng huỳnh quang bước sóng 546nm (B;D). - Kết quả nhuộm miễn dịch huỳnh quang cho thấy, ở nhóm bệnh thu được tín hiệu huỳnh quang sáng và rõ nét tại hai bán cầu não của ấu trùng ruồi giấm ngày 3, đặc hiệu cho protein alpha-synuclein. - hiệu này không phát hiện thấy ở nhóm chứng, khẳng định sự thành công trong việc biểu hiện protein đích tại mô não ruồi giấm và khả năng sử dụng mô hình cho các thí nghiệm hành vi tiếp theo.. - Khả năng vận động của ruồi giấm ở giai đoạn ấu trùng. - Sau khi đã biểu hiện được protein alpha-synuclein trên não ruồi, chúng tôi tiếp tục tiến hành thí nghiệm đánh giá khả năng vận động của ruồi giấm mang gen bệnh PD ở hai giai đoạn trong vòng đời của chúng bao gồm: giai đoạn ấu trùng thông qua thử nghiệm bò trườn (crawling assay) và giai đoạn trưởng thành thông qua thử nghiệm leo trèo (climbing assay). - Ở thí nghiệm bò trườn, ấu trùng ruồi giấm ngày 3 được thu thập và khảo sát quá trình vận động (bao gồm vận tốc trung bình và hình dạng đường đi) bằng cách ghi lại toàn bộ quá trình di chuyển của chúng trên đĩa thạch agar 2%. - đặc hiệu cho protein alpha-synuclein. - Tín hiệu này không phát hiện thấy ở nhóm đối chứng, khẳng định sự thành công trong việc biểu hiện protein đích tại mô não ruồi giấm và khả năng sử dụng mô hình cho các thí nghiệm hành vi tiếp theo.. - Khả năng vận động của ruồi giấm ở giai đoạn ấu trùng. - Ở thí nghiệm bò trườn, ấu trùng ruồi giấm ngày 3 được thu thập và khảo sát quá trình vận động (bao gồm vận tốc trung bình và hình dạng đường đi) bằng cách ghi lại toàn bộ quá trình di chuyển của chúng trên đĩa thạch agar 2%.. - Kết quả cho thấy ấu trùng ngày 3 của nhóm ruồi bệnh (elav>SNCA) có hiện tượng suy giảm khả năng vận động so với nhóm đối chứng (elav>GFP-CD8), biểu hiện qua việc giảm tốc độ di chuyển (p<. - Kết quả này cho thấy việc biểu hiện protein alpha-synuclein trên não làm suy giảm và rối loạn vận động của ấu trùng ruồi giấm.. - Khả năng vận động ở ruồi giấm trưởng thành. - Ở giai đoạn ruồi trưởng thành, khả năng vận động của ruồi giấm ở hai nhóm được đánh giá qua thử nghiệm leo trèo và tiến hành ở các thời điểm 3 ngày, 7 ngày, 14 ngày, 21 ngày và 28 ngày tuổi. - Như vậy, kết quả của thử nghiệm bò trườn và thử nghiệm leo trèo đã cho thấy việc biểu hiện protein alpha-synuclein trên não ruồi đã gây ra sự suy giảm và rối loạn vận động ở cả giai đoạn ấu trùng và giai đoạn trưởng thành của ruồi giấm. - Bên cạnh biểu hiện suy giảm khả năng vận động thì giảm tuổi thọ cũng là một trong nh ữ ng h ệ qu ả mà b ệ nh Parkinson gây ra. - Th ờ i gian s ố ng sót trung bình trong vòng đời của ruồi giấm được đánh giá tại thời điểm 50% số cá thể trong quần thể còn sống.. - K ế t qu ả thu đượ c cho th ấ y, th ờ i gian s ố ng sót trung bình c ủ a ru ồ i gi ấ m ở nhóm b ệ nh Kết quả cho thấy ấu trùng ngày 3 của nhóm ruồi bệnh (elav>SNCA) có hiện tượng suy giảm khả năng vận động so với nhóm đối chứng (elav>GFP-CD8), biểu hiện qua việc giảm tốc độ di chuyển (p<. - Ở giai đoạn ruồi trưởng thành, khả năng vận động của ruồi giấm ở hai nhóm được đánh giá qua thử nghiệm leo trèo và tiến hành ở các thời điểm 3 ngày, 7 ngày, 14 ngày, 21 ngày và 28 ngày tuổi.. - Bên cạnh biểu hiện suy giảm khả năng vận động thì giảm tuổi thọ cũng là một trong những hệ quả. - Thời gian sống sót trung bình trong vòng đời của ruồi giấm được đánh giá tại thời điểm 50% số cá thể trong quần thể còn sống. - Kết quả thu được cho thấy, thời gian sống sót trung bình của ruồi giấm ở nhóm bệnh biểu hiện protein alpha-synuclein là 33 ngày, thấp hơn so với thời gian sống sót trung bình ở nhóm chứng (39 ngày).. - Biểu đồ thể hiện tuổi thọ của ruồi giấm ở nhóm chứng (elav>GFP-CD8) và nhóm bệnh (elav>SNCA). - Trong đó, trục hoành thể hiện tuổi thọ của ruồi giấm tính theo ngày, trục tung thể hiện tỷ lệ ruồi còn sống trong từng nhóm tính theo đơn vị phần trăm. - Kết quả này cho thấy việc biểu hiện protein alpha-synuclein trên não đã làm rối loạn khả năng vận động đồng thời làm suy giảm tuổi thọ trung bình của ruồi giấm.. - biểu hiện protein alpha-synuclein là 33 ngày, thấp hơn so với thời gian sống sót trung bình ở nhóm chứng (39 ngày).. - Biểu đồ thể hiện tuổi thọ của ruồi giấm ở nhóm chứng (elav>GFP- CD8) và nhóm bệnh (elav>SNCA). - Trong đó, trục hoành thể hiện tuổi thọ của ruồi giấm tính theo ngày, trục tung thể hiện tỷ lệ ruồi còn sống trong từng nhóm tính theo đơn vị phần trăm. - Với cấu trúc hệ thần kinh gần như hoàn thiện và chức năng tương đồng cao với người, ruồi giấm đã được sử dụng rộng rãi như một mô hình nghiên cứu về các bệnh lý thần kinh và vận động của người. - Mặc dù ruồi giấm có một hệ thống thần kinh trung ương chứa ít các đơn vị tế bào thần kinh hơn so với các hệ thần kinh trung ương của động vật có xương sống, nhưng chúng có chung các loại chất dẫn truyền thần kinh như GABA, glutamate, dopamine, serotonin và acetylcholine. - 10 Vì thế ruồi giấm thực sự là mô hình lý tưởng để nghiên cứu bệnh liên quan đến thần kinh như Parkinson.. - Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng hệ thống GAL4/UAS để biểu hiện protein alpha-synuclein tại mô não của ruồi giấm, đồng thời sử dụng dòng ruồi biểu hiện protein GFP (Green Fluorescent Protein) làm đối chứng. - Nhóm ruồi đối chứng có cùng phương thức biểu hiện với mong muốn tạo ra sự tương tự về ảnh hưởng của việc biểu hiện một loại protein ngoại lai trên mô não ruồi giấm. - Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng hệ thống GAL4/UAS để biểu hiện protein alpha-synuclein tại mô não của ruồi giấm, đồng thời sử dụng dòng ruồi biểu hiện protein. - Nghiên cứu cũng đã xây dựng được mô hình ruồi giấm với những biểu hiện bệnh lý đặc trưng cho bệnh Parkinson bao gồm rối loạn khả năng vận động và suy giảm tuổi thọ. - Điều này phù hợp với những đặc trưng của bệnh Parkinson, thường biểu hiện ở người cao tuổi và tuổi càng cao thì mức độ bệnh càng nghiêm trọng, các triệu chứng rối loạn vận động càng rõ ràng. - Nhiều nghiên cứu trên thế giới cũng đã chứng minh được sự biểu hiện của protein alpha- synuclein trong não ruồi. - UAS để biểu hiện protein alpha-synuclein bị đột biến trong não ruồi và cho thấy sự gây độc của nó đối với các tế bào thần kinh. - 13 Bên cạnh đó, nhiều mô hình khác nhau cũng đã được sử dụng để biểu hiện protein alpha-synuclein và chứng minh độc tính của protein này. - Trong môi trường nuôi cấy và tăng trưởng, biểu hiện quá mức của alpha- synuclein làm hạn chế sự phát triển của các tế bào nấm men. - Elegans cũng được sử dụng để chỉ ra alpha- synuclein có thể làm thoái hóa các tế bào thần kinh sinh dopamine. - 15 Điểm chung của các mô hình này là đều cho thấy tác động bất lợi của việc biểu hiện alpha-synuclein lên hệ thống sống.. - Việc đánh giá được ảnh hưởng của sự biểu hiện alpha-synuclein lên khả năng vận động ở giai đoạn sớm là ấu trùng ngày 3 và giai đoạn sau là ruồi trưởng thành đều có ý nghĩa thiết thực và mang đến nhiều lợi ích. - Ấu trùng ngày 3 của nhóm ruồi biểu hiện alpha-synuclein đã thể hiện sự suy giảm và rối loạn vận động so với nhóm chứng, từ đó gợi ý cho các nghiên cứu thử nghiệm thuốc và các dược chất thiên nhiên có tác dụng điều trị PD ngay từ giai đoạn sớm.. - Còn ở giai đoạn muộn hơn, ruồi trưởng thành của nhóm bệnh có những biểu hiện suy giảm vận động nghiêm trọng dần khi ngày tuổi càng cao. - Nghiên cứu đã biểu hiện thành công protein alpha-synuclein trên mô não ruồi giấm sử dụng hệ thống GAL4/UAS. - Ruồi giấm biểu hiện protein alpha-synuclein có biểu hiện kiểu hình đặc trưng của bệnh Parkinson như giảm khả năng vận động và rút ngắn tuổi thọ.. - Heat Shock Prevents Alpha- synuclein-induced Apoptosis in a Yeast Model of Parkinson’s Disease. - THE EXPRESSION OF ALPHA-SYNUCLEIN PROTEIN OF PARKINSON'S DISEASE INDUCED DEFECTS IN DROSOPHILA. - There are many risk factors for Parkinson's disease, in which genetic factors associated with abnormal expression of the protein alpha-synuclein are considered to be the main cause of the early onset. - In this study, we used the GAL4/UAS system to express the protein alpha-synuclein in brain tissue and to evaluate the effect of this protein expression on locomotive ability and longevity of fruit flies. - The results showed that the fruit flies expressing the protein alpha-synuclein had dyskinesia in both larval and adult stage