- ỨNG DỤNG BROMELAIN ĐỂ SẢN XUẤT BỘT GIÀU ĐẠM AMIN TỪ VỎ ĐẦU TÔM (Litopenaeus vannamei). - Bromelain, đạm amin, đạm ammoniac, Litopenaeus vannamei, thủy phân Keywords:. - Đề tài nghiên cứu “Ứng dụng bromelain để sản xuất bột giàu đạm amin từ vỏ đầu tôm thẻ Litopenaeus vannamei)” được thực hiện nhằm sản xuất bột giàu đạm amin từ protein vỏ đầu tôm. - Kết quả khảo sát (nguyên liệu thô ban đầu cho thấy hàm lượng protein tổng số và ẩm độ của vỏ đầu tôm thẻ nguyên liệu lần lượt là 15,31% và 74,78%, và dịch trích bromelain từ vỏ khóm có hoạt tính đặc hiệu là 10,68 U.mg - 1 . - Việc khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ, nhiệt độ, thời gian và pH đến quá trình thủy phân protein vỏ đầu tôm cho thấy rằng 2 gram cơ chất vỏ đầu tôm được thủy phân bằng bromelain (10,68 U.mg – 1 ) từ vỏ khóm trong môi trường dung dịch đệm phosphate pH 8, nhiệt độ 45 0 C trong 4 giờ là điều kiện thích hợp với hàm lượng đạm amin và đạm ammoniac sinh ra lần lượt là mgN/mL và 0,256 mgN/mL. - Kết quả phân tích khối lượng phân tử protein bằng phương pháp điện di SDS - PAGE cũng cho thấy phần lớn protein vỏ đầu tôm được thủy phân hiệu quả bởi bromelain vỏ khóm và tạo ra sản phẩm thủy phân với những đoạn polypeptide ngắn có khối lượng phân tử phần lớn nhỏ hơn 14,4 kDa.. - Ứng dụng bromelain để sản xuất bột giàu đạm amin từ vỏ đầu tôm (Litopenaeus vannamei). - Đối với tôm được nuôi tại vùng khí hậu nhiệt đới thì đầu tôm thường chiếm khoảng từ 34 - 45% trong đó vỏ chiếm 10 - 15% (Barratt và Montano, 1986).. - Tuy nhiên, đây lại là nguồn enzim bromelain dồi dào có thể được tận dụng để thủy phân protein vỏ đầu tôm tạo ra sản phẩm giàu đạm amin có giá trị.. - Do đó, việc kết hợp giữa hai nguồn phụ phế phẩm từ vỏ đầu tôm thẻ và dịch trích bromelain từ vỏ khóm để sản xuất bột giàu đạm amin phục vụ nhu cầu thức ăn con giống trong chăn nuôi thủy sản, vật nuôi. - Vì thế, đề tài “Ứng dụng bromelain để sản xuất bột giàu đạm amin từ vỏ đầu tôm thẻ (Litopenaeus vannamei)” đã được thực hiện.. - Vỏ đầu tôm thẻ thu tại Công ty Cổ Phần Thủy Sản Cafatex, Quốc lộ 1A, Huyện Châu Thành A, Hậu Giang và được bảo quản lạnh trong thời gian chuyển về phòng thí nghiệm. - Vỏ đầu tôm được rửa nhanh và để ráo trước khi được nghiền bằng máy nghiền mẫu Retsch Miihle. - Ảnh hưởng của hoạt tính đặc hiệu bromelain vỏ khóm đến quá trình thủy phân protein đầu tôm: Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại. - Thủy phân 2 gram cơ chất đầu tôm bằng lượng hoạt tính đặc hiệu bromelain 0. - 30 U.mg -1 bromelain vỏ khóm ở nhiệt độ 38ºC trong 4 giờ. - Sản phẩm thủy phân được ly tâm 3500 vòng/phút trong 15 phút, dịch sau ly tâm dùng để xác định hàm lượng đạm ammoniac, đạm amin.. - Ảnh hưởng của nhiệt độ, thời gian và pH đến quá trình thủy phân protein đầu tôm bằng bromelain vỏ khóm: Thí nghiệm được bố trí tương tự như trên nhưng đối với các nhân tố lần lượt có các mức độ tương ứng là nhiệt độ phòng, 30ºC, 35ºC, 40ºC, 45ºC (nhân tố nhiệt độ). - Phương pháp phân tích: Hàm lượng nitơ tổng được khảo sát bằng phương pháp Kjeldahl (1883);. - hàm lượng đạm ammoniac được phân tích theo phương pháp của Peter (2003), hàm lượng đạm amin được xác định bằng phương pháp O- Phthalaldehyde - OPA (2003. - 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Thành phần hóa học vỏ đầu tôm. - Bảng 1: Thành phần cơ bản của vỏ đầu tôm thẻ chân trắng. - Thành phần Hàm lượng. - Kết quả khảo sát nguyên liệu vỏ đầu tôm cho thấy, hàm lượng ẩm độ là 74,78% thấp hơn so với các nghiên cứu của Gonçalves và Ribeiro (2009), Gunalan et al. - (2013) với kết quả lần lượt là . - Bên cạnh đó, hàm lượng protein trong vỏ đầu tôm của nghiên cứu là 15,31% cao hơn so với các nghiên cứu về protein vỏ đầu tôm của Teerasuntonwat và Raksakuithai (1995). - Kết quả cho thấy phụ phế. - phẩm vỏ đầu tôm có nguồn protein dồi dào thích hợp làm nguyên liệu cho quá trình thủy phân.. - Hàm lượng protein và hoạt tính bromelain vỏ khóm. - Kết quả này cao hơn so với nghiên cứu của Lại Thị Ngọc. - Như vậy, có thể ứng dụng bromelain vỏ khóm thủy phân protein vỏ đầu tôm để sản xuất bột giàu đạm amin.. - Bảng 2: Hàm lượng protein và hoạt tính tổng bromelain vỏ khóm. - Hoạt tính đặc hiệu (U.mg -1. - 3.1.1 Ảnh hưởng của hoạt tính đặc hiệu bromelain vỏ khóm đến quá trình thủy phân protein vỏ đầu tôm. - Kết quả phân tích (Hình 1) cho thấy trong giai đoạn đầu, đạm amin tăng lên rất nhanh ở nồng độ từ 0 đến 10 U.mg -1 (đạm amin từ đến mgN/mL). - Trong khi đó, ở nồng độ enzyme từ 15 đến 30 U.mg -1 thì hàm lượng đạm. - Thống kê số liệu cho thấy hàm lượng đạm amin ở hai nghiệm thức bổ sung 15 và 10 U.mg -1 là cao hơn và khác biệt có ý nghĩa thống kê so với các nghiệm thức còn lại và khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức đối chứng không bổ sung enzim. - Điều này cho thấy khi nồng độ enzim bromelain tăng lên thì vận tốc phản ứng thủy phân cũng tăng theo và đạt vận tốc cực đại ở nghiệm thức 10 U.mg -1 và duy trì tốc độ phản ứng cực đại ở nghiệm thức 15 U.mg -1. - Hình 1: Ảnh hưởng của hoạt tính đặc hiệu bromelain đến hàm lượng đạm trong dịch thủy phân CV đạm ammoniac = 1,76%. - CV đạm amin = 2,33%.. - Các giá trị có cùng ký tự thể hiện sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p<0,05) và là kết quả trung bình của 3 lần lặp lại. - Khi nồng độ enzim thấp thì hàm lượng đạm amin thấp là do lượng cơ chất cao đã kìm hãm hoạt động của enzim hoặc enzim có thể liên kết với nhiều cơ chất tạo thành phức hợp enzim - cơ chất không hoạt động (Phan Thị Trân Châu và Nguyễn Thị Áng, 2000). - giá trị thích hợp sẽ xúc tác quá trình thủy phân protein đầu tôm diễn ra mạnh nhất, sản phẩm sinh ra đạt cực đại. - Kết quả phân tích (Hình 1) cũng cho thấy hàm lượng ammoniac sinh ra ở nghiệm thức bổ sung 15 U.mg -1 bromelain cao hơn và khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức bổ sung 10 U.mg -1 bromelain . - Điều này là do nghiệm thức bổ sung 15 U.mg -1 bromelain có nồng độ đường cao sẽ tạo ra nhiều sản phẩm melanoidin, và kết quả kèm theo là hàm lượng NH 3. - Hình 2: Ảnh hưởng của nồng độ bromelain đến màu sắc của dịch thủy phân. - Kết quả quan sát màu của các nghiệm thức (Hình 2) cho thấy màu sắc của dịch thủy phân giữa các nồng độ bromelain có sự thay đổi rõ rệt. - Cụ thể, ở nồng độ bromelain 0 U.mg - 1 , khi không có sự hiện diện của dịch trích bromelain từ vỏ khóm nhưng dịch thủy phân vẫn có màu đỏ - nâu.. - Nguyên nhân là do enzim phenoloxidase (PO) hoặc polyphenoloxidase (PPO) có trong đầu tôm phản ứng với các axít min tự do làm sản phẩm sinh ra có sắc tố màu nâu (Whitaker, 1995. - Montero et al., 2001) hoặc có sự hiện diện của anion phosphate trong dung dịch đệm phosphate của quá trình thủy phân làm tăng sắc tố nâu trong phản ứng Maillard. - Song song đó, sự tương tác giữa nhiệt độ với vỏ đầu tôm dễ dàng hình thành sắc tố màu đỏ do sự biến tính của carotenoprotein dẫn đến phóng thích nhóm prosthetic (Teruhisa, 1972).. - 3.1.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình thủy phân protein vỏ đầu tôm. - Kết quả (Hình 3) cho thấy hàm lượng đạm amin giảm nhẹ từ nhiệt độ phòng, trung bình khoảng 32. - Nhưng khi tăng nhiệt độ lên 40 và 45 o C thì quá trình thủy phân tăng lên và hàm lượng đạm amin đạt cực đại lần lượt là mgN/mL và mgN/mL. - Kết quả này cũng tương tự với nghiên cứu của Mohapatra et al. - (2013), ghi nhận hoạt tính của bromelain vỏ khóm ở nhiệt độ 45 o C là cao nhất.. - Hình 3: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng đạm trong dịch thủy phân CV đạm ammoniac = 4,97%. - CV đạm amin = 4,15%.. - Các giá trị có cùng ký tự thể hiện sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p<0,05) và là kết quả của trung bình 3 lần lặp lại. - Hình 4: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến màu sắc của dịch thủy phân. - Khi nhiệt độ của phản ứng tăng từ nhiệt độ phòng đến 35 o C thì màu sắc của dịch thủy phân chủ yếu là màu nâu nhạt. - 3.1.3 Ảnh hưởng của thời gian đến quá trình thủy phân protein vỏ đầu tôm. - Kết quả (Hình 5) cho thấy, hàm lượng đạm amin thu được sau quá trình thủy phân, tăng lên từ 0 đến 4 giờ (từ mgN/mL đến mgN/mL), sau đó giảm dần từ 4 đến 16 giờ (từ mgN/mL đến mgN/mL). - Vì vậy, khi protein vỏ đầu tôm được ủ trong thời gian dài thì quá trình chuyển hóa axít amin thành ammoniac diễn ra càng mạnh. - Bên cạnh đó, hàm lượng đạm amin giữa hai nghiệm thức 0 giờ và 4 giờ ủ là khác biệt nhau có ý nghĩa thống kê và khác biệt có ý nghĩa thống kê với các nghiệm thức còn lại. - Điều này được giải thích là do bản thân trong mẫu cơ chất đầu tôm ban đầu luôn có sẵn một hàm lượng đạm amin cùng với quá trình tự thủy phân protein bởi enzim nội tại trong đầu tôm hoạt động khi mẫu cơ chất bị lưu một khoảng thời gian bên ngoài điều kiện nhiệt độ phòng trước khi enzim được bổ sung vào.. - Hình 5: Ảnh hưởng của thời gian đến hàm lượng đạm trong dịch thủy phân CV đạm ammoniac = 8,92%. - CV đạm amin = 5,26%. - Hình 6: Ảnh hưởng của thời gian đến màu sắc dịch thủy phân vỏ dầu tôm. - Bên cạnh sự ảnh hưởng của nồng độ, nhiệt độ đến màu sắc của dịch thủy phân protein vỏ đầu tôm thì thời gian cũng là một trong những nguyên nhân dẫn đến sự thay đổi màu sắc sản phẩm. - Kết quả (Hình 6) cho thấy, thời gian ủ càng lâu thì cường độ màu sắc của dịch thủy phân protein càng giảm.. - Theo đó, dịch thủy phân từ màu nâu tại thời điểm 0 giờ và 4 giờ chuyển sang màu nâu rất nhạt tại thời điểm từ 8 đến 16 giờ. - Theo Nguyễn Lân Dũng và Bùi Thị Việt Hà (2009), kéo dài thời gian thủy phân càng lâu trong môi trường thuận lợi cũng chính là điều kiện để cho vi sinh vật tăng mật số và dễ dàng tiết nhiều protease chuyển hóa axít amin thành ammoniac. - càng lâu thì cường độ màu sắc dịch thủy phân có xu hướng chuyển sang màu nâu nhạt dần đồng thời hàm lượng ammoniac tăng lên lần lượt tương ứng với kết quả của từng nghiệm thức là . - Bên cạnh đó, Godfrey và Reichelt (1983) cũng cho rằng khi enzim bromelain phản ứng ở nhiệt độ tối đa là 50 o C và thời gian thủy phân được chấp nhận cho các sản phẩm công nghiệp là ít hơn 4 giờ.. - 3.1.4 Ảnh hưởng của pH đến quá trình thủy phân protein vỏ đầu tôm. - Kết quả cho thấy hàm lượng đạm amin tăng lên từ môi trường có giá trị pH mgN/mL) và đạt cực đại ở môi trường pH 8 (4,679. - Trong khi đó, hàm lượng đạm ammoniac sinh ra là thấp nhất mgN/mL) ở điều kiện dung dịch đệm phosphate 0,1M, pH 8 và khác biệt có ý nghĩa thống kê so với các nghiệm thức còn lại.. - Hình 7: Ảnh hưởng của pH đến hàm lượng đạm trong dịch thủy phân CV đạm ammoniac = 6,04%. - CV đạm amin = 2,93%.. - Khi thay đổi giá trị pH môi trường thủy phân thì trạng thái ion hóa của phức enzim - cơ chất bị ảnh hưởng dẫn đến việc thay đổi vận tốc phản ứng (Lê Thị Anh Thư, 2008). - Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu của Liang et al. - Hình 8: Ảnh hưởng của pH đến màu sắc của dịch thủy phân. - Nhìn chung, màu sắc của dịch thủy phân được tạo ra bởi kết quả của phản ứng Maillard từ phản ứng giữa đường khử và axít amin không chỉ bị ảnh hưởng bởi nồng độ đường (từ nồng độ enzim được sử dụng bổ sung), nhiệt độ và thời gian mà giá trị pH môi trường còn cho thấy màu sắc của dịch thủy phân cũng bị ảnh hưởng mạnh (Hình 8). - Khi môi trường pH trong khoảng từ 4 đến 6 thì dịch thủy phân có màu nâu nhạt. - Nhưng khi pH tăng từ 7 đến 10, lúc này dịch thủy phân chuyển dần sang màu nâu sậm. - Kết quả điện di protein (Hình 9) cho thấy mẫu nguyên liệu đầu tôm có 3 loại polypeptides chủ yếu là 76,6 kDa, 55,4 kDa và 20 kDa. - Từ kết quả điện di mẫu thủy phân (Hình 10 và 11) cho thấy, sản phẩm dịch thủy phân vỏ đầu tôm ở môi trường pH 4 vẫn còn xuất hiện những phân tử protein có trọng lượng phân tử cao từ 79,43 kDa đến 58,88 kDa (Hình 9), tương tự dịch thủy phân protein vỏ đầu tôm ở pH 5 xuất hiện 4 băng với khối lượng phân tử 79,43 kDa đến 32,35 kDa (Hình 10). - Điều đó cho thấy một phần protein đã bị phân cắt bởi enzim bromelain trong quá trình thủy phân protein vỏ đầu tôm ở pH 5. - Bên cạnh đó, dịch thủy phân vỏ đầu tôm từ pH 6 đến 10 (Hình 10 và 11) hầu như còn rất ít các protein có khối lượng phân tử cao mà thay vào đó là các đoạn peptide có khối lượng phân tử dưới 14,4 kDa. - protein gần như được thủy phân thành các đoạn peptide có khối lượng phân tử thấp, cho thấy quá trình thủy phân vỏ đầu tôm bằng enzim bromelain đạt hiệu quả cao. - Kết quả này cũng phù hợp với nhận định của Rao et al. - (2007), cho rằng trong quá trình lên men chất thải vỏ đầu tôm, sự hòa tan protein tăng mạnh khi ở nồng độ pH cao. - Khi nồng độ pH càng tăng thì quá trình phân cắt protein vỏ đầu tôm của enzim bromelain vỏ khóm càng mạnh.. - Hình 9: Điện di đồ dịch protein vỏ đầu tôm. - Hình 10: Điện di đồ dịch thủy phân protein vỏ đầu tôm. - Hình 11: Điện di đồ của dịch thủy phân protein vỏ đầu tôm. - Với 10 U.mg -1 bromelain từ vỏ khóm đã thủy phân trên 2 gram cơ chất vỏ đầu tôm ở nhiệt độ 45 o C bằng môi trường đệm phosphate pH 8 trong 4 giờ thì hàm lượng đạm amin sinh ra là 4,679 mgN/mL cùng với hàm lượng đạm ammoniac sinh ra thấp nhất mgN/mL). - Kết quả phân tích điện di SDS - PAGE cũng cho thấy, protein của đầu tôm đã được thủy phân thành những sản phẩm, trong đó phần lớn có khối lượng phân tử nhỏ hơn 14,4 kDa.. - Đề nghị tiếp tục nghiên cứu ảnh hưởng của một số ion kim loại đến hoạt động của bromelain trong quá trình thủy phân protein đầu tôm.. - Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân protein đầu tôm thẻ (Litopenaeus vannamei)