- cây Dó Bầu ( Aquilaria SP.) tại Hà Tĩnh. - Tổng quan về cây dó bầu. - phương pháp sử dụng trong việc định danh loài và xác định quan hệ di truyền. - tình hình nghiên cứu DNA barcode ở thực vật. - Tìm hiểu một số kết quả trong nghiên cứu về cây dó bầu tại Việt Nam và trên thế giới, Nghiên cứu thu thập 18 mẫu lá các cây dó dầu tại Hà Tĩnh, Phú Quốc và tại Lào, tách chiết tinh sạch DNA. - Sử dụng phương pháp PCR để nhân bản đoạn gen quan tâm với mồi đặc hiệu. - Tách dòng đoạn gen và xác định trình tự gen. - Đưa ra kết quả và thảo luận: kết quả tách chiết và tinh sạch DNA tổng số. - kết quả tách dòng gen. - xác định và phân tích trình tự nucleotide của các đoạn DNA chỉ thị.. - Cây dó bầu (Aquilaria sp) là một trong những loài thực vật đặc hữu của nước ta, cây dó bầu mang lại giá trị kinh tế rất lớn với mục đích chủ yếu là khai thác trầm hương, một mặt hàng có giá trị kinh tế cao sử dụng trong công nghiệp mỹ phẩm, trong dược liệu, trong tôn giáo, chế tác đồ thủ công mỹ nghệ.. - Tuy nhiên, hiện nay các loài dó bầu ở Việt Nam bị lai tạp rất nhiều, công tác lựa chọn giống đưa vào trồng dựa chủ yếu vào quan sát hình thái, theo kinh nghiệm của mỗi cá nhân,. - Việc xác định loài bằng DNA chỉ thị có hiệu quả cao trong việc phân biệt các loài thực vật trong đó có dó bầu ở Việt Nam khi những quan sát hình thái, sinh trưởng và phát triển chưa đủ cơ sở để định danh hoặc phân biệt loài.. - Vật liệu và phương pháp nghiên cứu. - Gồm 18 mẫu lá cây dó bầu được thu thập tại Hà Tĩnh, Phú Quốc và tại Lào. - Các bước nghiên cứu:. - Thu thập mẫu lá ở các cây dó bầu. - Tách chiết tinh sạch DNA tổng số từ 18 mẫu dó bầu. - Sử dụng phương pháp PCR để nhân bản đoạn gen quan tâm với mồi đặc hiệu - Tách dòng đoạn gen quan tâm. - Xác định trình tự gen và phân tích kết quả 3. - Kết quả và thảo luận. - Kết quả tách chiết và tinh sạch DNA. - Các mẫu dó bầu sau khi thu thập được tiến hành ách triết DNA theo phương pháp CTAB. - Kết quả điện di DNA tổng số của một số mẫu dó bầu nghiên cứu. - Kết quả sau khi điện di trên gel agarose 0,8% và nhuộm bằng Ethidium bromide (hình 1) cho thấy DNA thu được sau khi tách có chất lượng tốt, DNA không bị đứt gẫy, các băng vạch đều sáng rõ.. - Bốn cặp mồi chúng tôi tiến hành nghiên cứu được thiết kế dựa theo Vijayan và Tsou (2010). - Chúng tôi tiến hành thử nghiệm nhiệt độ gắn mồi của 4 cặp mồi và kiểm tra kích thước nhân bản thực tế của 4 gen này với 18 mẫu dó bầu. - Sau quá trình thử nghiệm với các dải nhiệt độ gắn mồi khác nhau, đã xác định được nhiệt độ gắn mồi đặc hiệu cho 4 cặp mồi nghiên cứu và kích thức nhân bản của 4 gen này so với dự đoán ban đầu có sự thay đổi thể hiện trên bảng 1.. - Bảng 1 Nhiệt độ bắt mồi và kích thước gen của các cặp mồi nghiên cứu STT Vùng gen. - Kích thước đoạn gen nhân bản. - Kết quả nhân bản gen với các cặp mồi nghiên cứu. - Sau khi tối ưu được nhiệt độ gắn mồi đặc hiệu chúng tôi đã tiến hành nhân bản bằng phản ứng PCR với 4 cặp mồi nghiên cứu. - Kết quả cho thấy 18 mẫu dó bầu nhân bản tốt với 4 cặp mồi nghiên cứu.. - Kết quả PCR gen ITS Hình 3. - Kết quả PCR gen rpoB Hình 5. - Kết quả PCR gen rbcL 3.4. - Kết quả tách dòng gen. - 3.4.1 Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR (thôi gel). - Sản phẩm PCR thu được sau phản ứng khuếch đại gen có các tạp chất như mồi, đệm PCR, các nucleotide,...còn dư, và đôi khi có thể chứa các sản phẩm phụ sẽ ảnh hưởng đến kết quả của quá trình tách dòng, do vậy cần tiến hành tinh sạch sản phẩm PCR trước khi tiến hành quá trình đưa gen vào vector tách dòng.. - Các đoạn gen sau khi tinh sạch được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0.8% để kiểm tra chất lượng và xác định sơ bộ hàm lượng DNA tinh sạch, kết quả thể hiện ở hình 6.. - Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR gen rpoB. - AL2,AL6,AL8,G1,Qx,M1, PQ64, T, T2,T3, T4, T6,T7,T8,T9,T10,T11,T14 : Các mẫu dó bầu nghiên cứu. - Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm tinh sạch ở hình 6 cho thấy chỉ có một băng vạch có kích thước tương ứng với đoạn gen được nhân lên bằng mồi barcode tương ứng. - Tương tự với các sản phẩm PCR của các gen còn lại cũng đã được tiến hành tinh sạch và cho kết quả tốt tương tự gen rpoB.. - Kết quả chuyển gen vào vector tách dòng. - Kết quả biến nạp DNA plasmid vào tế bào khả biến E. - Kết quả của quá trình này sẽ là sự xuất hiện của những khuẩn lạc xanh và trắng, trong đó khuẩn lạc trắng là những khuẩn lạc chúng ta quan tâm.. - Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến. - Hình 7 cho thấy kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến có kết quả tốt, trên đĩa nuôi cấy xuất hiện những khuẩn lạc xanh và trắng mật độ và số lượng tương đối lớn đủ để qúa trình chọn lọn khuẩn lạc diễn ra dễ dàng.. - 3.4.4 Kết quả chọn lọc dòng tế bào mang gen tái tổ hợp. - Để xác định chính xác khuẩn lạc nào mang vector gắn đoạn DNA quan tâm chúng tôi tiến hành phản ứng colony - PCR. - Kết quả điện di sản phẩm PCR - clony khuẩn lạc mồi rbcL. - khoảng 200 bp, còn với plasmid tái tổ hợp còn các plasmid tái tổ hợp nhận được đoạn gen sẽ có kích thước bằng kích thước gen cộng thêm 200 bp.. - Mồi rbcL nhân lên đoạn gen barcodes có kích thước vào khoảng 750 bp, kết quả điện di trên hình 3.8 xuất hiện các băng vạch duy nhất có kích thước vào khoảng hơn 900 bp. - Kết quả tách chiết plasmid tái tổ hợp. - Kết quả điện di plasmid tách chiết. - Qua kết quả điện di plasmid hình 9 ta thấy các plasmid tái tổ hợp đều có 3 băng rõ nét không bị đứt gẫy. - Kết quả cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợp. - Các plasmid sau khi tách chiết cần tiến hành cắt kiểm tra plasmid bằng enzyme giới hạn BamHI để khẳng định plasmid có mang đoạn gen quan tâm hay không. - Kết quả điện di sản phẩm cắt bằng enzyme BamHI mồi rbcL.. - T1, T2, T3, T4, T6, T7, T8 : Các sản phẩm cắt của các plasmid được tách dòng đoạn gen rbcL. - Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmid bằng BamHI ở các mẫu(T1,T2, T3, T4, T6, T7, T8)từ các plasmid được tách dòng đoạn gen rbcL cho thấy các mẫu plasmid đều phân thành hai băng trong đó có băng DNA kích thước 750 bp quan tâm. - Với các mẫu còn lại của mồi rbcL và 3 mồi còn lại chúng tôi cũng thu được kết quả tương tự.. - Xác định và phân tích trình tự nucleotide của các đoạn DNA chỉ thị. - Các đoạn DNA sau khi được tách dòng thành công sẽ được gửi đọc trình tự tại công ty Macrogen (Công ty tham gia vào dự án giải trình tự bộ gen người). - Trình tự được xác định trên máy đọc trình tự tự động theo nguyên lý của Sanger. - Sau khi xử lý trình tự bằng phần mềm Bioedit và đối chiếu với những thông tin trên ngân hàng GenBank, chúng tôi đã tiến hành phân tích kết quả với cả 4 mồi nghiên cứu kết quả thu được như sau. - Kết quả xác định và phân tích trình tự gen trn-psbA. - Trình tự đoạn gen phân tích được có kích thước 440 bp đúng so với kích thước dự đoán là 450 bp trong đó có một số những sai khác ở các vị trí của 18 mẫu dó bầu nghiên cứu tuy nhiên những sai khác này là chưa đủ để xác định phân loại giữa các mẫu nghiên cứu.. - Phân tích trình tự đoạn gen trnH-psbA cho thấy độ tương đồng khi so sánh 18 mẫu Dó bầu nghiên cứu và trình tự A.sinensis đã được đăng trên ngân hàng GenBank có độ tương đồng rất cao (99,1-100. - Điều này cho thấy hệ gen lục lạp ở dó bầu có tính bảo thủ rất cao giữa các cá thể ở các khu vực cách xa nhau về mặt địa lý (Hà Tĩnh, Phú Quốc, Lào). - Kết quả xác định và phân tích trình tự gen rpoB. - Trình tự đoạn gen phân tích được có kích thước 510 bp trong đó có một số vị trí sai khác giữa 18 mẫu nghiên cứu, tuy nhiên những sai khác này là những sai khác điểm nhỏ lẻ có thể bắt nguồn từ sự sai khác trong quá trình PCR vì emzym Taq polymerase không có hoạt tính sửa chữa trong quá trình PCR. - Phân tích trình tự đoạn gen rpoB cho thấy độ tương đồng khi so sánh 18 mẫu dó bầu nghiên cứu và trình tự A.sinensis đã được đăng trên ngân hàng GenBank có độ tương đồng rất cao . - Kết quả xác định và phân tích trình tự vùng gen lục lạp rbcL. - Đoạn gen phân tích được có kích thước 734 bp phù hợp với kích thước ban đầu, trong kết quả phân tích trình tự thấy xuất hiện những vị trí sai khác của 18 mẫu dó bầu nghiên cứu đặc biệt ở vị trí 43 có sự thay đổi nucleotit A bằng G của với 6 mẫu Dó bầu nghiên cứu là AL2, AL6, AL8, M1, Qx, PQ64 so với 12 loài dó bầu còn lại. - đầu phân biệt 18 cá thể dó bầu mà chúng ta nghiên cứu dù hệ số tương đồng của 18 mẫu vẫn rất cao . - Kết quả xác định và phân tích trình tự gen ITS. - Kết quả phân tích trình tự cho thấy gen ITS có kích thước 655 bp, hệ số tương đồng di truyền giữa các mẫu vẫn cao tuy nhiên trong trình tự xác định được xuất hiện nhiều sai khác có giá trị có thể sử dụng để phân loại đặc biệt là ở các vị trí . - Với những sai khác ở những vị trí trên đã bổ xung thêm cơ sở để xác định phân loại 18 mẫu dó bầu nghiên cứu.. - Các vị trí sai khác dùng để phân loại của đoạn gen vùng ITS. - Cây phân loại giữa trên kết quả mồi ITS. - Nhìn trên cây phân loại ta nhận thấy 18 mẫu dó bầu nghiên cứu có thể chia thành 2 nhóm lớn, với chỉ số bootstrap 80,5. - malacensis), tuy nhiên trình tự hai loại này chưa được nghiên cứu. - Trình tự đoạn ITS của các mẫu T6, T7, T8, T9, T10, T11, các mẫu M1, QX, PQ64, G1 thu thập tại Phú Quốc và 3 mẫu thu thập ở Lào không có khác biệt tin cậy (25-47%) so với trình tự này của các loài A crassna và A. - Từ kết quả phân tích chúng tôi nhận thấy rằng mối tương quan di truyền giữa 18 mẫu dó bầu được nghiên cứu là tương đối cao, Chỉ số tương đồng di truyền khoảng . - Các mẫu dó bầu có mức độ đa dạng di truyền thấp, tính bảo thủ cao điều này đã được chứng minh rõ ràng khi chúng tôi tiến hành nghiên cứu một số chỉ thị đối với hệ gen lục lạp như trên.. - Đã tách chiết và tinh sạch được DNA tổng số của 18 mẫu dó bầu trong đó có 3 loài của Lào, 4 mẫu thu tại Phú Quốc và 11 mẫu thu tại Hà Tĩnh.. - Đã nhân bản thành công các đoạn gen trnH-psbA, rbcL, rpoB, ITS bằng phương pháp PCR từ DNA tổng số của 18 mẫu dó bầu.. - Đã xác định được trình tự nucleotide của 4 đoạn gen trnH-psbA, rbcL, rpoB, trnL của 18 mẫu dó bầu.. - Tiếp tục sử dụng phương pháp DNA bacode trong phân loại và xác định loài ở Việt Nam.. - Sử dụng gen rbcL và ITS vào việc xác định các loài dó bầu ở Việt Nam đồng thời tiến hành nghiên cứu với các mồi barcode khác để tìm ra các dấu hiệu xác định loài khác nhằm phân loại một cách chính xác và cụ thể hơn.. - Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn (2002), Báo cáo tổng kết đề tài: “Nghiên cứu xác định phương pháp tạo trầm bằng tác nhân vi sinh trên cây dó bầu Aquilaria crassna”, Nha Trang.. - Danh lục các loài thực vật Việt Nam, tập II, Viện sinh thái và tài nguyên sinh vật, Trung tâm nghiên cứu tài nguyên môi trường, NXB Nông nghiệp.. - Bùi Công Khánh (2007), Bước đầu tìm hiểu các chất tạo trầm nhân tạo trên cây dó bầu Aquilaria crassnatại Việt Nam, Nha Trang.. - Đào Sỹ Sành, Nguyễn Huy Sơn, Cao Văn, “Báo cáo kết quả ánh giá sơ bộ về tiềm năng sản xuất bột giấy của cây dó bầu”, Trung tâm nghiên cứu Lâm đặc sản, Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam, Viện Công nghiệp giấy và Cenlulose.. - Biomedical and Life Science , 83(2), pp.217-221.. - (2000), “A phylogenetic analysis of Laeliinae (Orchidaceae) based on sequence data from nuclear internal transcribed spacers (ITS) of ribosomal DNA”, Lindleyana (15), pp.96114.. - from non-invasive relatives”, Molecular Ecology Resources (9), pp.1086-1091.. - (2010) “DNA barcoding of the Lemnaceae, a family of aquatic monocots”, BMC Plant Biology (10), pp.205.. - (2010), “Use of ITS2 region as theuniversal DNA barcode for plants and animals”, PLoS ONE (5), pp.13102.