- TUYỂN CHỌN VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG PHÂN HUỶ PHẾ PHỤ PHẨM SAU THU HOẠCH QUẢ VẢI. - Bacillus, cellulase, chế phẩm sinh học, phân ủ hữu cơ, phụ phẩm sau thu hoạch quả vải Keywords:. - Nghiên cứu thực hiện nhằm phân lập, tuyển chọn vi khuẩn có khả năng phân giải cellulose để tạo nguồn giống sản xuất chế phẩm sinh học xử lý phế phụ phẩm sau thu hoạch quả vải. - Từ 300 mẫu phụ phẩm quả vải hoai mục tự nhiên tại Lục Ngạn - Bắc Giang đã phân lập được 98 chủng vi khuẩn. - Các chủng vi khuẩn được tuyển chọn thông qua đánh giá hoạt tính cellulase, amylase, protease và thông qua đánh giá sinh trưởng, hoạt tính enzyme ngoại bào khi nuôi ở các điều kiện pH, nhiệt độ, kháng sinh khác nhau. - Độ hoai mục và hàm lượng dinh dưỡng ở công thức có chế phẩm vi khuẩn đều cao hơn công thức đối chứng và cao hơn trước khi ủ.. - Tuyển chọn vi khuẩn có khả năng phân huỷ phế phụ phẩm sau thu hoạch quả vải. - Các vi khuẩn có khả năng phân huỷ mạnh cellulose đã được chỉ ra là Bacillus, Cellulomonas, Vibrio, Archomobacter,.... - Theo Walke (1975), vi khuẩn có vai trò đáng chú ý nhất trong quá trình phân huỷ và giữ vị trí đầu tiên trong giai đoạn phân huỷ chất hữu cơ của đống ủ, vi khuẩn phân huỷ các chất dinh dưỡng có thể phân huỷ được nhanh hơn so với các chủng VSV khác. - Vi khuẩn còn là sinh vật sống nhiều nhất trong đống ủ chất hữu cơ. - Vi khuẩn là hệ thống năng động, chiếm ưu thế ở tầng đáy và bề mặt đống ủ, hoạt động mạnh mẽ vào giai đoạn trước và sau khi ủ. - Trong quá trình ủ chất hữu cơ, khi nhiệt độ trong đống ủ ở mức dưới 40°C thì số lượng vi khuẩn ưa ấm chiếm nhiều nhất 10 8 (CFU/g), nhiều hơn 10 2 đến 10 4 lần so với số lượng xạ khuẩn và nấm. - khi nhiệt độ đống ủ 40-70°C thì số lượng vi khuẩn ưa nóng là 10 9 (CFU/g), lớn hơn 10 7 đến 10 2 lần so với xạ khuẩn và nấm ưa nhiệt (Haug, 1980).. - Phân lập, tuyển chọn VSV có khả năng phân giải cellulose, tạo chế phẩm xử lý rơm rạ (Nguyễn Xuân Thành, 2004) và phế thải nông sản (Lê Văn Nhương và Nguyễn Lan Hương, 2001), nhưng chưa có kết quả nghiên cứu cụ thể cho phụ phẩm sau thu hoạch quả vải. - Vì vi khuẩn có vai trò quan trọng trong đống ủ chất hữu cơ nên trong nghiên cứu này, việc phân lập, tuyển chọn vi khuẩn có khả năng phân hủy cellulose từ phụ phẩm sau thu hoạch quả vải đã hoai mục tự nhiên không chỉ xác định được sự có mặt của vi khuẩn phân giải cellulose trong nguồn chất thải này mà còn tạo. - 2.2 Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn có khả năng phân huỷ phế phụ phẩm quả vải. - Phân lập vi khuẩn có khả năng phân giải cellulose theo phương pháp loại trực tiếp trên môi trường thạch đĩa (Môi trường CMC, môi trường Hans) (Phương pháp Koch).. - Nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường dịch thể ở các môi trường nuôi cấy khác nhau (Vi khuẩn tổng số, Ixenhetxki và Contrep, Thạch thường - Glucose, Lauria Betani). - hoặc ở nồng độ kháng sinh streptomycin khác nhau mg/l môi trường nuôi cấy). - Hoạt tính enzyme cellulase, amylase, protease được đánh giá theo phương pháp khuếch tán phóng xạ trên môi trường thạch đĩa (William, 1983). - Tính an toàn với thực vật của vi khuẩn được xác định bằng cách cấy chấm lên vết thương của căn hành tây đã khử trùng (Nguyễn Thị Minh, 2016).. - Vi khuẩn được nuôi cấy trực tiếp trên môi trường chuyên tính bán rắn. - theo dõi thời gian mọc của vi khuẩn tại các mốc thời gian khác nhau và sau 72h. - sau 5 ngày quan sát hình thái, đo kích thước khuẩn lạc, nhuộm gram và quan sát hình thái vi khuẩn dưới kính hiển vi thường và kính hiển vi điện tử quét.. - Vi khuẩn được định danh theo các bước: tách chiết ADN hệ gen theo Marmur (1961) và Saito (1963). - phản ứng PCR nhân trình tự gen 16S rRNA đặc thù với mồi đặc thù cho vi khuẩn. - Mật độ vi khuẩn được xác định khi nuôi trong nồi lên men chìm ở điều kiện khác nhau của thời gian lên men, lưu lượng cấp khí, tốc độ cánh khuấy để tìm ra thông số tối ưu cho nhân sinh khối vi khuẩn. - 2.3 Thí nghiệm đánh giá khả năng phân huỷ phế phụ phẩm sau thu hoạch quả vải. - 3.1 Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn phân giải cellulose. - 3.1.1 Kết quả phân lập vi khuẩn phân giải cellulose. - Từ 300 mẫu phụ phẩm sau thu hoạch quả vải hoai mục tự nhiên, mẫu đất trồng, mẫu mùn đất tại Lục Ngạn - Bắc Giang đã phân lập và thuần khiết được 98 chủng vi khuẩn với ký hiệu từ V1 đến V98 có khả năng phân giải cellulose. - Theo Walke (1975), vi khuẩn trong 1 gram phân ủ chiếm khoảng 80-90% tổng số VSV và có vai trò quan trọng trong quá trình ủ.. - Qua đó khẳng định vi khuẩn rõ ràng chiếm số lượng lớn trong các đống ủ phụ phẩm sau thu hoạch quả vải, nên việc phân lập vi khuẩn có khả năng phân huỷ cellulose để làm giống sản xuất chế phẩm xử lý phụ phẩm là hướng đi khả thi.. - Bảng 1: Thời gian mọc và hoạt tính enzyme ngoại bào của 18 chủng vi khuẩn phân lập từ phụ phẩm quả vải sau thu hoạch và đất trồng tại Lục Ngạn, Bắc Giang. - Tên chủng vi. - Khi kiểm tra hoạt tính cellulase của 98 chủng vi khuẩn theo phương pháp khuếch tán trên môi trường thạch đĩa, 18 chủng có vòng phân giải lớn hơn 20 mm được giữ lại, đồng thời tiến hành đánh. - giá thêm hoạt tính protease và amylase ngoại bào của 18 chủng vi khuẩn này vì trong các chất hữu cơ, ngoài cellulose, còn có protein và tinh bột.. - Kết quả Bảng 1 cho thấy 4 chủng vi khuẩn (V19, V57, V96, V98) có hoạt tính cellulase, protease và amylase cao. - Hoạt tính enzyme cellulase của 4 chủng vi khuẩn phân lập từ phụ phẩm sau thu hoạch quả vải tương đồng với kết quả nghiên cứu về kích thước vòng phân huỷ cellulose của vi khuẩn phân lập từ phụ phẩm nông nghiệp là 29,3 mm (Đinh Hồng Duyên và Nguyễn Xuân Thành, 2010) và từ chất thải rắn của nhà máy Fococev là 24,5 mm (Nguyễn Ngọc Trúc Ngân và. - Bốn chủng vi khuẩn trên có thời gian mọc nhanh (khuẩn lạc xuất hiện sau 24 giờ nuôi cấy), và kích thước khuẩn lạc sau 5 ngày nuôi cấy lớn (đạt cm). - 3.1.2 Lựa chọn môi trường nuôi cấy thích hợp. - Bảng 2: Ảnh hưởng của các môi trường nuôi cấy đến 4 chủng vi khuẩn tuyển chọn. - Môi trường Chủng vi. - Hoạt tính enzyme (D-d, mm) Cellulase Amylase Protease Môi trường vi khuẩn tổng số. - Môi trường Ixenhetxki và Contrep . - Môi trường thạch thường – glucose . - Môi trường Lauria Betani (LB . - Môi trường vi khuẩn tổng số. - Đối với từng chủng vi khuẩn cần tìm ra môi trường nuôi cấy tối ưu và đánh giá được các hoạt tính sinh học. - Bảng 2 cho thấy chủng V19, V57 sinh trưởng và có hoạt tính enzyme mạnh trên môi trường VKTS. - chủng V98 có hoạt tính enzyme vượt trội trên môi trường VKTS, sinh khối lớn nhất trên môi trường LB rồi đến môi trường VKTS. - Từ kết quả nghiên cứu, môi trường VKTS được lựa chọn để nuôi cấy 3 chủng và đánh giá ở các bước tiếp theo. - Riêng với chủng V96, môi trường nuôi cấy thích hợp hơn theo tuần tự là LB, thạch thường-glucose và VKTS. - Điều này ảnh hưởng trực tiếp đến việc tiết kiệm chi phí sản xuất chế phẩm trên quy mô công nghiệp nên môi trường thạch thường-glucose được lựa chọn để nuôi cấy chủng V98.. - 3.1.3 Ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến vi khuẩn tuyển chọn. - Bảng 3 cho thấy 4 chủng vi khuẩn đều có sinh khối và hoạt tính enzyme ngoại bào cao nhất tại pH 7, kết quả này đồng nhất với công bố vi khuẩn thường sinh trưởng thuận lợi ở pH dao động từ 6 đến 7,5 (Boyd, 1984).. - Bảng 3: Ảnh hưởng của pH đến 4 chủng vi khuẩn tuyển chọn. - Mức pH Chủng vi khuẩn Sinh khối (g/l) Hoạt tính enzyme (D-d, mm). - Trong suốt giai đoạn đầu của quá trình ủ phân hữu cơ, vi khuẩn phân huỷ các chất hữu cơ tạo ra các gốc axit hữu cơ, nên pH trong môi trường trở thành axit, có thể xuống đến mức 5. - tính hoặc thậm chí sang môi trường kiềm. - Khi đó, vi khuẩn đóng vai trò trung tâm một lần nữa khi pH tăng. - Kết quả đánh giá ở Bảng 3 cho thấy 4 chủng vi khuẩn tuyển chọn đều sinh trưởng và có hoạt tính 3 enzyme ngoại bào ở tất cả các mức pH từ 4 đến 9. - Bảng 4: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến 4 chủng vi khuẩn tuyển chọn Các chỉ tiêu Chủng vi. - Bảng 4 cho thấy ở nhiệt độ 50°C và 60°C mật độ và hoạt tính của các chủng vi khuẩn nghiên cứu đều giảm đi, trong đó chủng V96 mất khả năng thể. - Chủng vi khuẩn V19, V98 đều có khả năng sinh trưởng và có hoạt tính enzym mạnh trong phạm vi nhiệt độ từ 20 - 60°C, như vậy chủng vi khuẩn V19 và V98 là những chủng ưa nhiệt, có thể sử dụng tốt cho việc ủ chất thải hữu cơ.. - 3.1.4 Khả năng kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn tuyển chọn. - Bảng 5: Khả năng kháng kháng sinh Streptomycin của 4 chủng vi khuẩn tuyển chọn Chủng vi. - Môi trường tự nhiên là môi trường có nhiều biến động, vì vậy các chủng VSV được lựa chọn làm chế phẩm sử dụng trong điều kiện thực tế cần phải có khả năng đề kháng với sự bất lợi của môi trường. - Một trong những bất lợi đó là có nhiều VSV có khả năng tiết ra chất kháng sinh, là chất mà có thể giết hoặc ức chế sự sinh trưởng của VSV, đặc biệt là nhóm vi khuẩn. - Bảng 5 cho thấy 2 chủng V19, V98 có khả năng kháng kháng sinh tới nồng độ 1000 mg kháng sinh/l lít môi trường. - 3.2 Định danh chủng vi khuẩn V19 và V98 3.2.1 Định danh dựa vào đặc điểm hình thái. - Vi khuẩn V19 và V98 đều có khuẩn lạc tròn lồi, bóng nhầy, màu trắng đục, sinh trưởng rất nhanh trên môi trường nuôi cấy. - Vi khuẩn nhuộm màu Gram dương, hình que, có khả năng di chuyển;. - sinh trưởng trong môi trường glucose, không sinh trưởng trong môi trường arabinose, mannitol, xylose. - Quan sát dưới kính hiển vi điện tử quét thấy tế bào vi khuẩn V19 và V98 có dạng hình que kích thước đo được 2,81 μm × 0,8 μm, có roi (flagellum). - Hình 1: Khuẩn lạc và hình thái vi khuẩn V19 nhìn dưới kính hiển vi điện tử quét. - Hình 2: Khuẩn lạc và hình thái vi khuẩn V98 nhìn dưới kính hiển vi điện tử quét 3.2.2 Định danh bằng phương pháp sinh học. - Tuy nhiên, nhằm biết rõ hơn về các chủng vi khuẩn đã tuyển chọn được, so sánh với các công bố khác và để ứng dụng cụ thể thì cần định danh các chủng vi khuẩn này bằng phương pháp sinh học phân tử.. - Kết hợp với các kết quả nghiên cứu hình thái, sinh lý, sinh hóa và trình tự nucleotit 16S rRNA cho thấy chủng V19 là vi khuẩn thuộc loài Bacillus cereus. - nghiên cứu hình thái, sinh lý, sinh hóa và trình tự nucleotit 16S rRNA, xác định chủng V98 là vi khuẩn thuộc loài Bacillus toyonensis.. - Hình 4: Sản phẩm PCR với cặp mồi đặc thù cho vi khuẩn. - dựng bằng phần mềm MEGAS Hình 6: Bào tử vi khuẩn V98 nhìn dưới kính hiển vi điện tử quét. - Sonawale (2014) đã công bố nghiên cứu tách enzyme amylase từ vi khuẩn Bacillus toyonensis để ứng dụng trong công nghiệp. - 3.3 Thử nghiệm khả năng phân giải phụ phẩm sau thu hoạch quả vải từ chế phẩm của chủng V19 và V98. - Hai chủng vi khuẩn V19 và V98 được kiểm tra an toàn với cây trồng nên đã được sử dụng để sản xuất chế phẩm VSV theo phương pháp của Nguyễn Xuân Thành và ctv. - Bảng 6 thể hiện thông số tối ưu nhân sinh khối V19 và V98, thông số cơ bản đối với các chủng vi khuẩn thuộc giống Bacillus, kết quả này tương đồng với Trịnh Thành Trung và ctv (2013).. - Bảng 6: Thông số tối ưu để nhân sinh khối hai chủng vi khuẩn. - Thông số kỹ thuật Vi khuẩn V19 Vi khuẩn V98. - Môi trường nuôi cấy tối ưu * Vi khuẩn tổng số Vi khuẩn tổng số. - Bảng 8: Khả năng chuyển hóa phụ phẩm sau thu hoạch quả vải của chế phẩm VSV. - Chế phẩm từ V . - Chế phẩm V19 và V98 cho hiệu quả xử lý tương đương nhau, mức độ hoai mục của vật liệu ủ của 2 chế phẩm vi khuẩn này cao hơn so với dùng chế phẩm từ xạ khuẩn cũng được phân lập từ phụ phẩm quả vải (X10 - Streptomyces virginiae) (Đinh Hồng Duyên và ctv., 2015). - Trên cơ sở kết quả nghiên cứu này, vi khuẩn V19 và V98 có thể dùng để làm giống sản xuất chế phẩm VSV xử lý phụ phẩm sau thu hoạch quả vải.. - Nghiên cứu phân lập được 98 chủng vi khuẩn phân giải cellulose từ 300 mẫu phụ phẩm sau thu hoạch quả vải hoai mục tự nhiên, mẫu đất trồng và mẫu mùn đất. - Trong đó, xác định được hai chủng vi khuẩn V19 và V98 có hoạt tính cellulase, amylase, protease cao. - có khả năng sinh trưởng và thể hiện các hoạt tính enzyme ngoại bào tốt trên môi trường nuôi cấy, ở các điều kiện pH, nhiệt độ khác nhau. - Thông số tối ưu nhân sinh khối cho chủng V19 là môi trường vi khuẩn tổng số, pH 7, nhiệt độ 30 ºC, tỷ lệ tiếp giống 5%, lưu lượng cấp khí 0,65 lít không khí/lít môi trường/phút, tốc độ cánh khuấy. - Thông số tối ưu cho nhân sinh khối cho chủng V98 chỉ khác chủng V19 ở lưu lượng cấp khí là 0,7 lít không khí/lít môi trường/phút và tốc độ cánh khuấy là 250 vòng/phút.. - Tuyển chọn và đánh giá khả năng sử dụng xạ khuẩn để xử lý phụ phẩm sau thu hoạch quả vải. - Giáo trình công nghệ vi sinh vật trong nông nghiệp và xử lý ô nhiễm môi trường. - Đặc điểm sinh học và tiềm năng ứng dụng của chủng vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum sp 1901 phân lập tại rừng Quốc gia Hoàng Liên