- SỰ LƯU HÀNH VÀ BIẾN ĐỔI DI TRUYỀN CỦA VIRUS CÚM GIA CẦM TYPE A H5N1 TRÊN GIA CẦM TẠI MỘT SỐ TỈNH ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG Tiền Ngọc Tiên, Quách Thúy Lan, Nguyễn Khoa và Lý Thị Liên Khai. - Circulation and genetic variation of type a H5N1 avian influenza virus on poultry in some provinces in the Mekong Delta Từ khóa:. - Cúm gia cầm, Gà , Type A H5N1, Việt Nam, Vịt Keywords:. - The present study on the circulation and genetic variation of type A H5N1 avian influenza virus in Hau Giang, Soc Trang, Tra Vinh and Vinh Long provinces has been conducted by sampling swabs on poultry (healthy chicken and duck) trading at live bird market or slaughterhouses. - The swab samples were tested using Real time RT-PCR technique to identify type A H5N1 avian influenza virus and to define the rate of prevalence and further implement HA gene sequencing for determination of genetic variation and clade. - The strains of type A H5N1 avian influenza virus circulating in the provinces of Hau Giang, Soc Trang, Tra Vinh and Vinh Long belong to virus clade of 2.3.2.1c.. - Cúm gia cầm là bệnh truyền nhiễm cấp tính của loài gia cầm do virus cúm thuộc họ Orthomyxoviridae gây ra. - Trong nghiên cứu sự lưu hành và biến đổi di truyền của virus cúm gia cầm type A H5N1 tại các tỉnh Hậu Giang, Sóc Trăng, Trà Vinh và Vĩnh Long đã tiến hành lấy mẫu dịch hầu họng (swab) trên gà, vịt khỏe bán tại các chợ va ̀ các lò giết mổ. - Các mẫu dịch hầu họng được xét nghiệm bằng kỹ thuật Real time RT- PCR để định danh virus cúm gia cầm type A H5N1 nhằm xác định tỷ lệ lưu hành. - Kết quả cho thấy, tỷ lệ lưu hành của virus cúm gia cầm type A H5N1 trên gia cầm tại bốn tỉnh vùng Đồng bằng sông Cửu Long (Hậu Giang, Sóc Trăng, Trà Vinh, Vĩnh Long) là 6,5%, tỷ lệ lưu hành trên vịt là 9,7% và trên gà là 4%. - Bên cạnh đó, kết quả khảo sát sự biến đổi di truyền cho thấy, tỷ lệ nucleotide của các chủng virus cúm gia cầm type A H5N1 lưu hành tại các địa phương sai khác so với chủng virus tham chiếu A/Hong Kong/6841/2010 từ 2,3-3,2%. - Các chủng virus cúm gia cầm type A H5N1 lưu hành tại các tỉnh Hậu Giang, Sóc Trăng, Trà Vinh và Vĩnh Long thuộc clade 2.3.2.1c Trích dẫn: Tiền Ngọc Tiên, Quách Thúy Lan, Nguyễn Khoa và Lý Thị Liên Khai, 2016. - Sự lưu hành và biến. - đổi di truyền của virus cúm gia cầm Type A H5N1 trên gia cầm tại một số tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long. - Cúm gia cầm (Avian Influenza) là bệnh truyền nhiễm cấp tính của nhiều loài gia cầm, do virus cúm A thuộc họ Orthomyxoviridae gây ra. - Virus cúm được phân làm hai loại là có độc lực cao HPAI (High Pathogenic Avian Influenza) và loại có độc lực thấp LPAI (Low Pathogenic Avian Influenza). - Sự phân loại này dựa trên cơ sở khả năng của virus gây bệnh cho gia cầm (OIE, 2015).. - Năm 2015, các ổ dịch cúm gia cầm H5N1 đã xuất hiện tại 18 xã, phường của 17 huyện, thị xã thuộc 11 tỉnh, thành phố (Cà Mau, Trà Vinh, Vĩnh Long, Sóc Trăng, thành phố Cần Thơ, Đắk Lắk, Hà Tỉnh, Kom Tum, Nghệ An, Ninh Thuận, Thanh Hóa). - Số gia cầm mắc bệnh là 14.138 con, số gia cầm bị tiêu hủy là hơn 16.128 con (Cục Thú y, 2015).. - Bên cạnh đó, theo Cục Thú y kết quả giám sát sự lưu hành của virus cúm gia cầm type A H5N1 của năm 2014 cho thấy có sự lưu hành virus cúm gia cầm type A H5N1 trên vịt buôn bán tại các chợ với tỷ lệ lưu hành là 4,13%. - clade virus cúm gia cầm type A H5N1 đang lưu hành và gây bệnh tại Đồng bằng sông Cửu Long là clade 1.1 và 2.3.2.1c (Cục Thú y, 2014).. - Đồng bằng Sông Cửu Long có ngành chăn nuôi gia cầm phát triển, đặc biệt là vịt được chăn nuôi phổ biến theo phương thức cha ̣y đồng, nên khả năng làm lây lan bệnh cúm gia cầm type A H5N1 từ các đàn vịt sang các quần thể gia cầm khác là rất cao. - Vì vậy, việc xác định được tỷ lệ lưu hành của virus cúm gia cầm type A H5N1 trên gia cầm có ý nghĩa rất quan trọng trong công tác dự báo nguy cơ xảy ra bệnh cúm gia cầm. - Xuất phát từ những thực tế trên chúng tôi tiến hành nghiên cứu “Sự lưu hành và biến đổi di truyền của virus cúm gia cầm type A H5N1 trên gia cầm tại một số tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long” nhằm xác định được tỷ lệ lưu hành và biến đổi di truyền của virus cúm gia cầm type A H5N1 đang lưu hành trên gia cầm tại các địa phương thuô ̣c Đồng bằng sông Cửu Long.. - họng của 5 con gia cầm (cùng loài) thành 1 mẫu xét nghiệm và cho vào dung dịch bảo quản mẫu.. - Trình tự nucleotide của các chủng virus cúm gia cầm type A H5N1 tham chiếu A/Hong Kong/6841/2010/H5N1 (clade 2.3.2.1c;. - 2.2 Xác định virus cúm gia cầm type A H5N1 bằng kỹ thuật Real time RT-PCR (Cục Thú y, 2014). - Quy trình, nguyên liệu, cặp mồi và đoạn dò xét nghiệm virus cúm gia cầm type A H5N1 thực hiện theo hướng dẫn của Cục Thú y.. - Mẫu swab vận chuyển về phòng thí nghiệm được lắc đều và loại bỏ các que tăm bông sau đó ly tâm ở 3.500g/10 phút, thu phần dịch nổi ở trên tiến hành chiết xuất RNA (quy trình chiết xuất theo hướng dẫn của nhà sản xuất, sử dụng bộ kit MagMAX 96 AI/ND RNA Isolation kit – Mỹ và bộ kit Taco – Đài Loan), thực hiện xét nghiệm bằng kỹ thuật Real time RT-PCR để phát hiện virus cúm gia cầm type A subtype H5N1.. - Hình 1: Các đường chuẩn biểu diễn số lượng đơn vị huỳnh quang của kỹ thuật rRT-PCR (1): mẫu dương tính mạnh, (2): mẫu dương tính yếu, (3): mẫu nghi ngờ, (4): mẫu âm tính Xác định biến đổi di truyền và nhánh virus cúm. - gia cầm type A H5N1 lưu hành bằng kỹ thuật giải trình tự và phân tích trình gene HA.. - Để giải trình tự đoạn gene HA của virus cúm gia cầm type A H5N1, chúng tôi sử dụng hai cặp primer đặc hiệu để thực hiện khuếch đại bằng phương pháp RT-PCR. - Các chuỗi trình tự đoạn gene HA của virus cúm gia cầm type A H5N1 được xử lý và phân tích bằng phần mềm Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA 6.0. - 3.1 Kết quả khảo sát sự lưu hành của virus cúm gia cầm type A H5N1 trên gia cầm. - Bảng 1: Tỷ lệ lưu hành của virus cúm gia cầm type A H5N1 trên gia cầm. - SMDT: Số mẫu dương tính Bảng trên cho thấy tỷ lệ lưu hành của virus cúm gia cầm type A H5N1 trên gia cầm tại các tỉnh Hậu Giang, Sóc Trăng và Trà Vinh là tương tự nhau (4,8. - Điều này có thể là do dịch bệnh cúm gia cầm type A H5N1 đã trở thành dịch địa phương (xảy ra hằng năm từ năm 2003 đến nay) tại các tỉnh vùng Đồng bằng sông Cửu Long nên virus cúm type A H5N1 lưu hành rộng rãi trong quần thể gia cầm tại các địa phương. - Tỷ lệ lưu hành tại các địa phương nằm trong khoảng từ là thông tin cảnh báo khả năng gây ra các ổ dịch cúm gia cầm type A H5N1 nhưng khả năng này không cao do tất cả các địa phương khảo sát trong nghiên cứu này đang triển khai chương trình tiêm phòng vaccine phòng bệnh cúm cho gia cầm.. - Bên cạnh đó, theo FAO (2011) Đồng bằng sông Cửu Long là vùng lây truyền virus cúm gia cầm H5N1 nội vùng. - Khi có một chủng virus cúm H5N1 lưu hành trong một quần thể gia cầm, những đàn nhiễm virus cúm gia cầm nhưng không có biểu hiện lâm sàng nhưng lây truyền virus cúm gia cầm sang cho các đàn gia cầm cảm nhiễm khác. - Vào thời điểm đầu năm 2014, tại các tỉnh vùng Đồng bằng sông Cửu Long đã có sự xâm nhập của nhánh virus cúm gia cầm type A H5N1 (2.3.2.1c) lưu hành và gây bệnh trên gia cầm song song với nhánh virus 1.1 đã xâm nhập từ năm 2003 (Cục Thú y, 2014). - Do vậy, khi khảo sát sự lưu hành sẽ phát hiện sự hiện diện của virus cúm gia cầm type A H5N1 tại hầu hết các địa phương.. - Tỷ lệ lưu hành của virus cúm gia cầm type A H5N1 tại Sóc Trăng trong nghiên cứu này là 4,8%. - Bên cạnh đó, tỷ lệ lưu hành tại các tỉnh Hậu Giang, Sóc Trăng và Trà Vinh là 4,8% cao hơn nhưng không nhiều so với tỷ lệ lưu hành của virus cúm gia cầm type A H5N1 của cả nước năm 2014 có tỷ lệ lưu hành là 4,13% (Cục Thú y, 2014).. - Tỷ lệ lưu hành của virus cúm gia cầm type A H5N1 trên vịt tại 4 tỉnh thuộc vùng Đồng bằng sông Cửu Long khá cao (9,7. - virus cúm gia cầm type A H5N1 và có thể truyền lây virus cho các đàn gia cầm khác khi tiếp xúc trực tiếp với chúng. - Các tỉnh vùng Đồng bằng sông Cửu Long có tổng đàn vịt lớn hơn gà và nuôi trong tất cả các tháng của năm nên virus cúm gia cầm type A H5N1 có thể lưu hành tại đây trong khoảng thời gian rất dài. - Đồng thời, phương thức chăn nuôi vịt chạy đồng tại Đồng bằng sông Cửu Long tạo điều kiện cho sự lây truyền virus cúm gia cầm type A H5N1 giữa các đàn vịt và các đàn gia cầm khác diễn ra dễ dàng.. - Để duy trì được sự lưu hành của virus cúm gia cầm type A H5N1 trong thời gian dài trên quần thể gia cầm thì cần thiết phải có một số yếu tố như: các đàn vịt hơn 4 tháng tuổi, các đàn gà đẻ không được tiêm phòng đúng cách hoặc có hệ miễn dịch yếu (do bệnh, kích thích, vận chuyển hay dinh dưỡng kém), chuỗi thị trường (những chợ gia cầm đầu mối, bãi tập kết, lò mổ, thương lái) (FAO, 2011. - Các tỉnh thuộc vùng Đồng bằng sông Cửu Long có đầy đủ các yếu tố như nhận định trên đã tạo điều kiện thuận lợi cho virus cúm gia cầm type A H5N1 lưu hành trên đàn gia cầm (đặc biệt là các đàn vịt) tại nhiều địa phương và được duy trì trong khoảng thời gian dài. - Tỷ lệ lưu hành của virus cúm gia cầm type A H5N1 trên gà tại 4 tỉnh thuộc vùng Đồng bằng sông Cửu Long là 4 % và vịt là 9,7%. - Trong khi đó, sự lưu hành của virus cúm type A H5N1 trên gà tại tỉnh Sóc Trăng là không phát hiện được. - Tỷ lệ lưu hành của virus cúm gia cầm type A H5N1 tại Hậu Giang (4. - Trà Vinh (4%) và Vĩnh Long (8%) cao hơn so với kết quả nghiên cứu của Lưu Hữu Mãnh (2009) là không có sự lưu hành của virus cúm gia cầm type A H5N1 trên gà vào năm 2008 tại Hậu Giang và An Giang.. - Phạm vi lưu hành của virus cúm H5N1 trên gà là 3/4 tỉnh, trong khi đó trên vịt là 4/4 tỉnh khảo sát.. - (2005), các kết quả nghiên cứu của hai nhóm tác giả này cho thấy vịt là loài mang trùng virus cúm gia cầm type A H5N1 trong thời gian dài.. - Trong các loài gia cầm thì gà và gà tây là loài cảm nhiễm nhất và có các biểu hiện triệu chứng lâm sàng của bệnh khi bị nhiễm virus cúm gia cầm type A H5N1. - Vì vậy, gà không thể mang trùng virus cúm gia cầm type H5N1. - Tuy nhiên, khảo sát của chúng tôi cũng đã phát hiện được sự lưu hành của virus cúm gia cầm H5N1 trên gà tại một số tỉnh, kết quả này có thể là do gà bị nhiễm virus cúm H5N1 từ vịt. - buôn bán gia cầm tại các chợ và các lò mổ gia cầm đã cho thấy gà, vịt được vận chuyển đến các chợ, lò giết mổ trong cùng một dụng cụ và được bày bán chung trên cùng một kệ được xếp chồng lên nhau hoặc xếp xen kẻ nhau với cự ly rất gần hoặc trong khu nuôi nhốt chờ giết mổ của các lò mổ.. - 3.2 Kết quả khảo sát sự lưu hành của virus cúm gia cầm type A H5N1 trên gia cầm theo địa điểm lấy mẫu. - Trong 12 địa điểm lấy mẫu giám sát sự lưu hành của virus cúm gia cầm type A H5N1 thì 9 địa điểm đã có sự lưu hành của virus chiếm tỷ lệ 75%.. - Trong đó, tỉnh Vĩnh Long có tỷ lệ lưu hành của virus cúm gia cầm H5N1 tại các địa điểm lấy mẫu cao nhất (100. - Bên cạnh đó, các tỉnh còn lại là Hậu Giang, Sóc Trăng và Trà Vinh có 2/3 địa điểm có sự hiện diện của virus cúm gia cầm type A H5N1.. - Bảng 2: Tỷ lệ lưu hành của virus cúm gia cầm type A H5N1 theo địa điểm lấy mẫu. - Tuy nhiên, với kết quả trên có thể nhận định rằng, virus cúm gia cầm H5N1 lưu hành trên phạm vi khá rộng tại các địa phương vì theo các thông tin thu thập được trong khi lấy mẫu (phiếu thông tin thu thập mẫu swab gia cầm) cho thấy gia cầm bán tại các chợ hoặc trong các lò giết mổ không những có nguồn gốc tại địa phương mà còn có nguồn gốc từ một số huyện hoặc tỉnh lân cận.. - 3.3 Kết quả giải trình tự gene HA và sự biến đổi di truyền của virus cúm type A H5N1 lưu hành trên gia cầm. - Trong tổng số 11 mẫu có kết quả dương tính với virus cúm gia cầm type A H5N1 tiến hành chọn một số mẫu đạt yêu cầu xét nghiệm để thực hiện giải trình tự gene HA. - Bảng 3: Số vị trí sai khác thành phần nucleotide (phía trên đường chéo) và acid amin (phía dưới đường chéo) so sánh giữa các chủng virus cúm type A H5N1 phân lập được trong nghiên cứu.. - Số lượng acid amin sai khác giữa các chủng virus cúm type A. - NC Số lượng nucleotide sai khác giữa các chủng virus cúm type A H5N1. - Bảng 4: Một số vị trí sai khác của các nucleotide so sánh giữa 7 gene HA của virus cúm gia cầm type A H5N1 trong nghiên cứu. - Bảng 5: Sự biến đổi di truyền (nucleotide) của các chủng virus cúm gia cầm type A H5N1 trong. - Tỉnh Ký hiệu Loài gia cầm Tổng số. - Kết quả so sánh với chủng virus cúm gia cầm type A H5N1 tham chiếu A/Hong Kong/6841/2010 Kết quả đã giải trình tự được 7 gene HA của virus cúm gia cầm type A H5N1 lưu hành trên gà và vịt (3 virus lưu hành trên gà và 4 virus lưu hành trên vịt). - khẳng định đã giải mã thành công trình tự nucleotide của gene HA của virus gia cầm type A H5N1. - Kết quả này cũng tương tự như kết quả nghiên cứu giải trình tự nucleotide gene HA của virus gia cầm type A H5N1 của các tác giả Trịnh Quang Vui và Lê Thanh Hòa (2008) và Lê Thanh Hòa và ctv. - Bảng 6: Số lượng nucleotide sai khác so với chủng virus cúm gia cầm type A H5N1 tham chiếu A/Hong Kong/6841/2010. - Tỉnh Ký hiệu Loài gia cầm Nucleotide sai khác Hậu Giang A/Chick/HG/210/2015 Gà T*↔G (2), A*↔G (28). - Nucleotide của chủng virus cúm gia cầm type A H5N1 tham chiếu A/Hong Kong/6841/2010. - Bên cạnh đó, kết quả phân tích trình tự các acid amin của tất cả các protein HA thu nhận được trong nghiên cứu cho thấy, đoạn nối giữa HA1 và HA2 (cleavage site) có trình tự là Q-ERRRKR-G tương đồng với trình tự của chủng virus cúm gia cầm type A H5N1 độc lực cao tham chiếu A/Hong Kong/6841/2010. - Kết quả xác định clade virus cúm type A H5N1 lưu hành trên gia cầm. - Để xác định clade virus cúm gia cầm type A H5N1, phần mềm MEGA 6.0 đã được sử dụng để phân tích. - Việc phân tích trình tự gene HA và vẽ cây phả hệ của các chủng virus cúm gia cầm type A H5N1 bằng phần mềm MEGA 6.0 (Tamura et al., 2013) đã xác định được tất cả các chủng virus đã giải trình tự đều thuộc clade virus 2.3.2.1c.. - Hình 2: Cây phả hệ các chủng virus cúm gia cầm type A H5N1. - Các chủng virus cúm gia cầm type A H5N1 lưu hành tại các tỉnh Hậu Giang, Sóc Trăng, Trà Vinh và Vĩnh Long nằm cùng phân nhánh với chủng virus A/Hong Kong clade 2.3.2.1c).. - Các chủng virus lưu hành tại Hậu Giang (A/Chick/HG/210/2015) và Sóc Trăng (A/Duck/ST/259/2015) thuộc cùng một phân nhóm.. - Sau khi thực hiện nghiên cứu sự lưu hành và biến đổi di truyền của virus cúm gia cầm type A H5N1 trên gia cầm tại một số tỉnh vùng Đồng bằng sông Cửu Long chúng tôi có một số kết luận như sau:. - Tỷ lệ lưu hành trung bình của virus cúm gia cầm type A H5N1 trên gia cầm tại một số tỉnh vùng Đồng bằng sông Cửu Long (Hậu Giang, Sóc Trăng, Trà Vinh, Vĩnh Long) năm 2015 là 6,5%.. - Virus cúm gia cầm type A H5N1 lưu hành trên gà chiếm tỷ lệ 4% thấp hơn trên vịt và có tỷ lệ lưu hành là 9,7%.. - Virus cúm gia cầm type A H5N1 lưu hành tại địa điểm lấy mẫu (chợ và lò mổ).. - Tỷ lệ nucleotide của các chủng virus cúm gia cầm type A H5N1 lưu hành tại các địa phương sai khác so với chủng virus tham chiếu A/Hong Kong/6841/2010 từ . - Trình tự các acid amin ở vị trí nối kết giữa đoạn HA1 và HA2 đoạn quy định độc lực là Q- ERRRKR-G, tương đồng với trình tự của chủng virus cúm gia cầm type A H5N1 độc lực cao tham chiếu A/Hong Kong/6841/2010.. - Các chủng virus cúm gia cầm type A H5N1 lưu hành tại các tỉnh Hậu Giang, Sóc Trăng, Trà Vinh và Vĩnh Long thuộc clade virus 2.3.2.1c.. - Báo cáo tổng kết công tác phòng chống dịch bệnh gia súc, gia cầm năm 2015.. - Khảo sát sự lưu hành và bước đầu giải trình tự gene của virus cúm gia cầm subtype H5N1 tại tỉnh Cà Mau và Sóc Trăng. - Cách tiếp cận đồng bộ về sức khỏe gia cầm và chăn nuôi gia cầm an toàn.. - Phân tích đặc điểm gen kháng nguyên HA (H5) và NA (N1) của các chủng virus cúm A/H5N1 clade 2.3.2.1. - Một số kết quả nghiên cứu về bệnh cúm gia cầm (Avian Influenza) ở Đồng bằng sông Cửu Long. - Nghiên cứu thành phần gen H5 của virus cúm A/H5N1 phân lập từ vịt tại Thừa Thiên Huế