- TÌM HIỂU SỰ BIẾN ĐỘNG CỦA CÁC YẾU TỐ MIỄN DỊCH KHÔNG ĐẶC HIỆU TRÊN CÁ TRA (PANGASIANODON HYPOPHTHALMUS) NHIỄM VI KHUẨN EDWARDSIELLA. - Đề tài được thực hiện với mục tiêu đánh giá sự biến động về huyết học và khả năng diệt khuẩn của huyết thanh trên cá tra nhiễm bệnh mủ gan. - Cá tra có dấu hiệu bệnh mủ gan được thu tại các ao nuôi cá tra giống thâm canh thuộc các tỉnh Sóc Trăng, Hậu Giang, Cần Thơ. - Có 57 mẫu được thu ở 5 ao, trong đó có 31 mẫu cá bệnh và 26 mẫu cá khỏe.. - Kết quả phân tích các chỉ tiêu huyết học cho thấy số lượng hồng cầu giảm mạnh ở cá bị bệnh mủ gan (p<0,05), đồng thời có sự xuất hiện của hồng cầu nhiều nhân và hồng cầu không nhân. - Bạch cầu trung tính tăng trong khi tiểu cầu và tế bào lympho và tổng lượng bạch cầu lại giảm có ý nghĩa thống kê (p<0,05) trên cá bệnh. - Khả năng diệt khuẩn của huyết thanh cá bệnh cao hơn cá khỏe.. - Các bệnh thường gặp trên cá tra như: bệnh do ký sinh trùng, vi khuẩn, virút, bệnh do môi trường, dinh dưỡng…trong đó bệnh mủ gan hay còn gọi là gan thận mủ do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây ra đang rất phổ biến, ảnh hưởng lớn đến giai đoạn cá hương, cá giống và cả cá nuôi thương phẩm với tỉ lệ chết cao có thể đến 90%, gây thiệt hại lớn cho người nuôi (Từ Thanh Dung et al., 2004). - Đã có rất nhiều tác giả nghiên cứu về đặc điểm sinh hóa, khả năng gây bệnh cũng như sự đề kháng thuốc của vi khuẩn E. - ictaluri trên cá da trơn nói chung và cá tra nói riêng nhưng vẫn chưa có nhiều nghiên cứu về sự biến đổi huyết học trên cá tra bị gan thận mủ. - Trong báo cáo này các yếu tố miễn dịch không đặc hiệu trên cá tra nuôi trong ao bị bệnh mủ gan gồm sự biến động về huyết học và khả năng diệt khuẩn của huyết thanh được tìm hiểu nhằm cung cấp cơ sở khoa học cho các nghiên cứu phòng bệnh vi khuẩn ở cá tra.. - Mỗi lần thu 10 con/ ao, trong đó có 5 cá khỏe và cá bệnh.. - Mẫu máu cá được thu và phân lập vi khuẩn tại hiện trường. - Vi khuẩn được định danh qua các chỉ tiêu: nhuộm gram, phản ứng oxidase, catalase, tính di động, phản ứng decarboxylase, khả năng lên men và oxi hóa đường. - Định lượng hồng cầu (Natt &. - Mật độ hồng cầu được xác định bằng buồng đếm hồng cầu thông qua sự quan sát dưới kính hiển vi quang học (40X). - Mật độ hồng cầu được tính theo công thức:. - C x 10 x 5 x 200 (tb/mm 3 ) với C là tổng số hồng cầu trên 5 vùng đếm.. - Định lượng và định loại các tế bào bạch cầu. - Định loại các tế bào máu theo Chinabut et al. - Tổng bạch cầu (TBC) (Hrubec et al., 2000). - Đếm tổng số hồng cầu và bạch cầu trên 1.500 tế bào trên mẫu nhuộm. - Tổng bạch cầu được xác định bằng công thức: TBC (tb/mm 3. - (số bạch cầu x mật độ hồng cầu trên buồng đếm)/số hồng cầu trên mẫu. - Từng loại bạch cầu (Hrubec et al., 2000). - Đếm tổng số bạch cầu bằng 200 tế bào. - Mật độ từng loại bạch cầu (tb/mm 3. - Phương pháp xác định khả năng diệt khuẩn của huyết thanh (Phuong et al., 2007). - Rút lấy phần huyết thanh (dịch trong) bên trên cho vào 1 eppendorf khác (đã thanh trùng) và trữ ở -80°C cho đến khi phân tích.. - Pha loãng huyết thanh 10 lần trong nước muối sinh lý khi sử dụng. - Cho 100µl dung dịch huyết thanh vào các giếng trừ control và blank thì cho NB. - Vi khuẩn được nuôi tăng sinh 48h trong nutrient broth (NB) ở 28°C và pha loãng đến mật độ 10 4 cfu/ml. - 30µl vi khuẩn được cho vào các giếng trừ blank cho bằng NB (TSB). - Phần trăm vi khuẩn sống sót được tính bằng công thức:. - Cá bệnh nổi trên mặt nước, bơi lờ đờ cặp mé, màu sắc nhợt nhạt, giảm ăn. - Hình 1: (a) Dấu hiệu bên ngoài cá tra bị bệnh gan thận mủ Các đám xuất huyết. - (b) Xoang nội quan cá tra bị gan thận mủ. - Cá bệnh dạ dày trướng hơi, mạch máu trương to, gan màu sắc nhạt, thận sưng, có dịch lỏng hơi đỏ bên trong xoang nội quan. - Đôi khi có hiện tượng nhũng thận ở cá bệnh nặng. - 3.3 Kết quả phân lập định danh vi khuẩn. - Phân lập được 24 dòng vi khuẩn từ 31 mẫu cá bệnh. - Vi khuẩn đều có dạng hình que và gram âm. - 3.4 Kết quả định loại và định lượng các tế bào máu Hồng cầu. - Kết quả này tương tự với báo cáo của Phan Thị Hừng (2004), Phạm Thanh Hương (2006) trên cá tra bị bệnh vàng da, ngoài ra cũng giống với nghiên cứu của Benli &. - Cá khỏe Cá bệnh. - Hình 2: Biểu đồ sự thay đổi số lượng hồng cầu ở cá khỏe và cá bệnh mủ gan. - Bên cạnh những thay đổi về số lượng còn ghi nhận được những biến đổi bất thường về hình dạng hồng cầu ở cá bệnh là có sự xuất hiện của những hồng cầu không nhân và hồng cầu nhiều nhân (Hình 3a và 3b). - Theo Hibiya (1982), dưới điều kiện sinh lý thay đổi xuất hiện những hồng cầu không nhân ở máu ngoại vi, nó bắt màu tương tự như hồng cầu trưởng thành, hình dạng khá tròn và kích cỡ khoảng ½ hồng cầu trưởng thành, và đôi khi xuất hiện dị thường ở nhân hồng cầu trưởng thành dẫn đến sự phân chia nhân thành 2-3 phần. - Hình 3: (a) Hồng cầu hai nhân. - (b) Hồng cầu không nhân. - Bạch cầu. - Có 4 loại bạch cầu được quan sát gồm: lympho, bạch cầu trung tính, bạch cầu đơn nhân và tiểu cầu, không tìm thấy bạch cầu toan tính và bạch cầu kiềm tính. - Hình dạng của các loại bạch cầu không có sự khác biệt giữa cá khỏe và cá bệnh (Hình 4).. - (b): Bạch cầu trung tính. - (d) Bạch cầu đơn nhân. - Kết quả định lượng tổng bạch cầu ở cá khỏe là 9,2x10 4 tế bào/mm 3 , còn ở cá bệnh là 3,9x10 4 tế bào/mm 3 (giảm 2,37 lần), tế bào lympho giảm 3,15 lần, tiểu cầu giảm 3,47 lần. - Tuy nhiên, số lượng bạch cầu đơn nhân và bạch cầu trung tính ở cá bệnh lại tăng. - Chỉ riêng bạch cầu đơn nhân cho kết quả không có sự khác biệt thống kê nhưng ở cá bệnh số lượng vẫn cao hơn cá khỏe đến 1,84 lần (Bảng 1 và Hình 5).. - Bảng 1: Sự biến đổi số lượng các loại bạch cầu ở cá khỏe và cá bệnh. - Chỉ tiêu (x10 3 /mm 3 ) Cá khỏe Cá bệnh Tổng bạch cầu. - Bạch cầu trung tính Bạch cầu đơn nhân Tiểu cầu. - Tổng bạch cầu. - Lympho Tiểu cầu Bạch cầu đơn nhân. - Bạch cầu trung tính. - Loại tế bào Số lượng (tế bào/mm3). - Hình 5: Sự biến đổi số lượng các loại bạch cầu ở cá khỏe và cá bệnh. - Trong 31 mẫu cá bệnh thu được chỉ có khoảng 7 mẫu có lượng tổng bạch cầu tăng so với cá khỏe (chiếm 22,5%) nhưng tăng không đáng kể. - Khi cá bệnh nặng, thận sưng đồng thời bị nhũng do sung huyết một phần có thể do tích tụ nước trong thận mà không thể đào thải được do hệ thống tiểu cầu thận và ống thận bị hủy hoại. - Kết quả thận bị hoại tử mất chức năng chủ yếu như là bài tiết chất thải trong quá trình trao đổi chất, quá trình trao đổi chất đặc biệt tăng mạnh khi cơ thể có sự viêm nhiễm do huy động các tổ chức nhằm đào thải các tác nhân gây bệnh như tăng cường sản sinh các loại bạch cầu và đại thực bào. - Tỳ tạng bị hoại tử dẫn đến mất khả năng tạo hồng cầu và phá hủy hồng cầu già cũng như không thể sản xuất các tế bào lympho và bạch cầu, mô tạo máu bị phá hủy làm mất chức năng cung cấp máu cho cơ thể (Nguyễn Quốc Thịnh, 2002). - Đây chính là nguyên nhân làm cho số lượng hồng cầu và tổng bạch cầu đều giảm. - Theo nghiên cứu của Ranzani-Paiva (2004), số lượng tiểu cầu cũng giảm nhanh khi có sự xuất hiện của vi khuẩn trong các tổ chức.. - Trong máu và dịch gian bào, vi khuẩn gặp phải một hàng rào rất quan trọng trong cơ chế bảo vệ không đặc hiệu đó là các tế bào thực bào gồm có bạch cầu trung tính và các đại thực bào (Vũ Triệu An, 2003), do đó khi bị vi khuẩn tấn công, hệ miễn dịch không đặc hiệu của cá hoạt động làm cho số lượng các tế bào này tăng nhanh chóng. - Bên cạnh sự thay đổi về số lượng bạch cầu, trên những lame nhuộm mẫu máu của cá bệnh còn xuất hiện những vùng tập trung rất nhiều vi khuẩn (hình 6). - Tại những vị trí tập trung nhiều vi khuẩn các tế bào máu thường bắt màu không tốt và khó phân loại được. - Đồng thời còn có sự xuất hiện của những đại thực bào chứa vi khuẩn. - (2000) cũng có báo cáo về sự hiện diện của vi khuẩn trong đại thực bào. - Khả năng thực bào của đại thực bào lớn hơn rất nhiều so với bạch cầu trung tính, mỗi đại thực bào có khả năng thực bào 100 vi khuẩn, hồng cầu già, bạch cầu đã chết, ký sinh trùng và mô hoại tử (Trần Liên Minh, 2004, trích dẫn bởi Phạm Thanh Hương, 2006). - Tuy nhiên, khi số lượng vi khuẩn tồn tại trong cơ thể quá lớn, hệ miễn dịch của cá sẽ bị tổn thương làm cá không thể chống chịu được với mầm bệnh (Crumlish et al., 2000) đồng thời khả năng thực bào cũng sẽ giảm khi độc lực của vi khuẩn càng cao (Vũ Triệu An, 2003), kết quả dẫn đến sự nhiễm trùng máu, làm giảm sức đề kháng của cơ thể và gây chết cho cá.. - Hình 6: (a) Vi khuẩn trong máu cá. - (b) Đại thực bào chứa vi khuẩn. - 3.5 Khả năng diệt khuẩn của huyết thanh. - Chọn ngẫu nhiên 4 mẫu huyết thanh của cá khỏe và 4 mẫu huyết thanh của cá bệnh để tiến hành đo khả năng diệt khuẩn của huyết thanh với 3 chủng vi khuẩn A1, S2, T4. - Bảng 2: Phần trăm vi khuẩn sống sót sau khi tương tác với huyết thanh. - K 1 : huyết thanh cá khỏe 1 B 1 : huyết thanh cá bệnh 1 A1, S2, T4: Tên các chủng vi khuẩn K 2 : huyết thanh cá khỏe 2 B 2 : huyết thanh cá bệnh 2. - K 3 : huyết thanh cá khỏe 3 B 3 : huyết thanh cá bệnh 3 K 4 : huyết thanh cá khỏe 4 B 4 : huyết thanh cá bệnh 4. - Kết quả có 77,8% vi khuẩn thuộc chủng A1 còn sống sót sau khi tương tác với. - các giếng còn lại vi khuẩn đều phát triển quá mức. - Điều này có thể do huyết thanh ở các giếng đó đã hoạt động không mạnh trong việc tiêu diệt vi khuẩn vì huyết thanh đã được trữ khá lâu trong tủ -80°C, đồng thời độc lực của vi khuẩn lại cao.. - Kết quả diệt khuẩn của huyết thanh cá khỏe 1, cá bệnh 3 và cá bệnh 4 lần lượt đối với các chủng A1 và S2 cho thấy khả năng diệt khuẩn của cá bệnh cao hơn á khỏe.. - Phân lập được 24 dòng vi khuẩn từ thận của cá tra bị gan thận mủ trong đó có 23 dòng định danh là E. - Có sự thay đổi rõ rệt về số lượng các tế bào máu giữa cá tra khỏe và cá tra bị mủ gan. - Đặc biệt còn ghi nhận được sự xuất hiện của hồng cầu đa nhân và hồng cầu không nhân. - Ngoài ra, sự sụt giảm của tổng bạch cầu ở cá bệnh cũng là một dấu hiệu đáng lưu ý, trong đó tế bào lympho của cá bệnh giảm 3,15 lần so với cá khỏe. - Tuy tế bào bạch cầu trung tính và bạch cầu đơn nhân ở cá bệnh lại tăng lên có ý nghĩa. - Thông qua phần trăm sống sót của vi khuẩn sau khi cho tương tác với huyết thanh nhận thấy huyết thanh của cá bệnh có khả năng diệt khuẩn cao hơn cá khỏe.. - Bước đầu nghiên cứu mô bệnh học bệnh đốm trắng trong nội tạng cá tra (Pangasius hypophthalmus). - Xác định một số yếu tố huyết học trên cá tra bệnh vàng da ở tỉnh Cần Thơ. - Nghiên cứu cấu trúc mô và sự biến động số lượng tế bào hồng cầu trên cá tra (Pangasius hypophthalmus) bị bệnh vàng da. - Xác định vi khuẩn gây bệnh trắng gan trên cá tra