- TÁI SINH CHỒI CÂY KHỔ QUA (Momordica charantia L.) In vitro TỪ TỬ DIỆP Lê Minh Lý 1 , Triệu Phương Thảo 1 và Huỳnh Lê Anh Nhi 1. - in vitro. - Cây khổ qua, Momordica charantia L., BA, kinetin, IBA, nhân chồi, tạo rễ, tái sinh chồi, tử diệp. - Đề tài “Tái sinh chồi cây khổ qua (Momordica charantia L.) in vitro từ tử diệp” được thực hiện nhằm tìm ra tuổi của tử diệp, nồng độ các chất điều hòa sinh trưởng (BA, kinetin and IBA) thích hợp cho sự tái sinh chồi, nhân chồi và tạo rễ cây khổ qua tái sinh từ tử diệp in vitro. - Thí nghiệm được tiến hành tại Phòng nuôi cấy mô của Bộ môn Sinh lý - Sinh hoá, Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ từ tháng 4/2013 đến tháng 3/2014. - Kết quả thí nghiệm cho thấy: i) tử diệp từ hạt 12 ngày sau khi nảy mầm trong điều kiện tối cho tỉ lệ tái sinh chồi 93,8% sau 3 tuần nuôi cấy trên môi trường MS+BA 2,5 mg/L. - ii) Môi trường MS có bổ sung BA 1 mg/L + kinetin 0,2 mg/L cho hiệu quả nhân chồi từ cây khổ qua tái sinh tốt nhất. - iii) Tỉ lệ chồi tạo rễ cao trên môi trường MS + than hoạt tính 2 g/L +IBA 0-1 mg/L sau 3 tuần nuôi cấy.. - Cây khổ qua (Momordica charantia L.) là loại cây có giá trị dược liệu vô cùng quý giá, năm 1990 Liên hiệp quốc đã chọn khổ qua là một trong 6 cây thuốc trị bệnh tiêu biểu trên thế giới (Lê Thị Thanh. - Tuy nhiên, hầu hết các giống khổ qua đều là giống F1, thường có thời gian sinh trưởng. - Tái sinh cây in vitro là bước rất quan trọng để thực hiện thành công các kỹ thuật của công nghệ sinh học trong chương trình cải thiện giống. - Trong đó, tái sinh chồi từ tử diệp là một trong những phương pháp cho được hiệu quả tạo chồi cao trong nuôi cấy in vitro, nó không chỉ đơn thuần là chọn tạo giống thông thường mà ngay cả trong chọn tạo giống công nghệ sinh học và tạo cây chuyển gen (Yan et al., 2000). - “Tái sinh chồi cây khổ qua (Momordica charantia L.) in vitro từ tử diệp” được thực hiện nhằm tìm ra môi trường thích hợp để nhân giống cây khổ qua từ tử diệp nhằm để phục vụ cho nhu cầu sản xuất và là cơ sở cho các nghiên cứu sâu hơn.. - Thí nghiệm được tiến hành tại phòng cấy mô của Bộ môn Sinh lý-Sinh hóa, Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ.. - Thí nghiệm được thực hiện trên giống khổ qua TN 166 của Công ty giống Trang Nông.. - Môi trường nền được sử dụng là môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962) có bổ sung thêm nước dừa tươi (100 ml/L), đường (30 g/L), agar (6,8 g/L), vitamin (Thiamine, Pyridoxine, Nicotinic acid), kích thích tố (BA, IBA, kinetin. - nghiệm 1 môi trường được chuẩn bị trong các bình tam giác 250 ml (khoảng 125 ml/bình) và được rót vào đĩa petri sau khi thanh trùng (20 ml/đĩa). - Thí nghiệm 2 và 3 môi trường được rót 50 ml/keo đậy nắp có lổ được lót giấy bên trong và ngoài nắp. - Vô trùng mẫu cấy: hạt khổ qua khô ngâm hạt trong nước ấm 10 phút, rửa bằng cồn 70 0 trong 30 giây, tiếp theo rửa lại bằng nước cất vô trùng 2-3 lần, sau đó rửa với javel nồng độ 10% trong 3 phút và rửa lại với 3-4 lần nước cất. - Hạt được cấy vào môi trường MS có bổ sung BA 0,2 mg/L và để trong tối.. - Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của tuổi tử diệp trên sự tái sinh chồi cây khổ qua in vitro.. - Mục tiêu: xác định tuổi tử diệp thích hợp cho sự tái sinh chồi cây khổ qua.. - Vật liệu thí nghiệm: hạt khổ qua nảy mầm 8, 10, 12 và 14 ngày sau khi gieo được cắt ra làm 1/3 theo chiều ngang ứng với hai vị trí vùng gần và vùng xa tử diệp, loại bỏ vùng xa của tử diệp, cắt bỏ trục hạ diệp chỉ chừa lại khoảng 1 mm phía gần phôi. - Tách đôi mảnh tử diệp và loại bỏ chồi hữu tính bên trong (Hình 1B) và cấy vào môi trường MS có bổ sung BA 2,5 mg/L.. - Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên một nhân tố gồm 4 độ tuổi của tử diệp (hạt 8, 10, 12 và 14 ngày sau khi gieo), mỗi nghiệm thức có 4 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại là 1 đĩa petri, mỗi đĩa cấy 4 mẫu.. - Vật liệu thí nghiệm: chồi ngọn có chiều cao từ 1,5- 2 cm được tái sinh từ tử diệp và cấy chuyển trên môi trường MS + BA 0,2 mg/L khoảng 2 tuần trước khi bố trí thí nghiệm.. - Thí nghiệm 3: Hiệu quả của IBA trên sự tạo rễ khổ qua in vitro.. - Mục tiêu: tìm được nồng độ IBA thích hợp cho sự tạo rễ khổ qua in vitro.. - Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên một nhân tố với 3 nồng độ IBA (0, 0,5 và 1 mg/L. - Vật liệu thí nghiệm: chồi ngọn khổ qua có chiều cao từ 1,5- 2 cm được cấy trên môi trường MS + BA 0,2 mg/L khoảng 2 tuần trước khi bố trí thí nghiệm.. - Tỉ lệ. - 3.1 Ảnh hưởng của tuổi tử diệp trên sự tái sinh chồi cây khổ qua in vitro. - 3.1.1 Tỉ lệ. - Bảng 1 cho thấy ở tuần thứ ba sau khi cấy tỉ lệ tạo chồi thấp nhất ở tử diệp 8 ngày SKG (sau khi gieo) chỉ có 25,0% khác biệt thống kê ở mức ý nghĩa 1% so với các nghiệm thức còn lại, giữa ba độ tuổi 10, 12 và 14 ngày SKG khác biệt không có. - Theo Li et al., (2007) trạng thái sinh lý khác nhau của mẫu cấy sẽ ảnh hưởng đến khả năng tái sinh của mẫu, vì thế tuổi của cây con sau khi gieo là chìa khóa dẫn đến thành công trong việc tái sinh in vitro cây khổ qua từ tử diệp (Ma et al., 2012). - Trên cây khổ qua giống Cufei, Li et al., (2007) đã tìm ra độ tuổi thích hợp cho tỉ lệ tái sinh chồi cao là tử diệp từ hạt 9 ngày SKG. - Theo Dong và Jia (1991) tử diệp còn non có hoạt tính sinh lý học tích cực và phản ứng một cách có hiệu quả đối với các chất điều hòa sinh trưởng. - Tuy nhiên, Compton và Gray (1993) cho rằng tử diệp hạt quá non sẽ cho tỉ lệ sống thấp, ngược lại tử diệp hạt thành thục cho tỉ lệ sống cao nhưng tỉ lệ tái sinh thấp, chỉ có độ tuổi thích hợp mới cho hiệu quả về tỉ lệ sống cao và tái sinh cao.. - Qua kết quả thí nghiệm cho thấy ở tuần đầu tiên tất cả các nghiệm thức chưa có sự hình thành chồi, từ tuần thứ hai mới có sự xuất hiện chồi, tuy nhiên chồi chỉ thấy rõ và ổn định ở tuần thứ ba (Hình 2).. - Bảng 1: Tỉ lệ. - mẫu tử diệp tạo chồi, chiều cao chồi và số lá tái sinh từ tử diệp ở các độ tuổi khác nhau sau 3 tuần nuôi cấy. - Tuổi tử diệp (ngày). - Tỉ lệ tạo chồi. - ns: không khác biệt thống kê. - khác biệt ở mức ý nghĩa 1%. - Chiều cao chồi dao động từ 0,23 cm đến 0,75 cm không có sự khác biệt thống kê giữa các độ tuổi của tử diệp (Bảng 1). - Hình 2: Tử diệp tạo chồi trên môi trường có nồng độ BA 2,5 mg/L ở các độ tuổi tử diệp khác nhau sau 3 tuần nuôi cấy: (A) 8 ngày tuổi, (B) 10 ngày tuổi, (C) 12 ngày tuổi và (D) 14 ngày tuổi. - Đồng thời qua thí nghiệm ghi nhận được tỉ lệ sống của mẫu cấy trong đĩa là 100%.. - Mỗi mẫu cấy chỉ hình thành một chồi, các chồi đều xuất phát từ gốc tử diệp (vùng gần phôi) đã loại bỏ phôi hữu tính (Hình 3). - (2012) trên hệ thống tái sinh cây khổ qua thì tử diệp cho kết quả tái sinh chồi tốt, ngoài ra kết quả này cũng tương đồng với kết quả ở các cây thuộc họ bầu bí dưa của nhiều tác giả như Krug et al. - Theo Wehner (2007) do tử diệp có chức năng chủ yếu là dự trữ dinh dưỡng để nuôi phần phôi khi hạt nảy mầm nên dinh dưỡng và năng lượng cũng có xu hướng tập trung về vùng gần phôi. - Qua quá trình làm thí nghiệm cũng nhận thấy rằng có những chồi tái sinh xuất hiện muộn hơn và có kích thước nhỏ hơn, đối với những chồi này khả năng để có được một cây khổ qua hoàn chỉnh là rất thấp, Krug et al. - (2005) đã khẳng định những chồi tái sinh có kích thước nhỏ và xuất hiện muộn, mặc dù có thể quan sát rõ nhưng rất khó để kéo dài và tạo cây hoàn chỉnh.. - Từ kết quả thí nghiệm trên cho thấy, ở nghiệm thức hạt 12 ngày tuổi tuy có chồi cho chiều cao và số lá không bằng nghiệm thức hạt 10 ngày tuổi nhưng giữa chúng lại không khác biệt ý nghĩa. - Hình 3: Mô sẹo hình thành ở gốc tử diệp (A) và vị trí phát sinh chồi khổ qua (B) 3.2 Hiệu quả của BA và kinetin trên sự nhân chồi khổ qua tái sinh từ tử diệp. - 3.2.1 Số chồi gia tăng. - Kết quả Bảng 2 cho thấy, sau 3 tuần nuôi cấy số chồi gia tăng giảm khi nồng độ BA tăng, số chồi gia tăng cao nhất ở nồng độ BA 1,0 mg/L là 1,9 chồi khác biệt thống kê ở mức ý nghĩa 1% so với nồng độ BA 2 mg/L BA là 0,84 chồi và 3,0 mg/L là 0,67 chồi. - Hiệu quả của kích thích tố cytokinin là rất đa dạng, vừa có khả năng tạo chồi, nhân chồi và kéo dài chồi (Lee et al., 2003) chính vì thế ở các nồng độ BA khác nhau đã kích thích các tế bào phân hóa thành chồi. - (2010) cho rằng nồng độ cao của BA sẽ làm giảm số chồi cũng như chiều cao. - Bảng 2: Số chồi khổ qua gia tăng trên môi trường có nồng độ BA và kinetin khác nhau sau 3 tuần nuôi cấy. - Nồng độ kinetin (mg/L). - Nồng độ BA (mg/L) Trung bình (kinetin . - Số chồi gia tăng chịu sự tương tác giữa các nồng độ BA và Kinetin, số chồi gia tăng cao nhất ở nghiệm thức BA 1,0 mg/L + kinetin 0,2 mg/L (2,47 chồi) khác biệt thống kê ở mức ý nghĩa 1% so với các nghiệm thức còn lại (Hình 4), số chồi gia tăng. - Nhìn chung, khi nồng độ cytokinin tăng thì số chồi gia tăng có xu hướng giảm. - Hu và Wang (1983) cũng báo cáo rằng nồng độ cao của cytokinin sẽ làm giảm số chồi ở một số mẫu cấy, kinetin cho số chồi thấp hơn BA. - Kết quả cũng cho thấy số chồi đạt được trong thí nghiệm này còn thấp so với nhiều nghiên cứu nhân chồi các cây thuộc họ bầu bí dưa của nhiều tác giả. - Lâm Ngọc Phương và Nguyễn Bảo Vệ (2008) báo cáo rằng nồng độ BA 0,5 mg/L + kinetin 0,5 mg/cho số chồi dưa hấu tam bội gia tăng là 7,1 chồi. - Cả hai chất là BA và kinetin đều có ảnh hưởng đến số chồi gia tăng. - Theo Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên (2002), nhu cầu về loại và nồng độ cytokinin rất khác nhau đối với một số loại cây.. - Hình 4: Chồi khổ qua trên môi trường có nồng độ BA và kinetin khác nhau ở thời điểm 3 tuần sau khi cấy: (A) BA 1 mg/L + kinetin 0,2 mg/L, (B) BA 2 mg/L + kinetin 0,2 mg/L, (C) BA 3 mg/L + kinetin. - 3.2.2 Chiều cao và số lá gia tăng Chiều cao gia tăng. - Bảng 3 cho thấy, ở thời điểm 3 TSKC chiều cao chồi gia tăng cao nhất ở nồng độ BA 1 mg/L là 0,86 cm khác biệt thống kê ở mức ý nghĩa 1% so. - chiều cao chồi gia tăng thấp nhất là 0,40 cm. - Giữa hai nồng độ kinetin thì kinetin 0,2 mg/L cho chiều cao gia tăng là 0,70 cm cao hơn kinetin 0,5 mg/L chỉ có 0,58 cm, khác biệt thống kê ở mức ý nghĩa 1%.. - nghiệm thức BA 1 mg/L + kinetin 0,2 mg/L cho chiều cao chồi gia tăng cao nhất là 1,01 cm khác biệt thống kê ở mức ý nghĩa 1% so với các nghiệm thức còn lại. - Nghiệm thức BA 3 mg/L + kinetin 0,2 mg/L có chiều cao chồi gia tăng thấp là 0,36 cm.. - Các nghiệm thức còn lại có chiều cao gia tăng dao động từ 0,44 cm đến 0,75 cm. - Điều này có thể giải thích với nồng độ cytokinin cao đã gây ức chế sự phát triển chiều cao của chồi khổ qua. - Kết quả thí nghiệm cho thấy sử dụng kết hợp BA và kinetin cho chiều cao chồi tốt hơn đồng thời giảm sự tạo nhiều mô sẹo ở các mẫu cấy (Hình 4).. - Bảng 3: Chiều cao chồi khổ qua gia tăng (cm) trên môi trường có nồng độ BA và kinetin khác nhau sau 3 tuần nuôi cấy Nồng độ kinetin. - Ở 3 TSKC, Bảng 4 cho thấy số lá gia tăng cao nhất ở nồng độ BA 1 mg/L là 2,1 lá, khác biệt thống kê ở mức ý nghĩa 1% so với 2 nống độ BA còn lại, thấp nhất vẫn là nồng độ BA 2 mg/L có 1,0 lá và BA 3 mg/L có 1,1 lá. - Tuy nhiên không có sự ảnh hưởng của kinetin đến số lá gia tăng. - Đồng thời cũng không có sự tương tác giữa hai nồng độ. - Bảng 4: Số lá khổ qua gia tăng trên môi trường có nồng độ BA và kinetin khác nhau sau 3 tuần nuôi cấy. - khác biệt ở mức ý nghĩa 1%, ns: không khác biệt thống kê. - Tóm lại, trong giai đoạn nhân chồi khổ qua có thể sử dụng môi trường MS có bổ sung BA 1 mg/L + kinetin 0,2 mg/L, trên môi trường này các chồi sinh trưởng tốt hơn về các chỉ tiêu số chồi gia tăng, số là và chiều cao chồi so với các môi trường có nồng độ BA và kinetin cao hơn.. - 3.3 Hiệu quả của IBA trên sự tạo rễ khổ qua in vitro. - 3.3.1 Tỉ lệ. - Theo kết quả nghiên cứu của Lâm Ngọc Phương và Nguyễn Bảo Vệ (2008) trên dưa hấu tam bội cho thấy tỉ lệ chồi tạo rễ giữa các nồng độ IBA 0-2 mg/L không khác biệt thống kê, có thể sử dụng môi trường có IBA hay than hoạt tính để tạo rễ dưa hấu in vitro. - Bổ sung than hoạt tính vào môi trường nuôi cấy có tác dụng khử độc, hấp thu các chất phenol. - Than hoạt tính làm môi trường trở nên sẩm hơn vì vậy có thể kích thích hình thành rễ.. - Bảng 5: Tỉ lệ. - mẫu tạo rễ, số rễ và chiều dài rễ của chồi khổ qua trên môi trường có nồng độ IBA khác nhau sau 4 tuần nuôi cấy. - Hình 5: Chồi khổ qua tạo rễ trên môi trường có nồng độ IBA khác nhau ở 4 tuần sau khi cấy: (A) IBA 0 mg/L, (B) IBA 0,5 mg/L, (C) IBA 1 mg/L. - Như vậy, có thể sử dụng môi trường MS+ than hoạt tính 2 g/L để tạo rễ khổ qua in vitro, với tỉ lệ tạo rễ cao, các chồi sinh trưởng tốt.. - Tử diệp 12 ngày tuổi cho khả năng tái sinh chồi cây khổ qua hiệu quả hơn tử diệp 8, 10 và 14 ngày tuổi trên môi trường MS+ BA 2,5 mg/L.. - Giai đoạn nhân chồi cây khổ qua, môi trường MS + BA 1 mg/L + kinetin 0,2 mg/L cho kết quả tốt, các chồi sinh trưởng tốt hơn các nghiệm thức có nồng độ BA và kinetin cao.. - Giai đoạn tạo rễ cây khổ qua, môi trường MS + than hoạt tính + IBA (0-1 mg/L) cho hiệu quả tạo rễ cao sau 3 tuần nuôi cấy.. - Thực hiện thí nghiệm nhân chồi để tìm ra môi trường thích hợp cho hệ số nhân tối ưu hơn, tiếp tục nghiên cứu giai đoạn thuần dưỡng cây khổ qua để hoàn thiện quy trình nhân giống.. - In vitro. - Khảo sát thành phần hóa học trong trái khổ qua (mướp đắng) thuộc họ bầu bí trên địa bàn thành phố Cao Lãnh, Luận văn thạc sĩ khoa học Nông nghiệp, Đại học Đồng Tháp.