- Abstract: Nghiên cứu tổng hợp các 3-hiđroxi-(N- thế)naphtalen-2-cacboxamit làm nguyên liệu điều chế cơ chất nhuộm esteraza đặc hiệu tế bào bạch cầu người. - Nghiên cứu tổng hợp các este 3-(N-thế- cacbamoyl)naphtalen-2-yl cacboxylat làm cơ chất nhuộm esteraza đặc hiệu bạch cầu người. - Xác định cấu trúc của các hợp chất điều chế được bằng các phương pháp vật lý và hóa lý hiện đại (Phổ IR, 1H- NMR và MS) và nghiên cứu mối tương quan giữa độ nhạy của phản ứng nhuộm esteraza với cấu trúc phân tử cơ chất bằng phương pháp tính hóa lượng tử. - Nghiên cứu sử dụng este 3-(N-thế- cacbamoyl)naphtalen-2-yl cacboxylat để nhuộm esteraza đặc hiệu bạch cầu người và tìm kiếm cơ chất mới có độ đặc hiệu và độ nhạy cao. - Nghiên cứu. - ảnh hưởng hiệu ứng electron các nhóm thế X, hiệu ứng không gian của các gốc N-hiđrocacbon nhóm amit thế và các gốc cacboxylat trong phân tử cơ chất đến độ nhạy và độ đặc hiệu đối với phản ứng nhuộm esteraza. - Nghiên cứu tối ưu hóa quy trình nhuộm bằng phương pháp đơn hình và ứng dụng để chế tạo bộ kít nhuộm esteraza dùng phân loại dòng tế bào trong bệnh bạch cầu người từ cơ chất tổng hợp được.. - Tổng hợp cơ chất. - Nhuộm tế bào. - Naphtol AS-D cloaxetat là một cơ chất được sử dụng rộng rãi để nhuộm esteraza đặc hiệu do có độ nhạy và độ đặc hiệu cao đối với tế bào bạch cầu dòng tuỷ so với các cơ chất khác. - thứ ba, là cơ chất dễ phân hủy khi nhiệt độ >-20 0 C, khó khăn trong vận chuyển và bảo quản. - Vì vậy, nghiên cứu sử dụng phương pháp tiên tiến để tổng hợp cơ chất mới có hoạt tính cao và giá thành rẻ hơn nhằm sản xuất kít nhuộm esteraza tế bào bạch cầu ở Việt Nam, phục vụ việc khám và chữa bệnh cho cộng đồng là đề tài có ý nghĩa khoa học, thực tiễn và kinh tế - xã hội cấp thiết.. - Mục đích nghiên cứu. - Mục tiêu nghiên cứu của đề tài là ứng dụng phương pháp mới, hiệu quả cao để tổng hợp cơ chất. - khảo sát một cách có hệ thống mối quan hệ giữa cấu trúc và hoạt tính để tìm kiếm cơ chất mới có độ nhạy và độ đặc hiệu cao hơn;. - cacboxamit làm nguyên liệu điều chế cơ chất nhuộm esteraza đặc hiệu tế bào bạch cầu người.. - 2- Nghiên cứu tổng hợp các este 3-(N-thế- cacbamoyl)naphtalen-2-yl cacboxylat làm cơ chất nhuộm esteraza đặc hiệu bạch cầu người.. - 3- Xác định cấu trúc của các hợp chất điều chế được bằng các phương pháp vật lý và hóa lý hiện đại (Phổ IR, 1 H- NMR và MS) và nghiên cứu mối tương quan giữa độ nhạy của phản ứng nhuộm esteraza với cấu trúc phân tử cơ chất bằng phương pháp tính hóa lượng tử.. - 4- Nghiên cứu sử dụng este 3-(N-thế-cacbamoyl)naphtalen- 2-yl cacboxylat để nhuộm esteraza đặc hiệu bạch cầu người và tìm kiếm cơ chất mới có độ đặc hiệu và độ nhạy cao.. - 5- Nghiên cứu ảnh hưởng hiệu ứng electron các nhóm thế X, hiệu ứng không gian của các gốc N-hiđrocacbon nhóm amit thế và các gốc cacboxylat trong phân tử cơ chất đến độ nhạy và độ đặc hiệu đối với phản ứng nhuộm esteraza.. - 6- Nghiên cứu tối ưu hóa quy trình nhuộm bằng phương pháp đơn hình và ứng dụng để chế tạo bộ kít nhuộm esteraza dùng phân loại dòng tế bào trong bệnh bạch cầu người từ cơ chất tổng hợp được.. - Đã nghiên cứu cải tiến quy trình phản ứng giữa 3-hiđroxi- (N-thế)naphtalen-2-cacboxamit với các caboxylic cloanhiđrit và đã tổng hợp được các hợp chất 3-(N-thế- cacbamoyl)naphtalen-2-yl-cacboxylat có hoạt tính với esteraza đặc hiệu bạch cầu người.. - Đã khảo sát có hệ thống phản ứng nhuộm esteraza đặc hiệu bạch cầu người bằng các hợp chất 3-(N-thế)naphtalen-2-yl- cacboxylat và đã xác định được cơ chất mới có độ nhạy cao hơn cơ chất naphtol AS-D cloaxetat của hãng Sigma. - Trên cơ sở nghiên cứu ảnh hưởng của hiệu ứng electron, hiệu ứng không gian và các gốc nhị diện của nhóm cacboxyl lên độ đặc hiệu, độ nhạy của cơ chất đối với phản ứng nhuộm esteraza, đã xác định được: Các nhóm thế đẩy cho điểm nhuộm cao hơn các nhóm thế hút điện tử, các nhóm thế hút điện tử ở vị trí octo- cho điểm nhuộm cao hơn vị trí para-. - Các góc nhị diện của nhóm cacboxyl có ảnh hưởng quan trọng đối với độ chọn lọc của esteraza trong phản ứng thủy phân gốc este và độ nhạy của cơ chất.. - Đã điều chế được naphtol AS-OL -clopropionat làm cơ chất mới có độ đặc hiệu tương đương, nhưng độ nhạy cao hơn. - Đã chế tạo thành công kít nhuộm esteraza đặc hiệu bạch cầu người sử dụng cơ chất mới naphtol AS-OL. - b) Làm cơ chất nhuộm hóa học tế bào.. - Phương pháp nhuộm esteraza đặc hiệu tế bào và phương pháp FAB phân loại dòng tế bào;. - 1) Dãy 1: Naphtol AS-X.. - Tổng hợp các naphtol AS-X bằng phương pháp truyền thống. - Ở những điều kiện đó hiệu suất naphtol AS-X đạt 40-70%.. - Tổng hợp các naphtol AS-X sử dụng lò vi sóng Đã nghiên cứu sử dụng lò vi sóng để tổng hợp naphtol AS-X. - Trong những điều kiện đó, hiệu suất naphtol AS-X Ia-l đạt 80 - 90%.. - Tổng hợp 3-hiđroxi-N-. - Tổng hợp các 3-(N-thế-cacbamoyl)naphtalen-2-yl-2- clocacboxylat làm cơ chất nhuộm tế bào bạch cầu. - Trên sơ đồ sau là ví dụ phản ứng giữa naphtol AS-D với cloaxetyl clorua:. - Như vậy, bằng cách cải tiến quy trình thí nghiệm, đã tổng hợp thành công 4 dãy, gồm 38 cơ chất 3-(N-thế- cacbamoyl)naphtalen-2-yl- 2-clocacboxylat IIIa-l, IVa-l,. - Bốn dãy cơ chất đó là:. - 1) Naphtol AS-X cloaxetat: R = ClCH 2 , R 1 = X-C 6 H 4 . - p-OCH 3 (IIIj), o-COOCH 3 (IIIk), p-COOCH 3 (IIIl) 2) Naphtol AS-X α-clopropionat: R = CH 3 CHCl. - 4)-Naphtol AS-D và naphtol AS-OL butyrat, -clobutyrat. - Kết quả tổng hợp, một số hằng số hóa lý và các dữ kiện phổ của các cơ chất mô tả trong bảng 3.9 đến 3.16 (xem toàn văn luận án).. - Bảng trích kết quả tổng hợp, một số hằng số hóa lý, phổ IR và 1 H-NMR của các naphtol AS-X cacboxylat. - Trên phổ IR của các cơ chất tổng hợp được đã không còn cực đại hấp thụ đặc trưng cho dao động hóa trị của liên kết OH ở vùng 3482-3434 cm -1 . - Các cơ chất tổng hợp được rất không bền ở điều kiện bình thường, do đó đã tiến hành ghi phổ ESI-MS. - Nghiên cứu nhuộm tế bào bạch cầu. - Đã nghiên cứu nhuộm esteraza đặc hiệu tế bào bạch cầu dùng cơ chất tổng hợp được bằng quy trình chuẩn số 91 do hãng Sigma cung cấp. - Bước 1: Cơ chất bị thủy phân bởi esteraza đặc hiệu có trong bạch cầu, tạo lập lại 3-(N-thế)naphtalen-2- cacboxamit Ia-l hoặc IIa-d:. - Hoạt tính cơ chất nhuộm esteraza đặc hiệu bạch cầu người được đánh giá theo hai tiêu chí, một là độ đặc hiệu, hai là độ nhạy.. - Độ đặc hiệu của cơ chất là khả năng phản ánh đúng thực trạng tế bào-có esteraza phải dương tính, không có, phải âm tính.. - Độ nhạy của cơ chất là giới hạn phát hiện esteraza trong tế bào bạch cầu, giới hạn phát hiện càng nhỏ thì độ nhạy càng cao. - Cơ chất có độ nhạy càng cao thì điểm nhuộm càng cao.. - Tối ưu hoá phản ứng nhuộm esteraza tế bào bạch cầu. - Đã tiến hành nghiên cứu tối ưu hóa quy trình nhuộm esteraza đặc hiệu sử dụng cơ chất napthol AS-D cloaxetat của hãng Sigma-Aldrich theo phương pháp đơn hình. - cơ chất (X 4. - i Sau khi thực hiện các thí nghiệm tại các đỉnh đơn hình, đã thu được thông số tối ưu cho các thành phần dung dịch cơ chất nhuộm tế bào với thể tích 1,5 ml, như sau:. - Naphtol AS-D cloaxetat:. - Kết quả nhuộm esteraza đặc hiệu bạch cầu người được thể hiện trên bảng sau:. - Nghiên cứu mối quan hệ giữa cấu trúc và hoạt tính của cơ chất. - Đối tượng để nghiên cứu ảnh hưởng hiệu ứng electron của nhóm thế X là các cơ chất dãy III và IV, có cấu trúc phân tử như sau:. - Độ đặc hiệu: kết quả nhuộm esteraza cho thấy, tất cả 26 cơ chất ở trên đều đặc hiệu đối với các loại tế bào bạch cầu người.. - Điểm nhuộm trung bình của cơ chất naphtol AS-OL. - -clopropionat (IVi) cao nhất, cao hơn cả cơ chất naphtol AS- D cloaxetat do hãng Sigma bán trên thị trường. - Điều đó chứng tỏ, naphtol AS-OL -clopropionat có độ nhạy cao nhất đối với phản ứng nhuộm esteraza bạch cầu người.. - cơ chất là 3-(xiclohexyl/phenyl/naphtalen-1-yl/antraxen-1- ylcacbamoyl). - Độ đặc hiệu: tất cả 8 cơ chất Va-h ở trên đều có tính đặc hiệu đối với các loại tế bào bạch cầu người.. - Gốc N-naphtyl có kích thước trung bình, lớn hơn N- xiclohexyl và N-phenyl, nhưng nhỏ hơn N-antraxyl, có điểm nhuộm cao nhất trong dãy các cơ chất Va-h. - Để kết quả có độ tin cậy cần thiết, đã nghiên cứu ảnh hưởng của gốc cacboxylat với mạch hiđrocacbon kích thước khác nhau lên độ nhạy và độ đặc hiệu của cơ chất. - Để so sánh đối chứng, đã đồng thời khảo sát thêm các cơ chất naphtol AS-D cũng chứa các gốc cacboxylat kể trên. - Trong phần này cũng đã xem xét đánh giá vai trò của nguyên tử clo đối với hoạt tính của cơ chất.. - Các cơ chất khảo sát có cấu trúc như sau:. - Độ đặc hiệu:. - Tất cả 10 cơ chất trên đều có tính đặc hiệu với esteraza đặc hiệu bạch cầu người.. - Độ nhạy:. - Đối với cơ chất là các este điều chế từ naphtol AS-D và naphtol AS-OL thì gốc cacboxylat với mạch hiđrocacbon 3 nguyên tử cacbon có độ nhạy cao nhất.. - Đối với các cơ chất với gốc cacboxylat giống nhau, chứa từ 2-4 nguyên tử C thì este của naphtol AS-OL có độ nhạy cao hơn của naphtol AS-D. - Độ nhạy cao nhất thuộc về naphtol AS-OL -clo-propionat (tức là gốc cacboxylat chứa ba nguyên tử cacbon).. - Các cơ chất mà gốc cacboxylat có chứa nguyên tử clo ở vị trí alpha có độ nhạy đối với esteraza đặc hiệu cao hơn khi không chứa clo.. - Gốc -clophenylaxetat (CHClC 6 H 5 ) có độ nhạy thấp nhất đối với phản ứng nhuộm esteraza đặc hiệu bạch cầu. - Kết quả thu được một lần nữa khẳng định rằng, cơ chất có độ nhạy cao nhất đối với phản ứng nhuộm esteraza đặc hiệu tế bào bạch cầu người chứa nhóm metoxi ở vị trí octo- và có kích thước gốc cacboxylat trung bình, khoảng 3-4 nguyên tử cacbon. - Kết quả nhuộm esteraza bạch cầu người bằng các cơ chất naphtol AS-D và naphtol AS-OL. - Nghiên cứu mối tương quan giữa hoạt tính và cấu trúc của các cơ chất bằng phương pháp tính hóa lượng tử. - Sau khi đã tối ưu hóa cấu trúc hình học của phân tử cơ chất bằng phần mềm Gaussian, sử dụng phương pháp tính toán thống kê mối tương quan giữa góc nhị diện (tạo bởi các liên kết quanh nhóm C=O este) và điểm nhuộm đã tìm được phương trình hồi quy:. - Naphtol AS-D cloaxetat Naphtol AS-D -clopropionat. - Naphtol AS-OL cloaxetat. - Naphtol AS-OL -clopropionat. - Để kiểm tra độ chính xác của phương trình hồi quy đã tính toán bằng phần mềm Gaussian đối với bốn cơ chất VIa, b, d, e là những chất tương đồng về mặt cấu trúc (đều là các este của naphtol AS-D và OL với các gốc este mạch thẳng) và so sánh với điểm nhuộm thực nghiệm. - Nghiên cứu sản xuất kít bằng cơ chất mới naphtol AS-OL -clopropionat (IVi). - Ứng dụng kết quả kế hoạch hóa thực nghiệm, đã tiến hành sản xuất bộ kít bằng cơ chất mới naphtol AS-OL. - Dung dịch cơ chất 5 ml ký hiệu R2 và dung dịch muối điazo một lọ 5 ml ký hiệu R3, bảo quản ở nhiệt độ <-20 0 C.. - Đã sử dụng bộ kít sản xuất từ cơ chất naphtol AS-OL. - -clopropionat tổng hợp được và kít của hãng Sigma với cơ chất là naphtol AS-D cloaxetat nhuộm esteraza đặc hiệu 20 mẫu tuỷ của bệnh nhân đã được chẩn đoán dòng bằng. - Kết quả thực nghiệm chứng tỏ phương pháp lò vi sóng có ưu thế vượt trội về thời gian, năng lượng tiêu hao, hiệu suất sản phẩm, nhờ đó các hợp chất cacboxamit thu được với giá thành hợp lý, có thể dùng làm nguyên liệu để điều chế cơ chất nhuộm esteraza đặc hiệu bạch cầu người.. - Kết quả đã tổng hợp được 38 este 3-(xiclohexyl/aryl thế cacbamoyl)naphtalen-2-yl cacboxylat, trong đó có 36 chất mới có thể làm cơ chất nhuộm tế bào bạch cầu người.. - Đã nghiên cứu xác định độ tinh khiết, cấu trúc của các dẫn suất 3-hiđroxi-N- (xiclohexyl/aryl thế)naphtalen-2-cacboxamit và các cơ chất tương ứng bằng các phương pháp hóa lý hiện đại. - Đã nghiên cứu sử dụng các cơ chất điều chế được để nhuộm tế bào bạch cầu. - Kết quả cho thấy cả 38 dẫn xuất 3-(xiclohexyl/aryl thế cacbamoyl)naphtalen-2-yl cacboxylat đều có hoạt tính đối với esteraza đặc hiệu bạch cầu người, trong đó naphtol AS-OL α-clopropionat có hoạt tính cao hơn sản phẩm thương mại naphtol AS-D cloaxetat do hãng Sigma chế tạo.. - Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của hiệu ứng electron, hiệu ứng không gian của các nhóm thế và các góc nhị diện tạo bởi nhóm cacboxyl lên độ đặc hiệu, độ nhạy của cơ chất đối với phản ứng nhuộm esteraza cho thấy: Các nhóm thế đẩy cho điểm nhuộm cao hơn các nhóm thế hút điện tử, các nhóm thế hút điện tử ở vị trí octo- cho điểm nhuộm cao hơn ở vị trí para-. - Đã nghiên cứu tối ưu hóa quy trình nhuộm esteraza bằng phương pháp quy hoạch hóa thực nghiệm đơn hình và ứng dụng để chế tạo bộ kít nhuộm esteraza đặc hiệu bạch cầu người bằng cơ chất mới naphtol AS-OL α-clopropionat tổng hợp được