Tạo dòng và biểu hiện interleukin 2 (IL-2) người tái tổ hợp trong Escherichia coli

- TẠO DÒNG VÀ BIỂU HIỆN INTERLEUKIN 2 (IL-2) NGƯỜI TÁI TỔ HỢP TRONG Escherichia coli.
- The PCR product was digested with BamHI and NdeI then inserted into an expression vector pET-His to construct a recombinant plasmid termed pET-il2 capable of expressing IL-2 under the control of T7 promoter.
- The recombinant plasmid pET-il2 was transformed into E.
- coli strain Origami(DE3) to form the Origami(DE3)/pET-il2 clone.
- Liệu pháp miễn dịch sử dụng interleukin 2 (IL-2) đã được FDA chấp thuận sử dụng cho việc điều trị một số bệnh ung thư và hỗ trợ điều trị HIV/AIDS..
- Nhằm mục tiêu sản xuất IL-2 tái tổ hợp với giá thành rẻ, đề tài được triển khai nhằm dòng hóa và biểu hiện IL-2 trong Escherichia coli.
- Gen il2 được khuếch đại bằng phương pháp PCR sử dụng khuôn là plasmid pIDT-IL2 với cặp mồi đặc hiệu IL2-F và IL2-R chứa vị trí nhận biết của enzyme BamHI và NdeI.
- Sản phẩm khuếch đại được xử lý với enzyme BamHI và NdeI và chèn vào vector biểu hiện pET-His tạo nên plasmid tái tổ hợp pET- il2.
- Plasmid pET-il2 được biến nạp vào E.
- coli Origami(DE3) tạo nên dòng tái tổ hợp Origami(DE3)/pET-il2.
- Dòng tế bào này khi được cảm ứng biểu hiện bằng 0,5 mM IPTG đã tạo protein IL-2 biểu hiện vượt mức ở dạng thể vùi trong tế bào chất.
- Sự biểu hiện protein mục tiêu được kiểm chứng bằng SDS-PAGE và lai Western với kháng thể kháng protein IL-2..
- Tạo dòng và biểu hiện interleukin 2 (IL-2) người tái tổ hợp trong Escherichia coli.
- Gần đây, liệu pháp miễn dịch được khẳng định là một phương pháp mới có hiệu quả trong điều trị ung thư khi được sử dụng riêng rẽ hoặc kết hợp với các phương pháp phẫu thuật, hóa trị và xạ trị.
- Interleukin-2 (IL-2) là một cytokine với tác dụng điều hòa và tăng cường khả năng miễn dịch, là nhân tố nhân dòng và tăng cường hoạt tính gây độc tế bào của tế bào lympho T hoạt hóa, tế bào giết tự nhiên (NK), tăng cường khả năng thực bào của bạch cầu đơn nhân, kích thích sự tổng hợp kháng thể của tế bào B và tổng hợp các cytokine thứ cấp khác như TNF (Tumor Necrosis Factor), INF-γ… Với những đặc điểm đó, liệu pháp miễn dịch sử dụng IL-2 đã và đang được quan tâm nghiên cứu, phát triển.
- Liệu pháp sử dụng sản phẩm IL-2 tái tổ hợp Proleukin (Cetus corporation) và Teceleukin (Hoffmann-La Roche) cho kết quả điều trị khả quan đối với một số dạng bệnh ung thư trên các thử nghiệm lâm sàng và đã được FDA cho phép sử dụng điều trị u hắc tố ác tính và ung thư biểu mô thận di căn, đồng thời có tác dụng làm tăng số lượng tế bào T CD4+ khi kết hợp với liệu pháp kháng retrovirus hoạt tính cao trong điều trị HIV/AIDS (Gaffen and Liu, 2004)..
- Cho đến nay, vai trò của sự glycosyl hóa vẫn chưa được biết rõ, tuy nhiên nhiều nghiên cứu cho thấy sự glycosyl hóa không cần thiết cho chức năng sinh học của cytokine này (Gaffen and Liu, 2004), đây là một đặc điểm thuận lợi cho phép sử dụng hệ thống biểu hiện prokaryote sản xuất IL-2 tái tổ hợp..
- coli dùng để biểu hiện protein tái tổ hợp đã được phát triển và thương mại hóa, trong đó E.
- coli Origami(DE3) là dạng chủng chủ phổ biến được dùng trong biểu hiện protein tái tổ hợp có cấu trúc cầu disulfide trong phân tử.
- coli Origami(DE3) thích hợp với vector biểu hiện thuộc hệ thống pET cho phép biểu hiện vượt mức protein mục tiêu và hạn chế tối đa sự rò rỉ phiên mã khi không có mặt chất cảm ứng..
- Xuất phát từ những kết quả điều trị khả quan đối với đã một số dạng bệnh ung thư, hỗ trợ điều trị HIV/AIDS đã được chứng minh qua các thử nghiệm lâm sàng và tiềm năng ứng dụng IL-2 tái tổ hợp trong điều trị ở Việt Nam cũng như những ưu điểm nổi bật của hệ thống biểu hiện E.
- coli, đề tài “Tạo dòng và biểu hiện protein Interleukin-2 tái tổ hợp trong tế bào E.
- coli Origami(DE3)” được tiến hành như là bước đầu trong việc xây dựng quy trình sản xuất IL-2 cho các ứng dụng thử nghiệm điều trị..
- coli DH5 [F.
- Chủng Escherichia coli Origami(DE3) [∆ara–leu7697, ∆lacX74,.
- ∆phoAPvuII, phoR, araD139, ahpC, galE, galK, rpsL, F'[lac+(lacIq)pro], gor522::Tn10 (TcR)trxB::kan (DE3)] dùng để biểu hiện protein..
- Plasmid pIDT-IL2 mang đoạn gen il2 tối ưu hoá cho việc biểu hiện ở E.
- coli tổng hợp bởi IDTDNA được dùng làm khuôn trong PCR thu nhận gen il2..
- pET-His (Novagen) là vector biểu hiện ở E.
- coli có kích thước khoảng 4636 bp, mang gen kháng ampicilin và promoter T7 cho phép biểu hiện protein mục tiêu trong tế bào chất E.
- coli DH5α mang plasmid tái tổ hợp pET-il2.
- coli DH5α mang plasmid tái tổ hợp pET-il2 được thực hiện như sau:.
- thu nhận gen il2 mã hóa protein interleukin 2 bằng phương pháp PCR từ khuôn là plasmid pIDT-IL2 sử dụng cặp mồi đặc hiệu IL2-F:.
- Sản phẩm PCR được xử lý với enzyme BamHI và NdeI để tạo đầu dính.
- thực hiện phản ứng nối gen il2 vào pET-His đã được cắt mở vòng bằng 2 enzyme tương ứng để hình thành plasmid tái tổ hợp pET-il2..
- Plasmid pET-il2 được biến nạp vào E.
- Dòng tế bào E.
- coli DH5α mang plasmid tái tổ hợp pET-il2 (E.
- coli DH5α/pET-il2) được sàng lọc trên môi trường LB agar chứa ampicillin nồng độ cuối là 100 μg/ml (LB- Amp100) và kiểm tra dòng mục tiêu bằng PCR khuẩn lạc với cặp mồi T7 promoter và T7 terminator.
- Sản phẩm PCR được kiểm tra trên gel 1%.
- Các thể biến nạp có kết quả PCR dương tính (kích thước 627bp) được tách chiết plasmid bằng phương pháp SDS kiềm (Sambrook and Russell, 2001).
- Plasmid tái tổ hợp pET-il2 sau khi xác định trình tự được biến nạp vào E.
- coli Origami(DE3).
- coli Origami(DE3) mang plasmid tái tổ hợp pET-il2 (E.
- coli Origami(DE3)/pET-il2) được sàng lọc trên môi trường LB-Amp100.
- Những khuẩn lạc nào mọc được trên môi trường này sẽ được lựa chọn để cảm ứng với IPTG để kiểm tra sự biểu hiện protein mục tiêu..
- 2.3 Xác định khả năng biểu hiện protein Interleukin-2 (IL-2) của chủng E.
- coli Origami(DE3)/pET-il2.
- coli Origami(DE3) chứa pET-il2 (E.
- coli Origami(DE3)/pET-il2) được cảm ứng biểu hiện protein Interleukine-2 (IL-2) theo sự hướng dẫn của công ty Novagen.
- coli Origami(DE3)/pET- il2 bằng LB-Amp100, lắc 250 vòng/phút, 37 o C đến khi OD 600 đạt 0,8 – 1,0.
- bổ sung IPTG đạt 0,5 mM để cảm ứng sự biểu hiện IL-2, tiếp tục nuôi lắc thêm 16 giờ.
- Sự biểu hiện IL-2 được phân tích bằng SDS- PAGE 15% theo sự mô tả của Laemmli (1970) (Laemmli, 1970) và khẳng định lại bằng lai Western sử dụng kháng thể đặc hiệu kháng IL-2 (Abcam) và phát hiện nhờ kháng thể kháng kháng thể dê IgG- HRP (Abcam).
- Phần trăm biểu hiện của IL-2 được xác định bằng phầm mềm Quantity-One (BioRad), khối lượng phân tử IL-2 được so với thang phân tử lượng thấp (Amersham)..
- Hình 1: Kết quả PCR thu gen il2 Giếng 1, Thang chuẩn DNA 1kbp plus (Fermentas) Giếng 2, Chứng âm (dung dịch phản ứng PCR không có bản mẫu pIDT-il2).
- Giếng 3, Sản phẩm PCR với mồi IL-2F và IL-2R với bản mẫu pIDT-il2.
- Gen il2 được thu nhận bằng phương pháp PCR với khuôn pIDT-IL2 sử dụng cặp mồi đặc hiệu IL2- F và IL2-R.
- Sản phẩm PCR có kích thước dự kiến là 465bp (Hình 1, giếng 3).
- Gen il2 sau đó được xử lý với enzyme BamH I và Nde I, nối vào vector pET- His đã được cắt mở vòng bằng các enzyme tương ứng tạo plasmid tái tổ hợp pET-il2.
- Sản phẩm nối được biến nạp vào tế bào E.
- coli DH5α bằng phương pháp hóa biến nạp.
- Yếu tố chọn lọc được sử dụng là khả năng kháng kháng sinh ampicillin.
- Hình 2: Kết quả biến nạp sản phẩm nối vào chủng E.
- coli DH5α.
- coli DH5α không biến nạp sản phẩm nối Đĩa 2, E.
- coli DH5α được biến nạp sản phẩm nối.
- Kết quả ở Hình 3 cho thấy sản phẩm PCR khuẩn lạc của thể biến nạp bằng cặp mồi T7 promoter và T7 terminator cho 1 vạch nằm ở khoảng giữa vạch 600 bp và 700 bp của thang chuẩn, phù hợp với kích thước dự đoán là 627 bp (giếng 3, Hình 3).
- Đây là kích thước của gen il2 (627bp) và 1 phần trình tự giữa hai mồi trên vector..
- Trong khi đó, sản phẩm PCR sử dụng plasmid pET- His làm khuôn chỉ cho 1 vạch có kích thước 162 bp (giếng 2, Hình 3)..
- Hình 3: Kết quả PCR khuẩn lạc Giếng 1, Thang chuẩn DNA 1kbp plus (Fermentas) Giếng 2, Sản phẩm PCR plasmid pET-His Giếng 3, Sản phẩm PCR khuẩn lạc dự tuyển.
- Những khuẩn lạc có kết quả PCR dương tính sẽ được tiếp tục tách chiết plasmid và kiểm tra lại để khẳng định sự hiện diện của gen il2 bằng cách sử dụng hai cặp mồi: cặp mồi đặc hiệu cho gen il2 (IL2-.
- Sản phẩm PCR của pET-il2 (Hình 4, giếng 4) với cặp mồi đặc hiệu (IL2-F và IL2-R) có kích thước khoảng 500 bp, tương ứng với kích thước gen il2 (465bp – giếng 3).
- Bên cạnh đó, sản phẩm PCR plasmid tái tổ hợp với cặp mồi T7 promoter và T7 terminator có kích thước khoảng 627 bp tương ứng với gen il2 (465 bp) cộng 1 phần trình tự giữa hai mồi trên vector (Hình 4, giếng 6).
- Trong khi đó, sản phẩm PCR pET-His (không mang gen il2) bằng cặp mồi T7 promoter và T7 terminator có kích thước 162 bp (Hình 4, giếng 5)..
- Hình 4: Kết quả PCR kiểm tra plasmid tái tổ hợp Giếng 1, Thang chuẩn DNA 1kbp plus (Fermentas) Giếng 2, Sản phẩm PCR plasmid pET-His với mồi IL2-F và IL2-R.
- Giếng 3, Gen il2.
- Giếng 4, Sản phẩm PCR plasmid pET-il2 với mồi IL2-F và IL2-R.
- Giếng 5, Sản phẩm PCR plasmid pET-His với mồi T7 promoter và T7 terminator.
- Giếng 6, Sản phẩm PCR plasmid pET-il2 với mồi T7 promoter và T7 terminator.
- Plasmid pET-il2 chứa gen mục tiêu il2 được giải trình tự để kiểm tra độ chính xác về trình tự cũng như sự đồng khung dịch mã.
- 3.2 Xác định khả năng biểu hiện protein Interleukin-2 (IL-2).
- Nhằm đánh giá sự biểu hiện và tìm hiểu đặc tính hiện diện của IL-2 ở dạng thể vùi hay hòa tan trong tế bào chất, chủng E.
- coli Origami(DE3)/pET-il2 được nuôi cấy lắc trong LB-Amp100 và cảm ứng bằng IPTG.
- Sinh khối tế bào được thu nhận sau 16 giờ cảm ứng và chuẩn bị mẫu protein tổng số, phân.
- coli Origami(DE3) được cảm ứng IPTG Giếng 3, E.
- coli Origami(DE3)/pET-il2 không cảm ứng IPTG.
- coli Origami(DE3)/pET-il2 cảm ứng IPTG, mẫu protein tổng.
- coli Origami(DE3)/pET-il2 cảm ứng IPTG, mẫu protein dạng thể vùi.
- coli Origami(DE3)/pET-il2 cảm ứng IPTG, mẫu protein dạng tan.
- Kết quả phân tích SDS-PAGE cho thấy khi được cảm ứng bởi IPTG, chủng tái tổ hợp đã tổng hợp một lượng lớn protein có kích thước khoảng 16 kDa (Hình 5A, giếng 4), trong khi đó vạch protein này không hiện diện trong dịch tổng khi chủng Origami(DE3) được cảm ứng IPTG (Hình 5A, giếng 1).
- So sánh với khối lượng phân tử lý thuyết của IL- 2 khoảng 16 kDa cho thấy vạch protein hiện diện trong dịch tổng được cảm ứng có thể là IL-2 tái tổ hợp biểu hiện từ pET-il2.
- Nhằm khẳng định vạch protein được biểu hiện là IL-2, SDS-PAGE được phân tích thêm bằng lai Western với kháng thể đặc hiệu kháng IL-2, trên bản phim xuất hiện vạch tín hiệu tương ứng với vị trí của vạch protein xuất hiện trong dịch tổng protein khi được cảm ứng IPTG (Hình 5B, giếng 4), kết quả này khẳng định vạch protein đậm xuất hiện khi được cảm ứng chính là IL- 2.
- coli Origami(DE3)/pET-il2 ở phân đoạn protein không tan và tan (Hình 5B, giếng 4 và 5) cho thấy IL-2 biểu hiện và tồn tại ở dạng thể vùi.
- coli Origami(DE3)/pET-il2 (Hình 6, giếng 4) và chiếm 68,5% tổng lượng protein được biểu hiện ở dạng thể vùi (Hình 6, giếng 5)..
- Hình 6: Kết quả định lượng sự biểu hiện IL-2 bằng phần mềm Quantity-One Giếng 1, Thang protein phân tử lượng thấp Giếng 2, E.
- coli Origami(DE3)/pET-il2 biểu hiện vượt mức IL-2 người tái tổ hợp..
- coli Origami(DE3)/pET-il2 đã được cấu trúc thành công và biểu hiện protein mục tiêu IL-2 dạng thể vùi trong tế bào chất với phần trăm biểu hiện được tính toán bằng phần mềm Quantity One (BioRad) là 19,3% so với lượng protein tổng..
- Mặc dù vẫn còn một lượng nhỏ protein mục tiêu bị rò rỉ khi chủng Origami(DE3)/pET-il2 không được cảm ứng bằng IPTG chứng tỏ promoter được kiểm soát chưa được chặt chẽ.
- Tuy nhiên, lượng protein này không đáng kể so với lượng IL-2 được tạo ra khi chủng cảm ứng bởi IPTG.
- Điều này chứng tỏ việc cảm ứng chủng Origami(DE3)/pET-il2 bằng IPTG cho hiệu quả biểu hiện đáng kể và thu nhận được.
- một lượng protein chiếm đến 68,5% lượng protein được biểu hiện ở dạng thể vùi.