- Tuyển chọn các chủng vi khuẩn Azotobacter cho sản xuất phân bón hữu cơ vi sinh vật. - Luận văn Thạc sĩ ngành: Vi sinh vật học. - Abstract: Phân lập, tuyển chọn các chủng Azotobacter từ đất canh tác. - Phân loại và mức độ an toàn của các chủng vi sinh vật nghiên cứu. - Đánh giá ảnh hưởng của tổ hợp các chủng Azotobacter lựa chọn đến sinh trưởng, phát triển và năng suất của cây lạc (thí nghiệm trong nhà lưới và ngoài đồng ruộng diện hẹp).. - Keywords: Vi sinh vật học. - Vi khuẩn Azotobacter. - Sản xuất phân bón. - Phân bón hữu cơ. - Sử dụng phân bón hữu cơ vi sinh vật (HCVSV) là giải pháp mà các nhà khoa học trên thế giới cũng như ở Việt Nam đang hướng đến.. - Phân bón HCVSV (hay còn gọi là phân hữu cơ vi sinh) là sản phẩm được sản xuất từ các nguồn nguyên liệu hữu cơ khác nhau, nhằm cung cấp chất dinh dưỡng cho cây trồng, cải tạo đất, chứa một hay nhiều chủng vi sinh vật sống được tuyển chọn với mật độ đạt tiêu chuẩn quy định. - Vì vậy, nghiên cứu và sử dụng nguồn dinh dưỡng tạo ra từ các hoạt động sống của vi sinh vật đã và đang được nhiều nước trên thế giới quan tâm và phát triển.. - một số nghiên cứu gần đây cho thấy chế phẩm phân bón tổng hợp bao gồm các nhóm cố định nitơ, phân giải photphat, kích thích sinh trưởng thực vật, đối kháng vi sinh vật gây bệnh (chế phẩm EM, vi sinh vật tổng hợp) có tác dụng đối với cây trồng tốt hơn so với từng loại vi sinh vật riêng rẽ.. - Nhiều kết quả nghiên cứu về phân bón HCVSV đã khẳng định, hiệu quả của phân HCVSV phụ thuộc hoạt tính sinh học, khả năng cạnh tranh với vi sinh vật có sẵn trong đất và khả năng thích ứng với điều kiện môi trường đất của các vi sinh vật sử dụng trong phân bón . - Phân vi sinh vật đặc biệt có ý nghĩa sử dụng nếu các vi sinh vật sử dụng có nhiều hoạt tính sinh học.. - Để sản xuất phân bón HCVSV tốt, phải có chủng vi sinh vật có hoạt tính sinh học cao, đa hoạt tính, khả năng tồn tại lớn. - Vì vậy, việc phân lập, tuyển chọn đánh giá hoạt tính của các chủng vi sinh vật là việc làm không thể thiếu trong quy trình sản xuất chế phẩm phân bón vi sinh vật [11]. - Tuyển chọn các chủng Azotobacter có hoạt tính sinh học cao (cố định nitơ, kích thích sinh trưởng và đối kháng bệnh héo xanh) để sản xuất phân bón hữu cơ vi sinh cho cây lạc.. - Phân lập, tuyển chọn các chủng Azotobacter từ đất canh tác.. - Cacbon chiếm tỷ lệ trên 50% vật chất khô của vi sinh vật. - Hợp chất cacbon là nguồn năng lượng quan trọng trong hoạt động sống của vi sinh vật. - Các loại vi sinh vật khác nhau sử dụng các nguồn cacbon không giống nhau. - Tuỳ theo nhóm vi sinh vật mà nguồn cacbon được cung cấp có thể là chất vô cơ (CO 2 , NaHCO 3 , CaCO 3. - Nguồn dinh dưỡng nitơ có ý nghĩa rất quan trọng đối với sự phát triển của vi sinh vật.. - Nguồn nitơ dễ hấp thụ đối với vi sinh vật là NH 3 và NH 4. - Sau khi vi sinh vật sử dụng hết gốc NO 3. - Để tránh hiện tượng này người ta sử dụng muối NH 4 NO 3 làm nguồn nitơ cho nhiều loại vi sinh vật. - Ngoài các chất hữu cơ, vô cơ, nước v.v… trong tế bào vi sinh vật còn chứa nhiều chất khoáng. - Lượng chất khoáng trong tế bào thường thay đổi tuỳ loài, tuỳ từng giai đoạn và điều kiện sinh trưởng, phát triển của vi sinh vật. - Muốn phát triển bình thường vi sinh vật không những đòi hỏi phải được cung cấp đầy đủ protein, lipit, gluxit, muối khoáng… mà còn cần tới các chất sinh trưởng.. - Đất là môi trường thuận lợi cho sinh trưởng và phát triển của các loài vi sinh vật. - Trong thành phần sinh vật đất, vi sinh vật chiếm tới 90%. - Trong thành phần cacbon hữu cơ của đất, vi sinh vật chiếm khoảng 2%. - Số lượng vi sinh vật trong mỗi gam đất có tới hàng triệu, hàng tỉ và tới vài chục tỉ tế bào. - trọng lượng của vi sinh vật trong đất . - Khả năng cố định nitơ của Azotobacter 1.3.1. - Khả năng kích thích sinh trƣởng của Azotobacter.. - AIA là một hợp chất hóa học có khả năng kích thích sinh trưởng thực vật. - Để điều chế ra AIA có nhiều con đường, trong đó chúng ta có thể sử dụng các vi sinh vật tổng hợp AIA.. - Vi khuẩn R.solanacearum. - Hoạt động của vi sinh vật có ích giúp đẩy nhanh quá trình khoáng hóa các hợp chất hữu cơ trong đất, nâng cao độ phì nhiêu của đất, phù hợp với mọi loại đất. - Cung cấp các hệ vi sinh vật có ích, khả năng thích ứng cao, cải tạo đất đồng thời có thể kìm hãm sự phát triển của các vi sinh vật gây hại từ đó làm giảm mầm mống sâu bệnh (nấm, mốc. - Bên cạnh đó một số chủng vi sinh vật có khả năng tiết ra hoạt chất có tác dụng kích thích sinh trưởng giúp cây phát triển nhanh, tốt, hạn chế sâu bệnh. - Tình hình nghiên cứu và sử dụng phân bón hữu cơ vi sinh vật ở trong nƣớc và ngoài nƣớc.. - Ðến nay nhiều nước trên thế giới đã sản xuất chế phẩm vi sinh vật theo nhiều hướng, nhiều dạng khác nhau. - Mẫu đất và vi sinh vật.. - Trong quá trình thực hiện đề tài này, tôi đã sử dụng các dụng cụ và hóa chất của Bộ môn Vi sinh vật – Viện Thổ Nhưỡng Nông Hóa.. - Xác định khả năng cố định nitơ của vi sinh vật. - Xác định khả năng sinh tổng hợp AIA của vi sinh vật 2.2.4. - Xác định khả năng đối kháng vi khuẩn gây bệnh héo xanh. - Phương pháp xác định hoạt tinh đối kháng của vi sinh vật với vi khuẩn gây bệnh héo xanh cây trồng cạn Ralstonia solanacearum [10TCN 867:2006]. - Xác định tên vi sinh vật. - Phân lập, tuyển chọn các chủng Azotobacter hữu hiệu. - Việc hong khô đất là rất cần thiết vì các chủng phân lập từ đất khô có khả năng tồn tại tốt hơn trong điều kiện nuôi cấy nhân tạo. - Tuyển chọn các chủng Azotobacter có khả năng cố định nitơ. - Các chủng vi khuẩn Azotobacter được cấy truyền trên môi trường Ashby để xác định thuần chủng và ổn định hoạt tính sinh học. - Sau đó đánh giá lại khả năng cố định nitơ tự do dựa vào phản ứng màu Nessler. - Để xác định hoạt tính cố định nitơ của các chủng Azotobacter mới phân lập được, 06 chủng AT10, AT4, AT7, AT2, AT6 và AT9 được cấy vào môi trường bán lỏng AT ở 30 0 C trong 24 giờ, sau đó xác định hoạt tính khử axetylen trên máy sắc ký khí. - Như vậy, kết quả thử phản ứng màu của các chủng Azotobacter với thuốc thử Nessler hoàn toàn phù hợp với kết quả xác định hoạt tính khử axetylen trên máy sắc ký khí.. - Kết quả ở bảng 3.2 cho thấy, các chủng Azotobacter đều có khả năng cố định nitơ. - Trong đó chủng AT10 có khả năng cố định nitơ cao nhất, đạt 4345,6 mol/ml/ngày. - Các chủng này được chọn làm đối tượng cho các nghiên cứu sau.. - Tuyển chọn các chủng Azotobacter có khả năng sinh tổng hợp AIA. - Từ 09 chủng vi khuẩn phân lập được, đã tiếp tục tiếp tục tuyển chọn các chủng có khả năng sinh tổng hợp AIA, dựa vào phản ứng với thuốc thử Salkowski. - Dễ dàng nhận thấy, các chủng AT10, AT9, AT1, AT7 và AT2 có phản ứng mạnh với thuốc thử.. - Để xác định hoạt tính sinh tổng hợp AIA thô của các chủng Azotobacter mới phân lập, 06 chủng AT10, AT9, AT1, AT7 và AT2 được nuôi cấy trong điều kiện kị ánh sáng, trên máy lắc tốc độ 150 vòng / phút ở 30 o C trên môi trường nuôi cấy AT có bổ sung trytophan 0,1%. - Tuyển chọn các chủng Azotobacter có khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh héo xanh Từ các chủng vi khuẩn phân lập được, đã tiếp tục tuyển chọn các chủng có khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh héo xanh. - Kết quả thu được 03 chủng có khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh héo xanh, đó là : AT2, AT7, AT10.. - Bảng 3.5: Hoạt tính sinh học của các chủng Azotobacter lựa chọn. - Qua các thí nghiệm xác định hoạt tính sinh học của 09 chủng Azotobacter phân lập được, chúng tôi đã tiến hành lựa chọn các chủng Azotobacter tối ưu nhất để sản xuất phân bón HCVSV là: AT2, AT4, AT7, AT9 và AT10.. - Mối quan hệ của các chủng lựa chọn. - Đã tiến hành xác định mối quan hệ giữa các chủng vi khuẩn lựa chọn theo phương pháp cấy vạch tiếp xúc giữa các chủng vi khuẩn trên môi trường đặc hiệu.. - Khả năng sinh trưởng và phát triển của các chủng vi khuẩn trong môi trường dịch thể Ba chủng vi khuẩn lựa chọn được nuôi cấy riêng rẽ và hỗn hợp trên môi trường dịch đặc hiệu. - Sau 48 giờ đánh giá khả năng sinh trưởng phát triển của các chủng theo phương pháp đã nêu ở trên.. - Khả năng sinh trưởng và phát triển của tổ hợp chủng lựa chọn trong chất mang. - Sau 30 ngày mật độ tế bào của các chủng lựa chọn giảm dần. - Hoạt tính sinh học của các chủng vi khuẩn lựa chọn khi nuôi cấy ở dạng riêng rẽ và hỗn hợp trong dịch thể và trong chất mang. - Xác định tên các chủng lựa chọn. - Đánh giá tác động của chế phẩm Azotobacter đến khả năng sinh trƣởng, phát triển và năng suất của cây lạc. - Ảnh hưởng của dịch hỗn hợp các chủng Azotobacter đến khả năng sinh trưởng phát triển và ức chế bệnh héo xanh cây lạc. - Bảng 3.11: Ảnh hưởng của dịch hỗn hợp các chủng Azotobacter đến khả năng sinh trưởng và phát triển của cây lạc ngoài đồng ruộng. - Đây là một đặc tính quý, có tính ứng dụng thực tiễn trong sản xuất phân bón hữu cơ vi sinh rất cao.. - Ba chủng Azotobacter AT2, AT7 và AT10 đảm bảo an toàn sinh học, thích hợp với điều kiện sản xuất chế phẩm phân bón hữu cơ vi sinh vật và điều kiện áp dụng ra đồng ruộng Việt Nam.. - Do thời gian thực hiện đề tài có hạn nên chưa thể đi sâu nghiên cứu kĩ về tất cả các vấn đề liên quan đến chế phẩm phân bón vi sinh vật. - Mở rộng thử nghiệm chế phẩm vi sinh vật hỗn hợp cho nhiều loại cây trồng khác nhau ở các thời vụ khác nhau và điều kiện sinh thái khác nhau.. - Tiếp tục thử nghiệm khả năng sử dụng phân vi sinh vật hỗn hợp trong điều kiện có bổ sung các nền phân khoáng N, P khác nhau để tìm ra được lượng phân khoáng cho phép thay thế trong khi năng suất và chất lượng cây trồng vẫn đạt mức cao nhất, từ đó hoạch toán được lợi nhuận kinh tế của việc sử dụng chế phẩm vi sinh vật cố định nitơ, kích thích sinh trưởng và đối kháng bệnh cho cây trồng.. - Bùi Thị Ngọc Dung (1999), Đặc điểm phân bố của vi sinh vật trong các hệ thống sử dụng đật chính ở 1 số vùng sinh thái nông nghiệp Việt Nam, Luận án Tiến sĩ Sinh hoc, Trường Đại học Khoa học tự nhiên.. - Nguyễn Lân Dũng (1978),Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, Tập 1, 2, 3, Nhà xuất bản Khoa học kỹ thuật nông nghiệp.. - Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty, Vi sinh vật học, Nhà xuất bản giáo dục.. - Nguyễn Thu Hà, Nguyễn Ngọc Quyên, Vũ Thị Minh Đức (2001), “Phân lập, tuyển chọn chủng Azotobacter cho sản xuất phân bón vi sinh vật”, Hội thảo Quốc tế sinh học. - Nguyễn Minh Hưng Và cộng sự (2007), Phân bón vi sinh vật, Nxb nông nghiệp.. - Phạm Xuân Lân (2007), Nghiên cứu ảnh hưởng của 1 số loại phân hữu cơ vi sinh tới năng suất, hàm lượng NO3 của rau cải bắp và hóa tính đất trồng rau tại thị xã Hà Giang, Đại học Nông Lâm.. - Nguyễn Thị Thanh Phụng (1982), “Nghiên cứu về đặc điểm vi sinh vật đất trong các hệ sinh thái nông nghiệp Việt Nam”, Tạp chí Khoa học nông nghiệp, 7, tr. - Lê Xuân Phương (2009), Vi sinh vật học môi trường, Nhà xuất bản Đà Nẵng.. - Nguyễn Xuân Thành, Lê Văn Hưng, Phạm Văn Toản (2003), “Giáo trình công nghệ vi sinh vật trong sản xuất nông nghiệp và xử lý ô nhiễm môi trường”, Nhà xuất bản nông nghiệp.. - Phạm Văn Toản (2002), “Đề tài KHCN 02.06: Nghiên cứu áp dụng công nghệ mới nhằm mở rộng việc sản xuất, ứng dụng phân vi sinh vật cố định đạm và phân giải lân phục vụ phát triển nông nghiệp bền vững”, Hội nghị tổng kết các chương trình khoa học và công nghệ cấp Nhà nước giai đoạn Hà Nội 12/2002.. - Phạm Văn Toản (2003), “Khả năng sử dụng hỗn hợp vi sinh vật làm phân bón chức năng cho một số cây trồng nông nghiệp, công nghiệp và lâm nghiệp”, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, 127-131.. - Phạm Văn Toản, Trương Hợp Tác (2004), Phân bón vi sinh vật trong nông nghiệp, Nhà xuất bản nông nghiệp.. - Phạm Văn Toản (2005), Nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật làm phân bón, Nhà xuất bản nông nghiệp.. - Hoàng Lương Việt (1978), Đặc tính vi sinh vật học của một số loại đất, tr 5, tr63-93.