- Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới TS Hoàng Thị Mỹ Nhung – Bộ môn Tế Bào Mô Phôi và Lý Sinh, Khoa Sinh Học đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức, những kinh nghiệm quý báu, các phương pháp nghiên cứu khoa học để tôi hoàn thành luận văn này.. - Tôi xin chân thành cảm ơn tới các thầy cô giáo trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Khoa Sinh học đặc biệt là các thầy cô giáo thuộc bộ môn Tế Bào Mô Phôi và Lý Sinh đã truyền đạt cho tôi những kiến thức quý báu trong thời gian qua.. - Tế bào beta- đảo tụy Langerhans. - Mô hình bệnh ĐTĐ trên động vật thực nghiệm . - Khái lược về mô hình bệnh lý trên động vật thực nghiệm. - Streptozocin và cơ chế gây mô hình ĐTĐ typ . - Alloxan và cơ chế gây mô hình ĐTĐ typ . - Mô hình ĐTĐ typ . - Thử gây mô hình ĐTĐ typ 1 bằng STZ và Alloxan trên CNT......... - Thử tác dụng hạ glucose huyết trên CNT gây ĐTĐ typ 1 bằng STZ . - Thử tác dụng hạ glucose huyết trên CNT gây ĐTĐ typ 2 bằng STZ và chế độ giàu dinh dưỡng . - Gây mô hình ĐTĐ typ . - Gây mô hình ĐTĐ typ 1 trên CNT bằng alloxan……………………. - Gây mô hình ĐTĐ typ 1 trên CNT bằng STZ……………………….. - Thử tác dụng hạ glucose huyết của dịch chiết cây Bông ổi trên mô hình ĐTĐ typ 1 được gây bằng STZ . - Thử tác dụng hạ glucose huyết của dịch chiết cây Bông ổi trên mô hình ĐTĐ typ 2 được gây bằng STZ và chế độ ăn…………..…….. - Đã có một số các mô hình ĐTĐ được áp dụng ở Việt Nam, tuy nhiên vẫn cần có sự bổ xung nhằm mục đích hoàn thiện và phong phú các phương pháp đánh giá tác dụng hạ đường huyết của thuốc thảo dược. - Xây dựng mô hình tiểu đường (ĐTĐ) trên chuột nhắt trắng. - ĐTĐ typ 1. - ĐTĐ typ 2 Khởi phát. - Typ 1a: Chiếm 80%, thể này có các loại tự kháng thể kháng tế bào đảo tụy thoáng qua ngay từ lúc khởi đầu của bệnh. - Thường xảy ra sau khi bị nhiễm virus gây phá hủy tế bào β.. - Typ 1b: Các kháng thể kháng tế bào đảo tụy dai dẳng với hàm lượng cao. - ĐTĐ typ 2. - Những rối loạn không đồng nhất biểu hiện bằng giảm nhạy cảm với insulin ở gan, cơ vân, mô mỡ và sự suy chức năng của của tế bào β, dẫn tới rối loạn bài tiết insulin. - Nếu vượt quá 8,9 mmol/L (160mg/dl) thì glucose bị đào thải qua thận, nếu giảm xuống dưới 3,3 mmol/L (60mg/dl) thì các tế bào thiếu năng lượng, có thể dẫn tới hôn mê.. - Insulin do tế bào β của đảo tụy Langerhans tiết ra có tác dụng làm giảm glucose máu. - Có tác dụng làm tăng glucose máu ã Adrenalin: kích thích tạo AMP vòng của tế bào đích, tăng hoạt hóa enzym phosphorylase ở gan làm tăng thoái hóa glucogen tạo glucose. - ã Glucocorticoid: ngăn cản glucose thấm vào tế bào (trừ tế bào não). - Kiểm soát tiết insulin trong tế bào beta. - Trung tâm A: gồm những tế bào thần kinh, không có mặt của insulin vẫn thu nhận được glucose từ máu. - Trung tâm này đại diện cho các tế bào không cần insulin vẫn thu nhận được glucose như: tế bào não, gan, hồng cầu. - Trung tâm B: Đại diện cho các tế bào còn lại của cơ thể, phải có insulin mới thu nhận được glucose. - Các tế bào loại này sử dụng được thể ceton như là một nguồn năng lượng bổ xung quan trọng. - Khi thiếu insulin, trung tâm B sẽ huy động mọi cơ chế nội tiết làm tăng glucose máu, đủ thấm vào tế bào nhờ sự chênh lệch lớn về nồng độ glucose trong và ngoài tế bào. - Các giai đoạn trong ĐTĐ typ 1:. - Tổn thương chức năng tế bào β đảo tụy. - Đái tháo đường lâm sàng, phá hủy hoàn toàn hoặc gần như hoàn toàn tế bào β đảo tụy. - Insulin gắn vào phần thụ thể α, kích thích tyrosin kinase của thụ thể β trong tế bào, khởi động chuỗi phản ứng làm tăng tính thấm màng tế bào với glucose, giúp glucose vận chuyển vào tế bào nhanh hơn. - Các nhóm sulfonylurea: gắn vào các thụ thể của nó ở các tế bào β đảo tụy làm chẹn kênh K, gây khử cực màng tế bào. - Kênh Ca2+ phụ thuộc điện thế mở ra cho phép Ca2+ vào trong tế bào. - Nồng độ Ca2+ trong tế bào tăng khởi động vận chuyển các hạt chứa insulin đến bề mặt tế bào và giải phóng insulin ra ngoài. - Nhóm Nateglinid (Starlig): Trong cơ thể nateglinid gắn vào thụ thể đặc hiệu (SUR 1) ở tế bào beta đảo tụy làm chẹn kệnh Ca2+, Ca2+ từ ngoài vào trong tế bào kích thích giải phóng insulin. - Cải thiện khả năng hấp thu glucose ở các tế bào đích (tế bào cơ và tế bào mỡ). - Tác động trực tiếp lên các chất vận chuyển (GLUT1 và GLUT4) tăng khả năng vận chuyển glucose vào tế bào.. - Acarbose là thuốc ức chế enzym α- glucosidase của tế bào niêm mạc ruột. - Mô hình bệnh ĐTĐ trên động vật thực nghiệm 1.2.1. - Mô hình động vật là mô hình mà ở đó động vật được gây bệnh hoặc tổn thương tương tự như trên người. - Những điều kiện thử nghiệm này thường được gọi là mô hình bệnh lý trên động vật. - Việc sử dụng các mô hình động vật cho phép các nhà nghiên cứu thực hiện các thử nghiệm tiền lâm sàng, để bảo đảm an toàn cho các nghiên cứu lâm sàng.. - Mô hình động vật thường được sử dụng trong nghiên cứu y sinh học (nghiên cứu về cơ chế bệnh sinh, hoặc trong chẩn đoán, điều trị hoặc phát triển các thuốc nghiên cứu mới).. - Các mô hình bệnh lý trên động vật có thể có bản chất tự nhiên hoặc được gây ra bằng các tác nhân vật lý, hóa học hoặc sinh học. - Dùng metrazol (pentylenetetrazol) trong mô hình bệnh động kinh.. - Làm tắc động mạch não giữa để gây mô hình bệnh đột quỵ.. - Tiêm virus hoặc vi khuẩn gây mô hình nhiễm khuẩn hoặc các bệnh cúm.. - Chọn lọc di truyền chuột NOD gây mô hình ĐTĐ đường.. - Dùng Plasmodium yoelii gây mô hình bệnh sốt rét.. - Việc nghiên cứu và ứng dụng các mô hình bệnh lý trên các loài động vật (khỉ, chó, mèo, thỏ, chuột cống, chuột nhắt trắng…) đã trở nên phổ biến đặc biệt là trong nghiên cứu y dược học. - Một số các lĩnh vực khác cũng sử dụng mô hình động vật cho các nghiên cứu của mình như tâm lý học, xã hội học quan sát hành vi động vật (mô hình hành vi).. - Hiện nay các nhà nghiên cứu đã phát triển rất nhiều các phương pháp khác nhau trên cùng một loại mô hình bệnh nhằm tìm ra các mô hình phù hợp nhất và gần nhất với các trường hợp bệnh lý trên người. - Mô hình ĐTĐ typ 1. - ĐTĐ typ 1 là do sự tổn thương tế bào beta đảo tụy (do tự miễn) các mô hình ĐTĐ cũng được phát triển dựa trên nguyên tắc trên. - Mô hình ĐTĐ typ 1 được xây dựng bằng nhiều con đường nhưng cơ bản có 2 phương pháp phổ biến. - Gây ĐTĐ typ 1 bằng hóa chất:. - Có 5 mô hình trên động vật được gây ĐTĐ typ 1 bằng phương pháp lai tạo và chọn lọc giống:. - Trong khuôn khổ cho phép của luận văn, chúng tôi tiến hành nghiên cứu gây mô hình bệnh ĐTĐ typ 1 bằng hóa chất (alloxan và streptozocin). - a) Streptozocin và cơ chế gây mô hình ĐTĐ typ 1 Streptozocin còn có tên khác là Streptozotocin, N-(Methylnitrosocarbamoyl. - Giữa thập niên 60 (TK20) các nhà khoa học đã phát hiện ra tính độc chọn lọc của STZ đối với các tế bào beta đảo tụy, trong khi các tế bào này lại điều tiết nồng độ glucose huyết bằng cách tiết ra các hormon insulin. - Đây là một gợi ý sử dụng thuốc để gây mô hình ĐTĐ typ 1, và điều trị ung thư tụy. - Năm 1982, FDA đã trao giấy phép lưu hành thuốc điều trị ung thư tế bào đảo tụy dưới tên thương mại là Zanosar. - STZ chủ yếu được sử dụng trong điều trị ung thư tế bào đảo tụy di căn. - STZ cũng hiệu quả trong điều trị u ác tính tế bào ưa bạc.. - STZ được ứng dụng để gây mô hình ĐTĐ typ 1 trên động vật thực nghiệm nhằm nghiên cứu các thuốc, chế phẩm điều trị bệnh ĐTĐ.. - Khi được hấp thụ vào các tế bào beta, STZ được phân cắt thành glucose và một nửa còn lại là methylnitrosourea. - Vì có tính alkyl hóa nên tác động tới các đại phân tử sinh học (ADN) dẫn tới phá hủy tế bào beta. - Đích hướng tới là các ADN ty thể, qua đó tác động đến các chức năng tín hiệu quá trình trao đổi chất trong ty thể của tế bào beta, điều này cũng giải thích STZ có khả năng ức chế tiết insulin.. - Tính chọn lọc của STZ với tế bào beta: STZ là chất đồng đẳng nitrosourea trong đó N- methyl-N-nitrosourea được liên kết với C-2 của hexose. - STZ được tích lũy chọn lọc trong tế bào beta đảo tụy qua kênh vận chuyển glucose GLUT2 ái lực thấp nằm trong màng sinh chất. - Do vậy những tế bào không biểu hiện kênh vận chuyển glucose sẽ kháng với STZ. - Quan sát này cũng giải thích độc tính của STZ lớn hơn so với N-methy-N-nitrosourea trong các tế bào xuất hiện kênh vận chuyển GLUT2 kể cả khi 2 chất này đều alkyl hóa ADN tương tự nhau.. - Tính độc của STZ đối với tế bào beta: tính độc của STZ phụ thuộc vào hoạt tính alkyl hóa ADN của nhóm methylnitrosourea, đặc biệt là vị trí O6 của guanine. - Sự suy kiệt trong dự trữ năng lượng của tế bào góp phần làm tế bào beta bị phân hủy. - Các dạng oxy phản ứng (reactive oxygen species) này cũng tập trung phá hủy ADN dẫn tới sự huy động các enzym sửa chữa ADN và mất NAD+ ,giảm dự trữ ATP dẫn tới sự phá hủy tế bào beta. - Cũng có nghiên cứu chứng minh được sự giảm NAD+ cũng dẫn tới sự ức chế sinh tổng hợp và tiết insulin ở tế bào beta. - b) Alloxan và cơ chế gây mô hình ĐTĐ typ 1. - Năm 1943, Dunn, Sheehan và McLetchie (Trường Đại học Glasgow) báo cáo alloxan gây ra sự phá hủy tế bào đảo tụy ở thỏ. - Alloxan được ứng dụng để gây mô hình ĐTĐ typ 1 trên động vật thực nghiệm nhằm nghiên cứu các thuốc, chế phẩm điều trị bệnh ĐTĐ. - *Cơ chế hoạt động: Cấu tạo của alloxan gần giống với cấu tạo phân tử glucose do đó alloxan được vận chuyển vào tế bào beta nhờ protein vận chuyển glucose GLUT2 (Glucose transporter 2). - Các phản ứng tạo ra các dạng oxy hoạt động gây độc tế bào β. - Những gốc hydroxyl này gây nên sự phân hủy tế bào beta.[35] 1.2.3. - Mô hình ĐTĐ typ 2. - Gây mô hình ĐTĐ typ2 thường dựa trên chế độ dinh dưỡng, hóa chất và yếu tố di truyền (gen), kết quả làm tăng glucose huyết và kháng insulin ở mô ngoại biên. - Mục đích của phương pháp này là tạo mô hình thiếu hụt và kháng insulin, mô phỏng theo kiểu ĐTĐ typ 2 ở người. - Gần đây, một mô hình gây ĐTĐ typ 2 được phát triển bằng cách kết hợp giữa STZ và nicotinamid điều trị trên chuột cống. - Do nicotinamide là một chất chống oxi hóa bảo vệ tế bào bằng hoạt tính dọn gốc tự do (STZ sinh ra gốc tự do) và hạn chế tổn thương tế bào beta đảo tụy trong ĐTĐ typ 2. - Trong luận văn này chúng tôi nghiên cứu gây mô hình bệnh ĐTĐ typ 2 trên CNT bằng chế độ dinh dưỡng cao cùng với hóa chất streptozocin liều thấp. - Phương pháp 2.3.1 Thử nghiệm gây mô hình ĐTĐ typ 1. - Tế bào β đảo tụy bị phá vỡ thì sau một thời gian chuột chết. - ã Liều gây mô hình ĐTĐ ổn định trong thời gian dài sẽ giúp đánh giá thuốc nghiên cứu một cách khách quan và hiệu quả.. - [35] a) Gây mô hình ĐTĐ typ 1 trên CNT bằng alloxan