- SỰ THUẦN CHỦNG VÀ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA CÂY SỐNG ĐỜI (KALANCHOE PINNATA) VÀ CÂY RAU MƯƠNG (LUDWIGIA HYSSOPIFOLIA) Ở ĐỒNG. - Tổng số 30 mẫu lá Sống Đời và 30 mẫu Rau Mương được thu thập ở nhiều nơi thuộc đồng bằng sông Cửu Long được điện di protein bằng phương pháp SDS-PAGE và thử hoạt tính kháng khuẩn (xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC) trên 8 chủng vi khuẩn Staphylococcus aureus, Streptococcus faecalis, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella spp. - Kết quả diện di cho thấy các cây Sống đời thuần chủng và có khả năng tác động trên vi khuẩn thử nghiệm, đặc biệt tác động rất mạnh trên Edwardsiella ictaluri (MIC= 512 g/ml). - Trong khi cây Rau mương không thuần chủng, gồm 20 dòng với tỉ lệ cá thể đa hình là 9%, tỉ lệ băng protein đa hình 10%, chỉ số đa dạng về kiểu gen H EP = 0,61 và số allele hiệu quả SENA= 1,15, rõ nhất là chỉ số đa dạng về kiểu hình Ho. - Hoạt tính kháng khuẩn các dòng Rau mương khác nhau nhưng đều tác động tốt trên vi khuẩn thử nghiệm và tất cả các nhóm tác động rất mạnh trên Edwardsiella tarda, Staphylococcus aureus, Edwardsiella ictaluri và Aeromonas hydrophila (MIC=128-512 µg/ml).. - Từ khóa: cây Sống đời, Rau mương, điện di protein, nồng độ ức chế tối thiểu. - Cây Sống đời (Kalanchoe pinnata) còn gọi cây Trường sinh. - Theo Võ Văn Chi (1991), lá Sống đời có tác dụng kháng khuẩn, tiêu sưng, giảm đau. - Trong lá Sống đời có chất bryophylin có tác dụng kháng khuẩn và dùng trị một số bệnh đường ruột, chữa bỏng, đắp vết thương, đắp mắt đỏ sưng đau, cũng dùng chữa viêm loét dạ dày, viêm ruột, trĩ nội, đi ngoài ra máu. - Lá Sống đời có tác dụng kháng cả vi khuẩn gram dương lẫn gram âm (ức chế các vi khuẩn tụ cầu vàng, trực khuẩn mủ xanh và Streptococcus viridans), trị tiêu chảy, lỵ, dịch tả, lao phổi, nhọt, bệnh nhiễm khuẩn đường ruột, trị sốt, đau lưng, đau chân, chữa viêm tai và bị thương thổ huyết. - Đỗ Huy Bích et al., 2004. - Đỗ Tất Lợi, 2003) và theo Nguyễn Thị Phượng (2005), cao chiết nước lá Sống đời còn có tác dụng chống viêm và chống đái tháo đường.. - Cây Rau mương ( Ludwigia hyssopifolia) là cây mọc hoang, theo kinh nghiệm dân gian cũng được dùng chữa nhiều bệnh như kiết lỵ, tiêu chảy, viêm ruột, viêm họng, ho, cảm mạo, mụn nhọt ở trẻ em. - Ở Ninh Thuận (vùng đèo Sông Pha) dân gian đã từng dùng cây Rau mương trị lỵ hiệu quả. - Bệnh viện y học dân tộc tỉnh Quảng Ninh đã dùng cây Rau mương dạng cao lỏng và dạng viên để chữa lỵ amip đạt kết quả tốt (57,4% bệnh nhân khỏi bệnh và 21,3% hết kén amip trong phân). - Ở Malaysia, cây Rau mương còn dùng chữa bệnh giang mai. - ở Lào, cây Rau mương được dùng chữa bệnh đau khớp. - ở Indonesia, dùng đắp chữa mụn nhọt, nốt sần (Đỗ Huy Bích et al., 2004). - Nước sắc Rau mương dân gian được dùng ngậm để chữa các bệnh ở hầu, họng, miệng. - Hai cây thuốc này có nhiều công dụng, được sử dụng nhiều trong dân gian, tuy nhiên, chưa có nghiên cứu nào cho biết sự thuần chủng của hai cây này. - Để góp phần tìm hiểu về những cây thuốc này, nghiên cứu về sự thuần chủng và hoạt tính kháng khuẩn của Sống Đời và Rau Mương được thực hiện. - Để từng bước chọn lọc ra những dòng có hoạt tính kháng khuẩn cao thay thế những kháng sinh đang ngày càng bị đề kháng, tiềm ẩn nguy cơ cho việc điều trị bệnh nhiễm trùng ở người và vật nuôi.. - 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 2.1 Vật liệu. - Sống đời: sử dụng lá, mẫu thu tại thành phố Cần Thơ. - Rau mương: sử dụng thân và lá, mẫu thu tại một số huyện thuộc tỉnh Kiên Giang, Hậu Giang và Vĩnh Long.. - Sử dụng các chủng vi khuẩn:. - Chủng vi khuẩn nguồn gốc từ viện Pasteur Tp Hồ Chí Minh:. - Chủng vi khuẩn nguồn gốc từ khoa Thủy Sản (Đại học Cần Thơ):. - Edwardsiella ictaluri (Ed. - ictaluri) 2.2 Phương pháp thí nghiệm 2.2.1 Điện di protein. - 30 mẫu lá Sống đời và 30 mẫu lá Rau mương dùng điện di protein được thu từ 30 hộ dân khác nhau (cách nhau trên 1km).. - Điện di protein lá Sống đời và Rau mương được tiến hành theo phương pháp SDS- PAGE (Laemmli, 1970).. - Sự đa dạng về di truyền được đánh giá dựa trên những thông số Ho (đa dạng về kiểu hình), H EP (đa dạng về kiểu gen) và SENA (tổng của số alen hiệu quả: sum of the effective number of alleles) (Hub and Ohnishi, 2002. - Thanh et al., 2003):. - f i là tần số xuất hiện dãy băng protein i. - Qui định tần số của những dãy băng protein được thấy bằng mắt thường, nếu có hiện diện cho điểm là 1, nếu không hiện diện cho điểm là 0.. - n là số dãy băng protein hiện diện.. - Nếu Ho = 0 chứng tỏ tính thuần chủng cao, nếu giá trị Ho lớn chứng tỏ có sự đa dạng về di truyền, tức cây không thuần chủng.. - H EP biến thiên từ 0 đến 1, nếu trị số H EP nhỏ chứng tỏ tính thuần chủng cao, nếu trị số H EP lớn chứng tỏ có sự đa dạng về di truyền.. - Sự đa dạng về hình thái của cá thể hay của các dãy băng protein được ghi nhận khi sự biến đổi những dãy băng protein của nó <. - 2.2.2 Thử hoạt tính kháng khuẩn. - Các cây có sự khác biệt về dãy băng protein được trồng lại trong cùng điều kiện chăm sóc, dinh dưỡng. - Sau khoảng 4 tháng, lá được hái thử hoạt tính kháng khuẩn.. - Lá Sống đời và Rau mương được sấy khô và chiết ngấm kiệt với methanol, dịch chiết đem cô quay dưới áp suất thấp thu được cao thô, dùng thử hoạt tính kháng khuẩn MIC (minimum inhibitory concentration) (Nguyễn Văn Đàn và Nguyễn Viết Tựu, 1985).. - Dùng phương pháp phương pháp pha loãng trong thạch để xác định MIC (Trương Công Quyền et al., 1986. - Từ Minh Koóng et al., 2001).. - 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Sự đa dạng về di truyền. - Trong 30 mẫu lá Sống đời và 30 mẫu Rau mương bằng phương pháp điện di protein SDS-PAGE phát hiện được lá Sống đời có 8 dãy băng protein và Rau mương có 11dãy băng protein có sự khác biệt (Hình 1 và Hình 2).. - Những thông số biểu thị sự đa dạng về di truyền của lá Sống đời và Rau mương được trình bày qua Bảng 1. - Qua kết quả Bảng 1 cho thấy tỉ lệ cá thể đa hình của lá Sống đời và Rau mương lần lượt là 1 và 9%, tỉ lệ băng protein đa hình là 1 và 10%, chỉ số đa dạng về kiểu gen H EP = 0 và 0,61 và số allele hiệu quả SENA = 0 và 1,55 và chỉ số đa dạng về kiểu hình Ho = 0 và 3,04. - Như vậy, cây Sống đời thuần chủng, trong khi cây Rau mương không thuần chủng mà gồm nhiều dòng (line), nhưng cùng loài (species).. - Bảng 1: Những thông số đa dạng về di truyền của cây Sống đời và Rau mương. - Thông số Sống đời Rau mương. - Cá thể đa hình. - Băng protein đa hình. - Đa dạng về kiểu hình Ho 0 3,04. - Đa dạng về kiểu gen H EP 0 0,61. - Hình 1: Phổ điện di protein Sống đời. - Qua kết quả điện di cho thấy cây Sống đời thuần chủng (không có sự khác biệt ở các dãy băng giữa các cây) và cây Rau Mương được chia ra làm 20 dòng khác nhau.. - Protein của các cá thể trong cùng một giống sau khi chạy điện di SDS-PAGE sẽ cho ra các băng giống nhau, kể cả độ đậm nhạt của mỗi dãy băng, do cùng một giống có cùng kiểu di truyền nên chúng sẽ tạo ra các loại protein giống nhau. - Nếu các cá thể không cùng giống, sẽ xảy ra các trường hợp sau:. - Phổ điện di của các thành phần protein của các cá thể khác nhau sẽ có ít hơn hoặc nhiều hơn một hay nhiều vạch so với cá thể khác.. - Phổ điện di các thành phần protein của các cá thể khác nhau có băng đậm hoặc nhạt hơn so với cá thể khác tại nhiều vị trí (Phạm Văn Phượng, 2001).. - Cây Sống đời được trồng bằng nhân giống vô tính (giâm lá), nên thuần chủng.. - Trong khi cây Rau Mương do mọc hoang, hoa lưỡng tính, dễ dàng thụ phấn chéo nên không thuần chủng, có sự đa dạng về dòng. - Kết quả thu nhận được từ điện di protein cho thấy cấu trúc các dãy băng protein khác nhau và các thông số đa dạng về di truyền đã đánh giá được sự không thuần chủng của cây Rau mương.. - Hình 2: Phổ điện di Rau Mương. - 3.2 Thử hoạt tính kháng khuẩn. - Các cây có sự khác biệt các dãy băng protein, được trồng trong cùng điều kiện chăm sóc sau 4 tháng, lá các nhóm cây này được thử hoạt tính kháng khuẩn, kết quả được trình bày qua bảng 2 và bảng 3.. - Bảng 2: Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) đối với vi khuẩn của Sống đời (MIC, µg/ml). - Qua bảng 2 cho thấy cao Sống đời có tác dụng ức chế tốt trên 8 chủng vi khuẩn thí nghiệm, khả năng ức chế trên các chủng vi khuẩn không giống nhau, ức chế mạnh nhất đối với E. - vi khuẩn này kháng với nhiều kháng sinh mạnh như oxytetracycline, oxolinic acid, sulfonamide. - (Từ Thanh Dung et al., 2008). - Việc phát hiện ra hoạt tính kháng khuẩn của Sống đời trên vi khuẩn E. - Kết quả trên phù hợp với kết quả nghiên cứu của Võ Văn Chi (1991) và Đỗ Tất Lợi (2003), cho rằng trong lá Sống đời chứa hoạt chất bryophylin có tác dụng. - Vi khuẩn. - kháng khuẩn, lá Sống đời có tác dụng kháng cả vi khuẩn gram dương lẫn gram âm, ức chế các vi khuẩn tụ cầu vàng, trực khuẩn mủ xanh và Streptococcus viridans.. - Kết quả này cũng giải thích được kinh nghiệm dân gian từ lâu đời đã sử dụng lá Sống đời trị bệnh đường ruột, bệnh đường hô hấp và viêm nhiễm (Đỗ Huy Bích et al., 2004).. - Bảng 3: Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) đối với vi khuẩn của các dòng Rau Mương (MIC, µg/ml). - Qua bảng 3 cho thấy khả năng tác động trên vi khuẩn thử nghiệm của các dòng Rau mương không giống nhau. - Tùy dòng, tác động mạnh yếu khác nhau, (như dòng 12 tác động rất mạnh trên vi khuẩn thử nghiệm Salmonella MIC <. - 16 μg/ml, nhưng dòng thì không tác động. - Tuy nhiên, tất cả các dòng Rau Mương đều không hoặc ức chế rất yếu trên Streptococcus faecalis và Escherichia coli (MIC ≥ 4096 μg/ml). - Do đó, theo kinh nghiệm dân gian Rau Mương đã được dùng trị lỵ, trị viêm nhiễm và tiêu chảy do Salmonella spp (Võ Văn Chi, 2005) là có cơ sở khoa học.. - tarda 1 512 >4096 > gt;4096 > gt;4096 > gt;4096 > gt;4096 >4096 >4096 >4096 > gt;4096 > gt gt;4096 >4096 > gt;4096 > gt;4096 > gt;4096 > gt;4096 > gt;4096 > gt gt;4096 >4096 > gt;4096 >4096 >4096 < gt;4096 >4096 >4096 >4096 > gt;4096 >4096 > gt gt;4096 >4096 > gt;4096 >4096 > gt;4096 >4096 > gt;4096 >4096 > lt;16 20 >4096 >4096 >4096 >4096 > lt;16. - Hầu hết các dòng Rau Mương ức chế 3 chủng vi khuẩn : Aeromonas hydrophila, Edwardsiella ictaluri và Edwardsiella tarda ở nồng độ rất thấp (ức chế mạnh nhất là trên Edwardsiella tarda), cả 3 chủng vi khuẩn này gây bệnh phổ biến trên cá hiện nay và gây thiệt hại đáng kể cho nhà nuôi trồng thủy sản (E. - tarda gây bệnh nhiễm khuẩn huyết, A. - ictaluri gây bệnh gan thận mủ trên cá tra, cá basa. - bên cạnh đấy, các dòng Rau mương cũng ức chế tốt S.. - aureus gây bệnh viêm có mủ trên gia súc,… Đây là những bệnh rất khó điều trị và thường kém hiệu quả do tính kháng thuốc ngày càng cao của các chủng vi khuẩn như: E. - doxycycline (27,7%) (Trương Ngọc Loan et al., 2007). - oxytetracyclin (81%) và trimethrorim (73%) (Từ Thanh Dung et al., 2008). - tarda kháng với benzylpenicillin, oxacillin, colistin, rifamycin, lincomycin và polymyxin B (Muyembe et al., 1973. - Ingo and Bernd, 2001), nên việc phát hiện ra khả năng ức chế các chủng vi khuẩn của các dòng Rau mương có ý nghĩa đặc biệt quan trọng trong tìm những thuốc mới có khả năng kháng khuẩn trong điều trị các bệnh ở động vật thủy sinh và gia súc thay thế kháng sinh hóa dược đang bị kháng thuốc.. - Kết quả điện di protein đã giúp chọn lọc dòng Rau mương có hoạt tính kháng khuẩn cao, hy vọng có thể thay thế vai trò kháng sinh trong tương lai.. - Cây Sống đời thuần chủng, trong khi cây Rau mương không thuần chủng mà có 20 dòng và các dòng này có sự khác biệt về hoạt tính kháng khuẩn, một số dòng có hoạt tính kháng khuẩn cao, một số có hoạt tính kháng khuẩn thấp trên các vi khuẩn thử nghiệm. - Cây Sống đời và Rau mương đều tác động hiệu quả trên vi khuẩn gây bệnh trên cá.. - Nguyễn Thị Phượng (2005), Tác dụng chống nhận cảm đau, chống viêm và chống đái tháo đường của cao chiết nước lá cây Sống đời, Bản Tin Dược Liệu . - Phạm Văn Phượng (2001), Khả năng ứng dụng phương pháp điện di protein SDS-PAGE trong nghiên cứu đánh giá tài nguyên di truyền thực vật, Tạp chí Nông nghiệp và phát triển nông thôn, 20.. - Trương Ngọc Loan, Nguyễn Hữu Thịnh và Lưu Thị Thanh Trúc (2007), Khảo sát hiện trạng nuôi cá tra thâm canh ở tỉnh Đồng Tháp và mô tả một số đặc điểm của vi khuẩn gây bệnh gan thận mủ