So sánh hiệu quả khả năng làm lành vết thương ở chuột Swiss bằng tế bào gốc trung mô từ mỡ và tế bào gốc đơn nhân từ mỡ

- Làm lành vết thương, loét, tế bào đơn nhân từ mỡ, tế bào gốc trung mô từ mỡ.
- Tế bào gốc từ mỡ có khả năng điều hòa miễn dịch và biệt hóa thành các tế bào chuyên hóa nhằm sửa chữa các cơ quan tổn thương của cơ thể..
- Nghiên cứu này nhằm đánh giá tác động của tế bào từ mỡ đến quá trình làm lành vết thương ở chuột Swiss.
- Sau khi gây loét, 15 con chuột được chia ngẫu nhiên thành 3 nhóm, tiêm NaCl, tiêm 1×10 6 tế bào gốc đơn nhân từ mỡ và tiêm 1×10 6 tế bào gốc trung mô từ mỡ.
- Kết quả nghiên cứu cho thấy, nhóm chuột ghép tế bào làm lành vết thương nhanh hơn so với nhóm đối chứng, ở nhóm ghép ADSCs, vết thương làm lành nhanh nhất và lành hoàn toàn sau 9 ngày ghép.
- Kết luận, tế bào gốc từ mỡ có ý nghĩa quan trọng trong điều trị vết thương, đặc biệt là tế bào gốc trung mô từ mỡ có khả năng làm lành vết thương nhanh và không tạo sẹo..
- So sánh hiệu quả khả năng làm lành vết thương ở chuột Swiss bằng tế bào gốc trung mô từ mỡ và tế bào gốc đơn nhân từ mỡ.
- Tuỳ thuộc mức độ tổn thương nặng và sâu làm phá hủy hoàn toàn ba lớp cấu trúc mô học của da, các tế bào tự thân định vị ở vết thương không đủ khả năng tự làm lành và hồi phục cấu trúc da như cũ.
- Vì vậy, điều trị tổn thương da là một quá trình phức tạp đòi hỏi sự tham gia của nhiều yếu tố như các yếu tố tăng trưởng, các cytokine, chemokine cùng nhiều tế bào khác.
- Các nghiên cứu gần đây cho thấy tế bào gốc từ mỡ có nhiều tiềm năng lớn trong y học tái tạo bởi khả năng tổng hợp và giải phóng các yếu tố tăng trưởng, biệt hóa thành các dòng tế bào chuyên biệt trong quá trình tái tạo mô.
- Liệu pháp ghép tế bào gốc từ mô mỡ đã tiến hành và thành công ở nhiều nước trên thế giới (Gaur et al., 2017).
- Trong y học tái tạo hiện nay, tế bào gốc được sử dụng từ nhiều nguồn khác nhau như từ xương, cuống rốn,… và mang lại hiệu quả nhất định.
- Tuy nhiên, tùy theo từng bệnh mà sử dụng tế bào gốc điều trị từ những nguồn khác nhau sẽ mang lại hiệu quả điều trị khác nhau.
- Nghiên cứu này nhằm cung cấp một dữ liệu mới về cơ chế sửa chữa, tốc độ làm lành vết thương tế bào gốc từ mô mỡ, nhằm đưa ra một liệu pháp điều trị hiệu quả và an toàn..
- Xác định tỷ lệ sống chết của tế bào sau khi phân lập và tiến hành nuôi tế bào với mật độ 50.000 tế bào/cm 2 trong điều kiện ở 37 0 C, 5%CO 2 .
- Nuôi sơ cấp khi mật độ tế bào đạt 70 - 80% diện tích chai nuôi tiến hành nuôi thứ cấp và tạo cụm theo phương pháp của Penfornis (2016).
- Mật độ nuôi 100 tế bào/cm 2 , sau 7 - 10 ngày tiến hành nhuộm H&E (Hematocyline-Eosyn) quan sát số lượng và hình thái cụm CFU-F..
- 2.2.3 Xác định đặc tính tế bào.
- Lấy khoảng 1×10 5 tế bào MNADSCs và 1×10 5 tế bào ADSCs rửa sạch bằng PBS và lần lượt cho vào hai eppendorf, sau đó ủ với kháng thể huỳnh quang với các marker CD34-PE, CD90-FITC và CD146-PC5 ở nhiệt độ phòng trong 30 phút.
- Các tế bào lấy ra rửa lại hai lần với PBS, sau đó được phân tích fluorescence-activated cell sorting (FACS) (Penfornis, 2016) bằng máy Canto II..
- (2018), tiến hành nuôi thứ cấp lần thứ 3 với mật độ nuôi 2,5×10 5 tế bào ADSCs/ giếng trong 2 ngày, sau đó bổ sung chất cảm ứng vào môi trường nuôi và theo dõi.
- 2.2.5 Thử nghiệm làm lành vết loét bằng tế bào gốc từ mỡ.
- Tế bào MNADSCs sau khi được phân lập từ mỡ bụng, đánh giá chất lượng tế bào, tiến hành pha loãng với dung dịch NaCl 0,9% và tiêm vào tĩnh mạch đuôi của chuột.
- Tế bào ADSCs sau khi tách ra khỏi chai nuôi, tiến hành kiểm tra chất lượng tế bào, đếm số lượng và pha loãng với NaCl và tiến hành tiêm vào tĩnh mạch đuôi chuột..
- Sau 24 giờ nuôi cấy sơ cấp trong môi trường 0,5 mL DMEM/F12 + 10% FBS + 1% L-glutamine, các tế bào bắt đầu bám vào bề mặt chai nuôi.
- Trong 72 giờ nuôi, một lượng nhỏ tế bào trải trên bề mặt chai nuôi, có hình dạng hình thoi đặc trưng.
- Từ 5-7 ngày nuôi, tế bào hợp dòng, trải rộng và tăng sinh.
- Ngày thứ 10 - 15, mật độ tế bào đạt 70-80% diện tích chai nuôi.
- Kết quả nghiên cứu này cho thấy thời gian tế bào bám dính vào bề mặt chai nuôi và trải trên bề mặt chai nuôi phù hợp với nghiên cứu của Wang et al.
- Hình 1: Tế bào ADSCs được nuôi sơ cấp trong môi trường DMEM/F12 + 10% FBS + 1% L-glutamine A.
- Tế bào sau 24 giờ nuôi cấy.
- Tế bào sau 10 ngày nuôi cấy Mật độ nuôi sơ cấp đạt 70-80% diện tích chai.
- nuôi, tiến hành nuôi thứ cấp với mật độ nuôi 100 tế bào/cm 2 và kết quả thu được thể hiện qua Hình 2..
- Sau 24 giờ sau khi cấy chuyền, tế bào ADSCs bắt đầu bám dính và trải dạng hình thoi đặc trưng và.
- Từ 4 - 5 ngày, tế bào ADSCs hợp dòng, trải đều trên bề mặt chai nuôi và tiếp tục tăng sinh mạnh kết quả này tương đồng với nghiên cứu của Yin et al.
- Hình 2: Tế bào ADSCs nuôi thứ cấp trong môi trường DMEM/F12 + 10% FBS + 1% L-glutamine A.
- Tế bào khi vừa được cấy chuyền.
- Tế bào sau 24 giờ cấy chuyền.
- Tế bào sau 5 ngày cấy chuyền.
- Sau 3 - 5 ngày nuôi cấy thứ cấp, các tế bào ADSCs bắt đầu phân chia và hình thành những cụm nhỏ xung quanh tế bào mẹ ban đầu.
- các cụm CFU-F hình thành rõ với số lượng tế bào lớn hơn 50 tế bào/cụm và đường kính hơn 1 mm (Hình 3A).
- Cụm tế bào ADSCs ở vật kính 10×.
- Các cụm tế bào ADSCs nhuộm bằng Eosin Sau khi ủ với kháng thể đơn dòng đánh dấu.
- Hình 4: Đặc tính của tế bào.
- Ở ngày thứ 7 sau khi bổ sung chất cảm ứng biệt hóa, bắt đầu xuất hiện các tế bào mỡ nhỏ dần tích tụ trong tế bào chất.
- Các giọt mỡ nhỏ này dần dần góp thành giọt mỡ lớn và chiếm gần hết thể tích tế bào vào ngày thứ 21.
- Các tế bào mỡ được nhuộm.
- Điều này cho thấy các tế bào ADSCs đã được cảm ứng biệt hóa thành tế bào mỡ thành công..
- Hình 5: ADSCs biệt hóa thành tế bào mỡ.
- Tế bào ADSCs sau 7 ngày bổ sung chất cảm ứng.
- Tế bào mỡ sau 14 ngày bổ sung chất cảm ứng;.
- Tế bào mỡ sau 21 ngày bổ sung chất cảm ứng và nhuộm bằng Oil Red Môi trường nuôi bổ sung 0,2 mM ascorbic acid.
- 10 mM β-glycerophosphate + 0,1 μM dexamethasone biệt hóa ADSCs thành tế bào xương..
- Các tế bào ADSCs có dấu hiệu tích tụ ion calcium trong tế bào chất dưới tác động của các chất cảm ứng và kích thích biệt hóa.
- Sự tích tụ calcium nhiều dần theo thời gian, các tế bào chuyển từ hình dạng trải.
- Các tế bào xương nhuộm với thuốc nhuộm Alizarin Red, các ion calcium bắt màu đỏ với thuốc nhuộm (Hình 6).
- Kết quả biệt hóa tế bào ADSCs thành tế bào mỡ và tế bào xương của nhóm nghiên cứu chúng tôi giống với nhiều nghiên cứu trước đây (Araña et al., 2013;.
- Arnhold et al., 2015.
- Megaloikonomos et al., 2018)..
- Hình 6: ADSCs biệt hóa thành tế bào xương.
- Tế bào ADSCs sau 8 ngày bổ sung chất cảm ứng biệt hóa.
- Tế bào xương sau biệt hóa nhuộm với Alizarin Red.
- Chuột sau khi gây loét được tiêm tế bào MNADSCs và ADSC vào tĩnh mạch đuôi, theo dõi quá trình làm lành vết thương liên tục trong 13 ngày, kết quả thu được ở Hình 7..
- Ở ngày thứ 2 sau khi ghép, nhóm đối chứng không có sự thay đổi về hình thái vết thương.
- Ở hai nhóm ghép MNADSCs và ADSCs, vết thương đã khô, đóng vẩy và bắt đầu co lại..
- Ngày thứ 6 sau khi ghép, vết thương nhóm đối chứng bắt đầu khô và co lại, trong khi, ở cả hai nhóm ghép tế bào diện tích vết thương co lại hơn 50% diện tích ban đầu, vẩy chuẩn bị bong ra..
- Ngày thứ 9, vết thương nhóm đối chứng bắt đầu đóng vẩy.
- Ngày thứ 10, vết thương ở nhóm chuột tiêm MNADSCs lành hoàn toàn.
- Còn ở nhóm đối chứng vết thương lành hoàn toàn vào ngày thứ 13..
- Hình thái vết thương của chuột sau 13 ngày điều trị bằng tế bào gốc.
- Hình 7: Ảnh hưởng của MNADSCs và ADSCs lên quá trình làm lành vết thương ở chuột.
- Kết quả mô học cho thấy ở hai nhóm chuột ghép tế bào có cấu trúc mô học tốt hơn so với nhóm đối chứng, đặc biệt ở nhóm ghép ADSCs.
- Nhóm đối chứng, cấu trúc các tầng trung bì và thượng bì không đều, mô hạt lỏng lẻo so với bình thường, mạch máu và các tế bào fibroblast ít, nang lông hầu như không có so với nhóm ghép tế bào.
- Tuy nhiên, nhóm ghép ADSCs có tổ chức mô hạt ở tầng trung bì dày, chứa nhiều tế bào fibroblast và xuất hiện nhiều tế bào viêm, nang.
- Ở nhóm đối chứng, khả năng tạo mạch máu rất kém, trong khi nhóm tiêm tế bào khả năng tạo mạch máu tốt hơn, nhất là ở nhóm ghép ADSCs có số lượng mạch máu nhiều và có xu hướng tạo thành từng cụm và tăng dần từ tầng trung bì đến thượng bì..
- et al.
- Các giá trị được trình bày dưới dạng trung bình ± SEM Ngoài ra, còn theo dõi số AST và ALT, Creatinine và Urea để đánh giá chức năng gan, thận sau khi ghép tế bào (Bảng 2)..
- Các giá trị được trình bày dưới dạng trung bình ± SEM Trong nghiên cứu này, ghép tế bào gốc có nguồn gốc từ mỡ có hiệu quả trong việc chữa lành vết thương, ở nhóm ghép tế bào vào ngày thứ 2 sau khi ghép, vết thương đã khô và bắt đầu co lại.
- Sau 6 ngày ghép tế bào, ở nhóm ghép MNADSCs và ADSCs vết thương lành nhanh hơn so với nhóm đối chứng.
- Điều này cho thấy tế bào gốc có khả năng sửa chữa các mô bị hư hỏng, vì chúng có thể di chuyển đến các vùng bị thương để đáp ứng với tình trạng viêm, biệt hóa thành các dòng tế bào và ảnh hưởng đến vi môi trường thông qua.
- (2007) và Nuschke (2014) khi chứng minh rằng trong giai đoạn cuối của việc chữa lành vết thương, các tế bào gốc điều chỉnh sự hình thành vết sẹo thông qua tiết PGE 2 , điều chỉnh IL-10, IL-6 và giảm IL-8 và giảm sản xuất collagen..
- Dựa vào giải phẫu mô học, vết thương của nhóm ghép tế bào hồi phục nhanh hơn so với nhóm đối chứng.
- Sự biểu hiện các marker bề mặt ở nhóm ghép tế bào như CD146, CD90 là các marker quan trọng cho quá trình tăng lên các tổ chức mô hạt và các mạch máu, tuy nhiên các yếu tố này không xuất hiện ở nhóm đối chứng.
- Điều này có thể giải thích cho sự kích thích tái tạo mạch máu và các bó sợi fibroblast nhanh hơn ở nhóm ghép tế bào.
- Cammarota and Laukkanen (2016) cũng đưa ra giả thuyết về việc tế bào gốc có khả năng tăng tái tạo mạch và nguyên bào sợi.
- Trong quá trình tái tạo mạch máu, nhằm giữ sự ổn định trong việc tái tạo các mạch máu mới, các tế bào phải sử dụng các tế bào tiền thân biểu hiện CD146+ (Thomas et al., 2017).
- Các tế bào này có khuynh hướng tạo ra các tế bào nội mô giả, từ đó tăng cường tái tạo mạch máu, mạng lưới vi mạch và cung cấp các cytokine cần cho sự tiền tái tạo mạch (Rafii et al., 2003.
- Watt et al., 2010).
- Ngoài ra, ADSCs và MNADSCs có khả năng tăng tái biểu mô hóa và tái tạo vết thương một cách nhanh chóng có thể là do sự tăng biểu hiện marker CD90, một marker đặc trưng cho các tế bào keratinocyte ở biểu mô.
- Sự tăng tốc quá trình liền vết thương sử dụng các tế bào gốc từ mỡ tương ứng với các kết quả nghiên cứu trước đó của Rodrigez et al.
- Quan sát hình thái vết thương có thể thấy khả năng hồi phục vết thương ở nhóm ghép tế ADSCs tốt hơn so với nhóm ghép MNADSCs và nhóm đối chứng.
- Nhóm ghép ADSCs làm lành vết thương nhanh hơn ghép MNADSCs, từ kết quả này giả thiết có thể được đặt ra rằng khả năng phục hồi vết thương phụ thuộc vào dòng tế bào sử dụng.
- Các tế bào đơn nhân phân lập từ chuột vẫn còn nhiễm nhiều tế bào tạp do đó mức độ biểu hiện các marker cần thiết cho quá trình làm lành vết thương thấp như CD90, CD 146.
- do đó khả năng kích thích tăng sinh các tế bào keratinocyte, nguyên bào sợi và khả năng hình thành mạch máu không nhiều.
- Trong khi đó, ADSCs là quần thể các tế bào trung mô thuần, mức độ biểu hiện của cao của các marker CD90, CD146.
- nên thúc đẩy quá trình làm lành vết thương nhanh hơn so với nhóm ghép MNADSCs..
- (2018), các tế bào ADSCs có biểu hiện cao các marker CD29, CD44, CD90 và CD45 với tỷ lệ lần lượt là Jia et al., 2018).
- Do đó, với một quần thể thuần ADSCs, khả năng kích thích các nhân tố tăng trưởng và cytokine như nhân tố sinh trưởng nội mạch (VEGF), TGF-β, PDGF (Song et al., 2011), nhân tố tăng trưởng tế bào sừng và nguyên bào sợi, từ đó kích thích sự tăng sinh và.
- 2012) làm lành vết thương nhanh hơn so với MNADSCs (chứa tế bào tạp).
- Nhóm chuột ghép tế bào gốc ADSCs và MNADSCs làm lành vết thương nhanh hơn so với nhóm đối chứng