- TUYỂN CHỌN CHẤT MANG ĐỂ TỒN TRỮ VI KHUẨN Bacillus aerophilus ĐỐI KHÁNG VỚI VI KHUẨN Xanthomonas oryzae pv. - Bacillus aerophilus, chất mang, cháy bìa lá lúa, tồn trữ, vi khuẩn đối kháng. - Đề tài này được thực hiện nhằm tìm ra chất mang để tồn trữ vi khuẩn Bacillus aerophilus, làm tiền đề cho các nghiên cứu tạo chế phẩm sinh học ứng dụng trong phòng trị bệnh cháy bìa lá lúa do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. - Năm loại chất mang (bột talc, cám, gạo xay, lúa xay và trấu xay) được khảo sát khả năng tồn trữ dựa vào ba tiêu chí gồm mật số, khả năng đối kháng với Xoo và hiệu quả giảm bệnh của vi khuẩn đối kháng. - Kết quả cho thấy sau sáu tháng tồn trữ, mật số vi khuẩn trong 3 loại chất mang, bột talc, cám và trấu xay đạt hơn 10 6 CFU/g chế phẩm. - trong đó chất mang cám duy trì được mật số tốt nhất. - Vi khuẩn B. - Vì vậy cám, bột talc, trấu xay là chất mang được tuyển chọn để tồn trữ vi khuẩn Bacillus aerophilus.. - Tuyển chọn chất mang để tồn trữ vi khuẩn Bacillus aerophilus đối kháng với vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. - Ứng dụng vi khuẩn đối kháng vào đất sẽ tạo điều kiện cho vi khuẩn thích nghi với hệ sinh thái đất và tiếp tục tăng dần mật số trên đồng ruộng. - Vi khuẩn đối kháng hiện diện thường xuyên trong đất sẽ ức chế khả năng phát triển của mầm bệnh, làm giảm mật số vi khuẩn gây bệnh trên lúa, mang lại hiệu quả tác động lâu dài (Agrios, 1988).. - Nhóm nghiên cứu Bệnh cây Phòng Sinh học phân tử, Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học đã thực hiện các nghiên cứu phân lập vi khuẩn đối kháng với vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. - Trong những chủng vi khuẩn phân lập được, Bacillus aerophilus là một trong những chủng có khả năng ức chế Xoo mạnh nhất. - Khi được sử dụng để đánh giá khả năng giảm bệnh ngoài đồng, những chủng vi khuẩn đối kháng này có hiệu quả làm giảm tỷ lệ bệnh cao (Võ Thị Phương Trang, 2013. - Những kết quả này có ý nghĩa quan trọng, là tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo về việc sử dụng các chủng vi khuẩn phân lập này để tạo chế phẩm sinh học dùng trong phòng trừ bệnh cháy bìa lá lúa.. - Việc ứng dụng các vi khuẩn đối kháng vào đất có hiệu quả hay không phụ thuộc rất nhiều vào mật số của các vi khuẩn đối kháng còn sống sót trong đất (Heijnen and Van Veen, 1991). - Do đó, trong các chế phẩm thương mại đòi hỏi phải duy trì được mật số vi khuẩn đối kháng cao trong thời gian dài.. - Với những lý do trên đề tài được thực hiện để tuyển chọn chất mang thích hợp tồn trữ vi khuẩn Bacillus aerophilus đối kháng với vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. - 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vi khuẩn đối kháng và chất mang Vi khuẩn Bacillus aerophilus từ bộ sưu tập vi khuẩn đối kháng của Nhóm nghiên cứu bệnh cây, Phòng thí nghiệm Sinh học Phân tử, Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học.. - 2.2 Tạo chế phẩm dạng bột và khảo sát mật số của vi khuẩn Bacillus aerophilus trong chế phẩm sau thời gian tồn trữ. - Chuẩn bị huyền phù vi khuẩn B. - Sau 2 ngày, rút 1mL huyền phù vi khuẩn cho vào bình tam giác 250 mL có chứa 100 mL môi trường NB đã khử trùng và tiếp tục nuôi lắc 150 vòng/phút trong 2 ngày.. - Chủng vi khuẩn B. - Vi khuẩn sau khi nuôi 2 ngày được đo độ hấp thu quang phổ (OD) với bước sóng 600 nm. - Sau đó, dựa vào đường chuẩn để pha huyền phù vi khuẩn về mật số 2x10 8 CFU/mL. - khuẩn (2x10 8 CFU/mL) vào mỗi túi chất mang và phối trộn để tế bào vi khuẩn phân bố đều trong chất mang.. - 2.2.2 Khảo sát mật số của vi khuẩn Bacillus aerophilus trong chế phẩm sau thời gian tồn trữ. - Trải đĩa: Hút 50 µl huyền phù vi khuẩn đã được pha loãng về nồng độ thích hợp vào đĩa môi trường nutrient agar và trải đều lên bề mặt môi trường bằng que tam giác, sau đó ủ đĩa ở 30 o C. - 2.3 Khảo sát khả năng đối kháng trên đĩa thạch của vi khuẩn Bacillus aerophilus sau thời gian tồn trữ. - Chuẩn bị huyền phù vi khuẩn Xoo: Vi khuẩn Xoo được nuôi trên môi trường Wakimoto cải tiến trong 48-72 giờ. - Sau đó, vi khuẩn được cho vào ống nghiệm chứa 10 mL nước cất đã thanh trùng và votex hỗn hợp để tạo huyền phù vi khuẩn. - Với cách chuẩn bị huyền phù như trên, mật số vi khuẩn Xoo khoảng 10 9 CFU/mL (Trần Kim Thoa, 2015).. - Khảo sát khả năng đối kháng: Hút 50 µL huyền phù vi khuẩn Xoo và trải đều lên trên bề mặt đĩa môi trường Wakimoto cải tiến. - Sau đó, dùng que cấy lấy khuẩn lạc vi khuẩn B. - Tiêu chuẩn để khảo sát khả năng đối kháng dựa vào bán kính vòng vô khuẩn: Vi khuẩn đối kháng yếu có bán kính từ 1 đến 4 mm, vi khuẩn đối kháng trung bình có bán kính từ 5 đến 8 mm, vi khuẩn đối kháng mạnh có bán kính từ 9 đến 12 mm, vi khuẩn đối kháng rất mạnh có bán kính từ 12 mm trở lên (Ahmed and Zahran, 2006).. - Quan sát khả năng tạo vòng vô khuẩn của vi khuẩn đối kháng và đo bán kính vòng vô khuẩn sau 48 giờ. - Sau 2 ngày, vi khuẩn còn khả năng đối kháng với Xoo khi xuất hiện vòng vô khuẩn (Salaheddin et al., 2010). - 2.4 Khảo sát khả năng làm giảm bệnh cháy bìa lá lúa trong điều kiện nhà lưới của vi khuẩn Bacillus aerophilus trong chế phẩm sau thời gian tồn trữ. - Nghiệm thức đối chứng âm, lúa giống không được xử lý vi khuẩn đối kháng và được xử lý với nước cất. - Phương pháp ngâm hạt với huyền phù vi khuẩn đối kháng: Dựa vào mật số vi khuẩn trong chế phẩm được xác định bằng phương pháp đếm sống ở tháng 3 và 6 (thí nghiệm 2.1) để cân khối lượng chế phẩm pha vào nước cất và pha loãng về mật số 10 7 CFU/mL.. - Hạt lúa sau khi xử lý nảy mầm được ngâm trong 40 mL huyền phù vi khuẩn (10 7 CFU/mL) trong 2 giờ trước khi gieo.. - Phương pháp chủng bệnh: Chủng bệnh bằng cách sử dụng kéo vô trùng nhúng vào huyền phù vi khuẩn Xoo mật số khoảng 10 9 CFU/mL và cắt 8-10 chóp lá trưởng thành với chiều dài khoảng 2-3 cm tính từ chóp lá của cây lúa giai đoạn 45 ngày sau khi gieo (Kauffman et al., 1973).. - 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết quả tạo chế phẩm dạng bột và khảo sát mật số của vi khuẩn Bacillus aerophilus trong chế phẩm sau mỗi tháng tồn trữ. - Kết quả xác định mật số vi khuẩn Bacillus aerophilus trong chế phẩm ở các loại chất mang khác nhau theo thời gian tồn trữ được trình bày ở Bảng 1.. - Thời điểm ngay sau khi đóng gói (0 tháng), mật số vi khuẩn B. - Một tháng sau thời gian tồn trữ, mật số vi khuẩn ở nghiệm thức bột talc cao nhất với mật số 4,1x10 7 CFU/g chế phẩm khác biệt so với các nghiệm thức chất mang còn lại. - Cám, lúa xay, trấu xay, gạo xay là các nghiệm có mật số vi khuẩn giảm dần theo thứ tự.. - Thời điểm 2 tháng sau thời gian tồn trữ, mật số vi khuẩn của nghiệm thức bột talc (2,6x10 7 CFU/g chế phẩm) và cám (2,8x10 7 CFU/g chế phẩm) khác biệt ý nghĩa so với các nghiệm thức chất mang còn lại. - Đối với nghiệm thức trấu xay (1,1x10 7 CFU/g chế phẩm), mật số vi khuẩn tương đối thấp so với 2 nghiệm thức bột talc và cám. - Riêng 2 nghiệm thức lúa xay và gạo xay, mật số vi khuẩn tiếp tục giảm mạnh sau 2 tháng tồn trữ (0,84x10 6 CFU/g chế phẩm đối với nghiệm thức gạo xay và 1,5x10 6 CFU/g chế phẩm đối với nghiệm thức lúa xay).. - Bảng 1: Mật số của vi khuẩn Bacillus aerophilus trong 5 chế phẩm chứa 5 loại chất mang khác nhau (bột talc, cám, gạo xay, lúa xay và trấu xay) trong 6 tháng tồn trữ:. - Nghiệm thức. - Mật số vi khuẩn (10 6 CFU/g chế phẩm). - Mật số vi khuẩn được chuyển sang Log 10 khi phân tích thống kê. - Không khảo sát mật số vi khuẩn B. - Thời điểm 3 tháng sau thời gian tồn trữ, mật số vi khuẩn trong chất mang cám duy trì ở mức cao (1,3x10 7 CFU/g chế phẩm) so với các nghiệm thức còn lại. - Riêng nghiệm thức trấu xay, mật số vi khuẩn gần như không giảm so với tháng thứ 2.. - Ngược lại, mật số vi khuẩn trong bột talc giảm mạnh (giảm 4 lần so với tháng thứ 2) và mật số vi khuẩn thấp hơn nghiệm thức cám và trấu xay tính. - Đối với nghiệm thức gạo xay, mật số vi khuẩn vẫn giảm mạnh và thấp hơn so với các nghiệm thức còn lại (7x10 3 CFU/g chế phẩm).. - Đối với nghiệm thức lúa xay, mật số vi khuẩn giảm chỉ còn 4x10 3 CFU/g chế phẩm. - Riêng nghiệm thức gạo xay, do mật số vi khuẩn giảm thấp ở tháng thứ 3 nên không được khảo sát ở tháng 4.. - Hai thời điểm này, nghiệm thức cám duy trì được mật số tốt nhất (5,8x10 6 CFU/g chế phẩm) kế đến là nghiệm thức bột talc (5,3x10 6 CFU/g chế phẩm) và trấu xay (2,35x10 6 CFU/g chế phẩm).. - Tóm lại, nghiệm thức cám duy trì được mật số vi khuẩn tốt nhất (>10 7 CFU/g chế phẩm sau 5 tháng tồn trữ và >10 6 ở tháng thứ 6) và khác biệt với các nghiệm thức chất mang còn lại. - Nghiệm thức bột talc đạt được mật số vi khuẩn khoảng 10 6 CFU/g chế phẩm sau 4 tháng. - Riêng nghiệm thức lúa xay và gạo xay, mật số vi khuẩn luôn ở mức thấp so với các nghiệm thức còn lại và giảm mạnh qua mỗi tháng nên mật số vi khuẩn trong 2 nghiệm thức này chỉ khoảng 10 3 CFU/g chế phẩm ở tháng thứ 4.. - Kết quả phân tích cho thấy mật số vi khuẩn ở tất cả các nghiệm thức chất mang giảm mạnh vào tháng thứ nhất tính từ ngày chủng vi khuẩn đối kháng vào chế phẩm và tiếp tục giảm dần qua mỗi tháng tồn trữ. - Kết quả nghiên cứu của Omer (2010) cũng ghi nhận các chế phẩm chứa chất mang dạng trơ dùng để tồn trữ các vi khuẩn hình thành nội bào tử như Bacillus sp. - Trong đó, mật số vi khuẩn giảm mạnh trong tháng đầu do chưa thích nghi với môi trường mới và chưa đủ thời gian hình thành nội bào tử.. - Nhìn chung, qua khảo sát khả năng tồn trữ vi khuẩn cho thấy bột talc, cám và trấu xay duy trì mật số vi khuẩn ổn định (>10 6 CFU/g chế phẩm sau 6 tháng tồn trữ) so với nghiệm thức lúa xay và gạo xay.. - Hai loại chất mang lúa xay và gạo xay có mật số vi khuẩn thấp nhất trong số các chất mang khảo sát. - Điều này có thể do hàm lượng dinh dưỡng trong hai loại chất mang này cao nên thích hợp cho các chủng vi khuẩn khác phát triển và xâm nhiễm.. - Kết quả đề tài nghiên cứu cho thấy bột talc là một trong các nghiệm thức có khả năng duy trì mật số vi khuẩn cao và kết quả này tương đồng với các nghiên cứu khác trong lĩnh vực này (Muis, 2006;. - Bên cạnh đó, nghiệm thức cám và trấu xay là 2 loại chất mang cũng có khả năng duy trì mật số cao sau 6 tháng tồn trữ. - có vai trò tăng cường quá trình hình thành nội bào tử, đó có thể là cơ chế góp phần giúp duy trì mật số vi khuẩn được ổn định sau thời gian dài tồn trữ (Omer, 2010). - Trong trấu có chứa các thành phần chủ yếu là những hợp chất có khối lượng phân tử lớn như cellulose và lignin giúp duy trì mật số vi khuẩn (Ilyina et al., 2000). - 3.2 Kết quả khảo sát khả năng đối kháng trên đĩa thạch của vi khuẩn Bacillus aerophilus trong chế phẩm sau thời gian tồn trữ. - Các nghiệm thức chất mang đều được khảo sát khả năng đối kháng với vi khuẩn Xoo trên đĩa thạch (Hình 1) nhằm chọn ra các nghiệm thức chất mang có thể duy trì khả năng đối kháng của vi khuẩn để tiến hành khảo sát hiệu quả giảm bệnh cháy bìa lá của chế phẩm ngoài nhà lưới.. - Hình 1: Vòng vô khuẩn được tạo ra bởi vi khuẩn Bacillus aerophilus trong nghiệm thức bột talc với. - vi khuẩn Xoo trên đĩa thạch sau 2 ngày Chất mang lúa xay và gạo xay không duy trì được mật số vi khuẩn B. - aerophilus tốt nên không được khảo sát mật số vi khuẩn trong chế phẩm kể từ tháng thứ 3 đối với gạo xay và tháng thứ 4 đối. - với lúa xay, cũng như không khảo sát khả năng đối kháng trên đĩa thạch đối với vi khuẩn trong 2 nghiệm thức chất mang này.. - Kết quả khảo sát tính đối kháng của vi khuẩn B.. - aerophilus trong chất mang bột talc, cám, lúa xay, trấu xay và gạo xay được trình bài ở Bảng 2 cho thấy bán kính vòng vô khuẩn của vi khuẩn B.. - Trong đó, ở nghiệm thức bột talc, vi khuẩn vẫn còn khả năng đối kháng mạnh đến rất mạnh (>8 mm). - trong nghiệm thức trấu và cám, vi khuẩn có khả năng đối kháng ở mức trung bình đến rất mạnh.. - Bảng 2: Bán kính vòng vô khuẩn (mm) do vi khuẩn Bacillus aerophilus tồn trữ trong chế phẩm tạo ra khi đối kháng với vi khuẩn Xoo sau 2 ngày nuôi trên môi trường Waikimoto cải tiến. - Theo kết quả nghiên cứu của Nguyễn Đặng Ngọc Giàu (2014), chủng vi khuẩn B. - aerophilus trong tất cả nghiệm thức chất mang vẫn còn khả năng đối kháng mạnh sau 6 tháng tồn trữ.. - 3.3 Kết quả khảo sát khả năng làm giảm bệnh cháy bìa lá lúa ngoài nhà lưới của vi khuẩn đối kháng trong chế phẩm sau tồn trữ. - 3.3.1 Khả năng làm giảm bệnh cháy bìa lá lúa ngoài nhà lưới của vi khuẩn B. - phẩm chứa vi khuẩn B. - 3.3.2 Khả năng làm giảm bệnh của vi khuẩn Bacillus aerophilus trong chế phẩm sau 6 tháng tồn trữ. - Kết quả khảo sát hiệu quả giảm bệnh của chế phẩm chứa vi khuẩn B. - kiện nhà lưới ở tháng 3 và 6 cho thấy vi khuẩn vẫn còn hiệu quả giảm bệnh tốt với mầm bệnh sau thời gian tồn trữ. - có thể sử dụng các loại chất mang này để tồn trữ mà không lo ngại vi khuẩn trong chế phẩm sẽ bị mất khả năng đối kháng.. - Sau 6 tháng tồn trữ, nghiệm thức bột talc, cám và trấu xay duy trì mật số vi khuẩn >10 6 CFU/g chế phẩm, trong đó nghiệm thức cám duy trì được mật số tốt nhất. - Vi khuẩn tồn trữ trong 3 loại chất mang bột cám, talc, và trấu xay vẫn còn khả năng đối kháng với Xanthomonas oryzae pv. - Từ 3 kết quả thí nghiệm cho thấy cám, talc, trấu xay là chất mang thích hợp nhất để tồn trữ vi khuẩn Bacillus aerophilus.. - Phân lập, định danh và khảo sát khả năng phòng trừ bệnh cháy bìa lá lúa cùa vi khuẩn trong đất ở thành phố Cần Thơ và tỉnh Hậu Giang. - Phân lập, định danh và khảo sát khả năng phòng trừ bệnh cháy bìa lá lúa của vi khuẩn trong đất hai tỉnh Tiền Giang và Sóc Trăng. - Phân lập, định danh và khảo sát khả năng phòng trừ bệnh cháy bìa lá lúa của vi khuẩn đối kháng trong đất tỉnh An Giang.