- TỐI ƯU HÓA VÀ ỨNG DỤNG QUI TRÌNH PHÂN TÍCH CÁC CHỈ TIÊU MIỄN DỊCH TỰ NHIÊN Ở. - (2) Protocols for analysis of phenoloxidase, respiratory burst and superoxide dismutase activities by creating colour complexes and measured by absorb wavelength of 490 nm, 630 nm and 560 nm, respectively. - The obtained result revealed a significant change (P<0.05) in number of haemocytes as well as activities of phenoloxidase, respiratory burst and superoxide dismutase. - Các qui trình xác định một số chỉ tiêu miễn dịch tự nhiên trên tôm càng xanh được thực hiện có điều chỉnh. - Các qui trình này bao gồm: (1) qui trình xác định tổng bạch cầu và định loại bạch cầu trong máu tôm bằng buồng đếm hồng cầu và nhận dạng được hai loai tế bào bạch cầu có hạt và không hạt. - (2) các qui trình xác định hoạt tính của phenoloxidase, respiratory burst và superoxide dismutase trên cơ sở tạo ra các phức hợp màu và hấp thụ ở các bước sóng tương ứng 490 nm, 630 nm và 560 nm. - Các qui trình sau khi chuẩn hóa được ứng dụng để xác định đáp ứng miễn dịch tự nhiên ở tôm càng xanh cảm nhiễm vi-rút gây bệnh đốm trắng (WSSV). - Kết quả phân tích cho thấy có sự thay đổi có ý nghĩa (P <. - 0.05) của các loại bạch cầu, hoạt tính của phenoloxidase, hoạt tính respiratory burst và superoxide dismutase. - Vì thế, các qui trình có thể được ứng dụng để nghiên cứu đáp ứng miễn dịch trên tôm.. - Từ khóa: miễn dịch tự nhiên, định loại bạch cầu, phenoloxidase, respiratory burst, superoxide dismutase, Macrobrachium rosenbergii. - Một trong những biện pháp có thể hạn chế ảnh hưởng của dịch bệnh và tác động của môi trường là tăng cường sức đề kháng cho tôm nuôi dựa trên những cơ chế đáp ứng miễn dịch của chúng đối với những yếu tố trên. - Tuy nhiên, nghiên cứu đáp ứng miễn dịch của tôm với các yếu tố lây bệnh truyền nhiễm và các yếu tố môi trường nuôi ở nước ta còn rất hạn chế. - Các phương pháp phân tích các chỉ tiêu miễn dịch trên tôm chưa được sử dụng phổ biến. - Trong quá trình thực hiện đề tài nghiên cứu khoa học về “Sự tự vệ của tôm chống lại vi- rút đốm trắng” tại Trường Đại học Cần Thơ, chúng tôi đã thực hiện (có điều chỉnh) một số qui trình phân tích các chỉ tiêu miễn dịch ở tôm gồm: qui trình định loại bạch cầu (theo Cornick và Stewart, 1978. - Moullac et al., 1997), xác định hoạt tính phenoloxidase (theo Herández-López et al., 1996), khả năng tạo ra hợp chất kháng khuẩn superoxide anion. - (hay hoạt tính respiratory burst) (theo Song và Hsieh, 1994) và superoxide dismutase (theo Beauchamp và Fridovich, 1971) và ứng dụng nghiên cứu đáp ứng miễn dịch của tôm càng xanh với vi-rút gây bệnh đốm trắng.. - Trong bài báo này, chi tiết và khả năng ứng dụng của các qui trình được trình bày nhằm cung cấp thông tin kỹ thuật làm cơ sở cho các nghiên cứu miễn dịch ở tôm.. - Trước khi được sử dụng để thực hiện nghiên cứu, 3 mẫu tôm được thu ngẫu nhiên để kiểm tra xác định tôm không bị nhiễm các mầm bệnh ký sinh trùng và vi-rút gây bệnh đục cơ (MrNV/XSV).. - Dịch chiết được xác định dương tính với WSSV bằng phương pháp PCR (OIE, 2006).. - 2.2.2 Phương pháp xác định tổng số bạch cầu và định loại bạch cầu. - Tổng số bạch cầu được đếm theo phương pháp của Le Moullac et al. - Mật độ tế bào máu được xác định bằng buồng đếm hồng cầu và quan sát dưới kính hiển vi (40X). - Qui trình thực hiện tiêu bản, nhuộm và định loại bạch cầu được thực hiện theo phương pháp của Cornick và Stewart (1978). - 2.2.3 Phương pháp xác định hoạt tính của Phenoloxidase (PO). - Hoạt tính của Phenoloxidase được xác định dựa theo phương pháp của Herández- López et al. - Mẫu máu sau khi thu (như ở mục 2.2.1) được ly tâm 2000 vòng/phút trong 10 phút ở 4°C, rồi loại bỏ phần dịch phía trên. - Đọc kết quả sau 1 phút hoặc đến khi OD trong mẫu đối chứng khoảng từ 0,02-0,05.. - 2.2.4 Phương pháp xác định hoạt tính respiratory burst (RES). - Hoạt tính respiratory burst (RES) được thực hiện theo Song và Hsieh (1994).. - Nguyên tắc cơ bản của phương pháp là dựa vào sự biến đổi của nitroblue tetrazolium (NBT) trên mẫu máu được cố định để định lượng hoạt tính respiratory burst. - 2.2.5 Hoạt tính của superoxide dismutase. - Hoạt tính của superoxide dismutase (SOD) được xác định dựa theo phương pháp của Beauchamp và Fridovich (1971). - nghiền rồi ly tâm 5000 vòng/phút trong 5 phút ở 4°C. - Đọc kết quả sau 1 phút hoặc đến khi độ hấp thụ trong mẫu đối chứng khoảng 0.2-0.25.. - 2.2.6 Bố trí thí nghiệm xác định các chỉ tiêu miễn dịch tự nhiên của tôm. - Tôm sau khi được bố trí vào bể 2 ngày thì thu 2 con/bể để lấy máu phân tích các chỉ tiêu miễn dịch. - Sau khi gây cảm nhiễm ngày, thu 2 con tôm/bể để lấy máy xác định các chỉ tiêu miễn dịch.. - 2.2.7 Phương pháp phân tích thống kê. - Số liệu thu được được phân tích bằng thống kê ANOVA một nhân tố (P <. - 3 KẾT QUẢ. - 3.1 Định loại bạch cầu. - Kết quả thực hiện tiêu bản máu và nhuộm để xác định các loại bạch cầu theo phương pháp của Cornick và Stewart (1978) cho thấy mật độ bạch cầu rất thưa và không sạch (Hình 1A). - Qui trình được điều chỉnh bằng cách dùng ống tiêm (có chứa 200 µl formalin-AS pH 4.6) rút 200 µl máu tôm cho vào ống eppendorf 1.5ml, trộn đều, ly tâm 5000 vòng/phút trong 5 phút. - Mục đích của các bước này là để làm tăng mật độ và rửa tế bào bạch cầu trước khi thực hiện tiêu bản máu và nhuộm để quan sát các loại bạch cầu chính xác hơn (Hình 1B).. - Trước, B: Sau khi điều chỉnh qui trình. - Theo Söderhäll và Cerenius (1992), bạch cầu đóng vai trò quan trọng trong đáp ứng miễn dịch của giáp xác. - Chúng có 3 dạng bạch cầu là bạch cầu không hạt, bán hạt và có hạt. - Tùy loại bạch cầu mà chúng có thể có chức năng khác nhau trong hệ miễn dịch của giáp xác như thực bào, phong tỏa và hình thành khối u, melanin hóa hay làm độc tế bào. - Sự thay đổi tăng hay giảm thành phần các loại bạch cầu là một trong các chỉ tiêu để đánh giá đáp ứng miễn dịch tự nhiên ở tôm.. - 3.2 Hoạt tính của Phenoloxidase. - Khi thực hiện qui trình xác định hoạt tính của Phenoloxidase (PO) theo Herández- López et al. - (1996) kết quả không cho kết tủa sau khi ly tâm 100 µl máu 2000 vòng/phút trong 10 phút ở 4°C. - Khi thể tích máu được tăng lên 200 µl và được ly tâm 2000 vòng/phút trong 10 phút ở 4°C cũng không thấy xuất hiện kết tủa trong mẫu phân tích. - Qui trình sau đó được điều chỉnh bằng cách tăng vận tốc ly tâm mẫu máu lên 5000 vòng/phút trong 10 phút ở 4°C thì thấy xuất hiện kết tủa và khi thêm 50 µl L- DOPA vào mẫu thì thấy có sự chuyển đổi màu (Hình 2 và 6). - Khi tăng thể tích mẫu máu lên 200 µl thì cho kết quả rõ và tốt hơn. - Kết quả này cho thấy khi ly tâm ở vận tốc 2000 vòng/phút thì không kết tủa tế bào bạch cầu tôm càng xanh dẫn đến không thể xác định được hoạt tính của phenoloxise trong mẫu cần phân tích.. - Hệ thống Phenoloxidase (ProPO) là một thành phần quan trọng của hệ thống miễn dịch tự nhiên tôm. - Vì thế, hoạt tính của Phenoloxidase là một trong chỉ tiêu cần thiết để đánh giá đáp ứng miễn dịch tự nhiên ở tôm.. - Hình 2: Sơ đồ qui trình xác định hoạt tính của Phenoloxidase sau điều chỉnh. - 3.3 Hoạt tính Respiratory burst. - Kết quả thực hiện qui trình xác định hoạt tính respiratory burst (RES) theo Song và Hsieh (1994) không ổn định, mặt dù phân tích trên cùng mẫu tôm nhưng lại có sự thay đổi màu sắc khác nhau (Hình 3a). - Qui trình được điều chỉnh bằng cách tăng số vòng ly tâm thành 5000 vòng/phút giống như khi phân tích hoạt tính phenoloxidase. - Kết quả cho thấy có sự ổn định giữa các lần lặp lại trong cùng một mẫu (Hình 3b). - Qui trình xác định hoạt tính RES được mô tả như ở hình 4 và 6.. - Hình 3: Kết quả phân tích Respiratory burst trên cùng một mẫu máu của tôm. - Sau khi điều chỉnh (A, B, C, D: phân tích lặp lại 4 lần. - Hình 4: Qui trình xác định hoạt tính Respiratory burst sau điều chỉnh. - 3.4 Hoạt tính của Superoxide dismutase. - Trong số các mẫu cơ, gan tụy (Beauchamp and Fridovich, 1971) và máu tôm (Campa-Córdova et al., 2002) khi sử dụng để phân tích hoạt tính của Superoxide dismutase (SOD) thi mẫu cơ và gan tụy cho kết quả sai khác rất lớn do quá trình nghiền và ly tâm mẫu không kết tủa được mẫu. - Trong khi đó, sử dụng mẫu máu tôm để phân tích thì kết quả ổn định hơn. - Qui trình được điều chỉnh bằng cách cho 50 µl máu (rút bằng ống tiêm có chứa 50 µl dung dịch AS. - Với qui trình này, thể tích đệm phosphate và dung dịch SOD được giảm xuống 500 µl nên giảm được chi phí phân tích.. - Hình 5: Qui trình xác định hoạt tính Superoxide dismutase burst sau điều chỉnh. - Hình 6: Đĩa 96 giếng chứa mẫu phân tích Phenoloxidase, Superoxide dismutase và Respiratory burst. - 3.5 Ứng dụng xác định các chỉ tiêu miễn dịch tự nhiên ở tôm càng xanh. - Mẫu được sử dụng là những mẫu tôm càng xanh trước và sau ngày gây cảm nhiễm với WSSV để theo dõi sự biến đổi đáp ứng miễn dịch tự nhiên của tôm. - Kết quả phân tích (Bảng 1) cho thấy đã xác định được tổng bạch cầu, bạch cầu có hạt, bạch cầu không hạt, hoạt tính của phenoloxidase, hoạt tính respiratory burst và superoxide dismutase tại những thời điểm thu mẫu khác nhau.. - Bảng 1: Sự thay đổi các chỉ tiêu miễn dịch ở tôm càng xanh cảm nhiễm WSSV. - Ngày thu mẫu 0 ngày 1 ngày 3 ngày 5 ngày 10 ngày 15 ngày Tổng bạch cầu. - (x10 4 tb/ml) 420 a ±14 391 a ±9 439 a ±27 406 a ±30 395 a ±14 375 a ±14 Bạch cầu có. - 83.0 a ±1.4 86.5 b ±2.1 87.5 bc ±0.7 72.5 d ±0.7 69.0 e ±0.0 90.0 c ±1.4 Bạch cầu. - Tôm càng xanh sau khi tiêm WSSV không có sự khác biệt về số lượng bạch cầu khi so sánh với mẫu trước khi tiêm. - Tuy nhiên, thành phần từng loại bạch cầu ở tôm sau 1 và 3 ngày tiêm WSSV khác biệt có ý nghĩa (P <. - Đến ngày thứ 5 sau khi tiêm WSSV thì bạch cầu có hạt có xu hướng giảm và bạch cầu không hạt tăng. - Hoạt tính của phenoloxidase tăng đến ngày thứ 3 sau khi tiêm WSSV và khác biệt có ý nghĩa so với trước khi tiêm (P <. - Hoạt tính respiratory burst tăng cao chỉ sau 1 ngày tiêm WSSV và sau đó giảm dần. - Trong khi đó, hoạt tính respiratory burst khác biệt có ý nghĩa (P <. - Ngược lại hoạt tính superoxide dismutase giảm dần sau khi tiêm WSSV.. - Kết quả chuẩn hóa các qui trình phân tích các chỉ tiêu miễn dịch cho thấy đã thể hiện được những biểu hiện đặc trưng của từng chỉ tiêu. - Kết quả định loại bạch cầu đã nhận dạng được 2 loại tế bào bạch cầu là bạch cầu có hạt và bạch cầu không hạt, kết quả này phù hợp với kết quả của Moullac et al. - Các qui trình phân tích phenoloxidase, respiratory burst và superoxide dismutase cho ra kết quả tốt, trong mỗi qui trình có sự biến đổi và tác dụng của các thành phần trong phản ứng và cuối cùng cho ra các phức hợp màu đặc trưng (Hình 6). - So với các qui trình phân tích phenoloxidase (Herández-López et al., 1996), hoạt tính respiratory burst (Song và Hsieh, 1994) và superoxide dismutase (Beauchamp và Fridovich, 1971) thì các qui trình được chuẩn hóa cho thấy được những sự thay đổi trong phản ứng cũng như những phức hợp màu tạo thành.. - Các qui trình này khi được ứng dụng để nghiên cứu đáp ứng miễn dịch tự nhiên trên tôm càng xanh với WSSV cho thấy có sự thay đổi có ý nghĩa (P <. - 0.05) của đa số những chi tiêu miễn dịch. - Nồng độ phenoloxidase, respiratory burst và superoxide dismutase thay đổi trong thí nghiệm giống với kết quả nghiên cứu của Sarathi et al. - Kết quả cũng tương tự đối với nồng độ superoxide dismutase. - Tuy nhiên, so với kết quả của Sarathi et al. - (2008) thì hoạt tính respiratory burst tăng đến ngày thứ 10, sau đó bắt đầu giảm.. - Kết quả ứng dụng cho thấy các qui trình phân tích các chỉ tiêu đáp ứng miễn dịch tự nhiên bao gồm: định loại bạch cầu, hoạt tính phenoloxidase, hoạt tính respiratory burst và superoxide dismutase có thể ứng dụng để nghiên cứu đáp ứng miễn dịch trên tôm càng xanh cũng như những loài tôm khác.