Ứng dụng các hợp chất hữu cơ thay thế nguồn nitrate vô cơ trong môi trường nuôi cấy sinh khối và thử hoạt tính sinh học của cây lan kim tuyến (Anoectochilus formosanus Hayata) in vitro

- DOI:10.22144/ctu.jsi.2019.018 ỨNG DỤNG CÁC HỢP CHẤT HỮU CƠ THAY THẾ NGUỒN NITRATE VÔ CƠ TRONG MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY SINH KHỐI VÀ THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÂY LAN KIM TUYẾN (Anoectochilus formosanus HAYATA) in vitro.
- Anoectochilus formosanus Hayata, casein hydrolysate, cao nấm men, muối nitrate vô cơ, sinh khối in vitro.
- Việc nghiên cứu, sử dụng các hợp chất hữu cơ như cao nấm men và casein hydrolysate nhằm thay thế nguồn muối nitrate vô cơ trong môi trường nuôi cấy sinh khối lan kim tuyến in vitro để tạo nguồn dược liệu an toàn là rất cần thiết..
- Trong nghiên cứu này, chồi lan kim tuyến được cấy trên môi trường Albert’s có thành phần muối chứa gốc nitrate theo các tỉ lệ và 25.
- bổ sung vitamin của môi trường MS, 30 g/L sucrose và các hợp chất hữu cơ (cao nấm men và casein hydrolysate) có nồng độ 1,0.
- Sinh khối lan kim tuyến nuôi cấy trên các môi trường cho hiệu quả nhân sinh khối được đánh giá hoạt tính sinh học.
- Kết quả sau 6 tuần nuôi cấy cho thấy, môi trường thích hợp nhất cho sự nhân nhanh sinh khối lan kim tuyến là môi trường Albert’s có thành phần muối nitrate giảm 50% và 7 g/L cao nấm men với chiều cao cây đạt 9,4 cm/cây.
- Sinh khối thu nhận được trên môi trường này có hoạt tính sinh học tốt nhất với khả năng kháng oxi hoá cao (IC 50 = 2,40 mg/mL) và có khả năng kháng 4 chủng vi khuẩn là Pseudomonas aeruginosa.
- Ứng dụng các hợp chất hữu cơ thay thế nguồn nitrate vô cơ trong môi trường nuôi cấy sinh khối và thử hoạt tính sinh học của cây lan kim tuyến (Anoectochilus formosanus Hayata) in vitro.
- Cây lan kim tuyến A.
- Nghiên cứu được thực hiện nhằm đánh giá vai trò của các hợp chất hữu cơ trong việc thay thế các muối nitrate vô cơ trong môi trường nuôi cấy để từ đó tạo nguồn sinh khối lan kim tuyến in vitro đảm bảo an toàn cho người sử dụng..
- 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Khảo sát vai trò thay thế nguồn muối nitrate vô cơ của một số hợp chất hữu cơ lên khả năng gia tăng sinh khối cây lan kim tuyến in vitro.
- Mục tiêu: xác định vai trò của cao nấm men và casein hydrolysate trong việc thay thế nguồn nitrate vô cơ trong môi trường khoáng nhằm mục đích gia tăng sinh khối cây lan kim tuyến nuôi cấy in vitro..
- Môi trường nuôi cấy: môi trường Albert’s (Võ Thị Bạch Mai, 2003) có thành phần muối chứa gốc nitrate được giảm, bổ sung vitamin MS (Murashige and Skoog g/L sucrose kết hợp với các hợp chất hữu cơ (cao nấm men (yeast extract) và casein hydrolysate) có nồng độ khác nhau (1,0.
- Bảng 1: Tên nghiệm thức bổ sung các hợp chất hữu cơ kết hợp với thay đổi hàm lượng muối nitrate vô cơ Tỷ lệ muối nitrate.
- Nồng độ cao nấm men (g/L) Nồng độ casein hydrolysate (g/L).
- 3.1.1 Ảnh hưởng của cao nấm men (yeast extract) lên khả năng tăng sinh khối và giảm sử dụng nguồn nitrate vô cơ trong qui trình sản xuất sinh khối cây lan kim tuyến.
- Môi trường nuôi cấy bao gồm các thành phần khoáng đa lượng, vi lượng và vitamin.
- Việc bổ sung cao nấm men vào môi trường nuôi cấy nhằm tăng hàm lượng nitơ trong môi trường có chứa hàm lượng nitơ tương đối thấp hoặc không có nitơ để thúc đẩy sự tăng trưởng của cây trồng (Morel and Muller, 1964).
- Trong thí nghiệm này, ảnh hưởng của cao nấm men lên khả năng tăng sinh khối cây lan kim tuyến được khảo sát.
- Bảng 2: Ảnh hưởng của cao nấm men lên khả năng tăng sinh khối và giảm sử dụng nguồn nitrate vô cơ trong qui trình sản xuất sinh khối cây lan kim tuyến.
- N1 100% muối nitrate 1,20de 7,76defg 5,43cde 0,12de.
- N2 75% muối nitrate 1,19de 7,56efgh 5,70abcd 0,12de.
- N3 50% muối nitrate 1,14de 7,23gh 5,64abcd 0,12de.
- N4 25% muối nitrate 1,11e 7,69defgh 5,68abcd 0,11e.
- M1N1 1 g/L cao nấm men + 100% muối nitrate 1,14de 7,09h 5,18e 0,12de M1N2 1 g/L cao nấm men + 75% muối nitrate 1,63ab 8,50bc 5,90ab 0,17ab M1N3 1 g/L cao nấm men + 50% muối nitrate 1,35cde 8,15cd 5,30de 0,14cde M1N4 1 g/L cao nấm men + 25% muối nitrate 1,21de 7,42fgh 5,40cde 0,12de M2N1 3 g/L cao nấm men + 100% muối nitrate 1,35cde 7,73defg 5,80abc 0,14cd M2N2 3 g/L cao nấm men + 75% muối nitrate 1,37cde 7,81def 5,65abcd 0,14cd M2N3 3 g/L cao nấm men + 50% muối nitrate 1,39cd 8,74b 5,70abcd 0,14cd M2N4 3 g/L cao nấm men + 25% muối nitrate 1,22de 7,85def 5,45bcde 0,13de M3N1 5 g/L cao nấm men + 100% muối nitrate 1,79a 9,77a 5,50bcde 0,18a M3N2 5 g/L cao nấm men + 75% muối nitrate 1,81a 9,62a 5,80acb 0,19a M3N3 5 g/L cao nấm men + 50% muối nitrate 1,75ab 9,48a 5,70abcd 0,18a M3N4 5 g/L cao nấm men + 25% muối nitrate 1,68ab 8,05cde 5,45bcde 0,17ab M4N1 7 g/L cao nấm men + 100% muối nitrate 1,35cde 8,10cde 5,67abcd 0,14cde M4N2 7 g/L cao nấm men + 75% muối nitrate 1,82a 9,27a 5,43cde 0,19a M4N3 7 g/L cao nấm men + 50% muối nitrate 1,82a 9,41a 5,78abc 0,19a M4N4 7 g/L cao nấm men + 25% muối nitrate 1,54bc 8,40bc 5,97a 0,16bc Các mẫu ký tự khác nhau (a, b…) biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa với p ≤ 0,05 bằng phép thử Duncan.
- Sau 6 tuần nuôi cấy, mẫu cấy trên các môi trường có bổ sung cao nấm men tăng trưởng tốt hơn so với môi trường không bổ sung cao nấm men.
- Kết quả ghi nhận được cho thấy, cây lan kim tuyến tăng trưởng tốt nhất trên môi trường Albert’s chứa muối nitrate theo các tỉ lệ (100%.
- 50% và 25%) kết hợp bổ sung 5 g/L cao nấm men.
- Mẫu cấy trên môi trường này có khối lượng tươi đạt được lần lượt 1,79.
- Ở nghiệm thức bổ sung 1 g/L và 3 g/L cao nấm men, các chỉ tiêu tăng trưởng ghi nhận được thấp hơn và có sự khác biệt về mặt thống kê so với nghiệm thức bổ sung cao nấm men với nồng độ 5 g/L.
- Khi tăng nồng độ cao nấm men lên 7 g/L, kết quả cho thấy cao nấm men bắt đầu có sự ức chế tăng trưởng cây lan kim tuyến ở mức sử dụng 100% muối nitrate với khối lượng tươi đạt 1,35 g/mẫu, chiều cao cây đạt 8,10 cm, số lá trên mỗi mẫu đạt 5,67 và khối lượng khô là 0,14 g/mẫu.
- bổ sung cao nấm men ở nồng độ cao và thành phần muối nitrate 100% trong môi trường đã gây ra sự dư thừa nguồn nitơ dẫn đến ngăn cản sự tăng trưởng của cây.
- Khi giảm tỉ lệ sử dụng muối nitrate xuống mức 25%, khối lượng tươi đạt được là 1,54 g/mẫu, chiều cao cây đạt 8,40 cm với số lá 5,97 lá/mẫu và khối lượng khô là 0,16 g/mẫu.
- Điều này xảy ra có thể do nồng độ muối nitrate sử dụng thấp (25%) và thành phần nấm men bổ sung vẫn chưa cung cấp đủ lượng nitơ cần thiết cho cây phát triển (Bianco et al., 2015).
- Mẫu cấy tăng trưởng tốt hơn trên các môi trường có hàm lượng muối nitrate 75% và 50% có bổ sung cao nấm men nồng độ 7 g/L.
- Tuy nhiên, sự gia tăng này không có sự khác biệt về mặt thống kê so với nghiệm thức bổ sung 5 g/L cao nấm men ở cả hai tỉ lệ (75% và 50%) muối nitrate sử dụng trong môi trường Albert’s..
- Cao nấm men chứa nhiều chất dinh dưỡng thiết yếu cho cây trồng.
- Do đó, mẫu cấy trên các môi trường nuôi cấy có bổ sung cao nấm men phát triển tốt hơn môi trường không có bổ sung cao nấm men..
- Hình 1: Ảnh hưởng của cao nấm men lên khả năng tăng sinh khối và giảm sử dụng nguồn nitrate vô cơ trong qui trình sản xuất sinh khối cây lan kim tuyến (a1-a4.
- b1-b4: Sinh khối lan kim tuyến trong môi trường có thành phần muối nitrate vô cơ lần lượt là 100%.
- Sinh khối lan kim tuyến trong môi trường có bổ sung 7 g/L cao nấm nem và muối nitrate vô cơ lần lượt là 100%.
- Casein hydrolysate với các nồng độ khác nhau g/L) được bổ sung vào môi trường nuôi.
- Kết quả cho thấy nồng độ casein hydrolysate thích hợp cho sự tăng trưởng của cây lan kim tuyến khi bổ sung vào môi trường nuôi cấy là 5.
- g/L với các chỉ tiêu tăng trưởng tương ứng với các tỉ lệ muối nitrate sử dụng (100%.
- thức Nồng độ các chất bổ sung vào môi trường.
- N1 100% muối nitrate 1,20e 7,76efghi 5,43bcdef 0,12e.
- N2 75% muối nitrate 1,19e 7,56fghi 5,70abc 0,12e.
- N3 50% muối nitrate 1,14e 7,23i 5,64abcd 0,12e.
- N4 25% muối nitrate 1,11e 7,69efghi 5,68abcd 0,11e.
- C1N1 1 g/L casein hydrolysate + 100% muối nitrate 1,53abcd 8,68abc 5,43bcdef 0,16abcd C1N2 1 g/L casein hydrolysate + 75% muối nitrate 1,37cde 7,46ghi 5,13cdef 0,14cde C1N3 1 g/L casein hydrolysate + 50% muối nitrate 1,37cde 7,42hi 5,30bcdef 0,14cde C1N4 1 g/L casein hydrolysate + 25% muối nitrate 1,34cde 7,67efghi 5,15cdef 0,14cde C2N1 3 g/L casein hydrolysate + 100% muối nitrate 1,53abc 9,17a 5,30bcdef 0,16abc C2N2 3 g/L casein hydrolysate + 75% muối nitrate 1,53abc 8,17bcdef 5,50bcdef 0,16abc C2N3 3 g/L casein hydrolysate + 50% muối nitrate 1,51abcd 8,36bcde 5,30bcdef 0,16abc C2N4 3 g/L casein hydrolysate + 25% muối nitrate 1,26cde 8,12cdefg 5,60abcde 0,13cde C3N1 5 g/L casein hydrolysate + 100% muối nitrate 1,70a 8,85ab 5,05ef 0,17ab C3N2 5 g/L casein hydrolysate + 75% muối nitrate 1,66ab 8,69abc 5,50bcdef 0,17ab C3N3 5 g/L casein hydrolysate + 50% muối nitrate 1,65ab 8,35bcde 5,80ab 0,17ab C3N4 5 g/L casein hydrolysate + 25% muối nitrate 1,31cde 8,32bcde 5,20cdef 0,13cde C4N1 7 g/L casein hydrolysate + 100% muối nitrate 1,72a 8,21bcdef 6,10a 0,18a C4N2 7 g/L casein hydrolysate + 75% muối nitrate 1,39bcde 8,74abc 5,00f 0,14bcde C4N3 7 g/L casein hydrolysate + 50% muối nitrate 1,30cde 7,96defgh 5,00f 0,13cde C4N4 7 g/L casein hydrolysate + 25% muối nitrate 1,24de 8,64abcd 5,10def 0,13de Các mẫu ký tự khác nhau (a, b…) biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa với p ≤ 0,05 bằng phép thử Duncan.
- muối nitrate vô cơ lần lượt là 100%.
- Khi đánh giá về khả năng giảm sử dụng nguồn muối nitrate vô cơ, tất cả các nghiệm thức có bổ sung casein hydrolysate với các chỉ tiêu theo dõi đều cao hơn so với nghiệm thức đối chứng.
- Các chỉ tiêu đạt cao nhất trên môi trường sử dụng 100%.
- muối nitrate ở tất cả các nghiệm thức.
- Trong môi trường có bổ sung casein hydrolysate, chỉ tiêu tăng trưởng của các mẫu cấy trên các môi trường có hàm lượng muối nitrate sử dụng 75% hoặc 50% thấp hơn so với môi trường sử dụng 100% muối nitrate.
- Khi giảm hàm lượng muối nitrate sử dụng xuống còn 25%, các chỉ tiêu khối lượng tươi, chiều cao cây, số lá và khối lượng khô giảm mạnh so với môi trường sử dụng 100%.
- 75% hoặc 50% hàm lượng muối nitrate..
- Do đó, mẫu cấy trên các môi trường bổ sung casein hydrolysate đều phát triển tốt hơn so với mẫu cấy trên môi trường không bổ sung casein hydrolysate..
- 3.2 Khả năng kháng oxi hoá của sinh khối lan kim tuyến nuôi cấy trên môi trường bổ sung hợp chất hữu cơ.
- Cao chiết methanol thu nhận được từ sinh khối lan kim tuyến nuôi cấy trên các môi trường cảm ứng hiệu quả cho sự gia tăng sinh khối cây lan kim tuyến theo thống kê ở thí nghiệm 1 được dùng để khảo sát hoạt tính ức chế gốc tự do theo phương pháp DPPH..
- Bảng 4: Giá trị IC 50 của các mẫu sinh khối lan kim tuyến nuôi cấy trên môi trường bổ sung hợp chất hữu cơ.
- Nghiệm thức Nồng độ các chất bổ sung vào môi trường MS IC 50 (mg/mL).
- N1 100% muối nitrate 5,72.
- C3N1 5 g/L casein hydrolysate + 100% muối nitrate 3,67.
- C3N2 5 g/L casein hydrolysate + 75% muối nitrate 3,96.
- C3N3 5 g/L casein hydrolysate + 50% muối nitrate 6,41.
- C4N1 7 g/L casein hydrolysate + 100% muối nitrate 5,08.
- M1N2 1 g/L cao nấm men + 75% muối nitrate 5,83.
- M3N1 5 g/L cao nấm men + 100% muối nitrate 2,73.
- M3N2 5 g/L cao nấm men + 75% muối nitrate 5,46.
- M3N3 5 g/L cao nấm men + 50% muối nitrate 6,30.
- M3N4 5 g/L cao nấm men + 25% muối nitrate 2,56.
- M4N2 7 g/L cao nấm men + 75% muối nitrate 3,70.
- M4N3 7 g/L cao nấm men + 50% muối nitrate 2,40.
- Mẫu lan kim tuyến nuôi cấy trên môi trường bổ sung cao nấm men 7 g/L và có thành phần muối nitrate vô cơ giảm còn 50% có khả năng kháng oxi hoá cao nhất với giá trị IC 50 là 2,40 mg/mL, thấp hơn nhiều so với nghiệm thức đối chứng (IC 50 = 5,72 mg/mL).
- Các nghiệm thức bổ sung 7 g/L cao nấm men cho thấy hiệu quả kháng oxi hoá cao hơn hẳn các nghiệm thức bổ sung 1 g/L và 5 g/L cao nấm.
- Với thành phần cao nấm men là 7 g/L kết hợp với tỉ lệ muối nitrate sử dụng là 50%, mẫu cấy cho kết quả kháng oxi hoá tốt hơn nghiệm thức có hàm lượng muối nitrate sử dụng là 75%.
- Tương tự, với cùng thành phần cao nấm men.
- bổ sung là 5 g/L, nghiệm thức có hàm lượng muối nitrate sử dụng 25% có kết quả kháng oxi hoá tốt hơn các nghiệm thức có hàm lượng muối nitrate sử dụng cao hơn.
- Đối với các nghiệm thức bổ sung casein hydrolysate thì hiệu quả gia tăng khả năng kháng oxi hoá xảy ra đối với nghiệm thức có tỉ lệ muối nitrate vô cơ 100% và 75% kết hợp 5 g/L casein hydrolysate.
- Khi so sánh ở cùng một hàm lượng muối nitrate vô cơ sử dụng là 100%, nghiệm thức bổ sung casein hydrolysate 7 g/L có kết quả kháng oxi hoá cao hơn nghiệm thức đối chứng.
- 3.3 Khả năng kháng khuẩn của sinh khối lan kim tuyến nuôi cấy trên môi trường bổ sung hợp chất hữu cơ.
- Khả năng kháng khuẩn của các mẫu sinh khối lan kim tuyến thu nhận từ các môi trường nuôi cấy hiệu quả cho sự gia tăng sinh khối được thực hiện.
- Mẫu Nồng độ các chất bổ sung vào môi trường MS.
- N1 100% muối nitrate .
- muối nitrate - 9.
- muối nitrate .
- muối nitrate 8 12 - 7,5.
- M1N2 1 g/L cao nấm men + 75% muối.
- M3N1 5 g/L cao nấm men + 100%.
- M3N2 5 g/L cao nấm men + 75% muối.
- M3N3 5 g/L cao nấm men + 50% muối.
- M3N4 5 g/L cao nấm men + 25% muối.
- M4N2 7 g/L cao nấm men + 75% muối.
- M4N3 7 g/L cao nấm men + 50% muối.
- Ở thí nghiệm này, sinh khối nuôi cấy trên môi trường có nồng độ muối nitrate 100% đều cho hiệu quả kháng khuẩn tốt hơn sinh khối nuôi cấy trên môi trường có bổ sung hợp chất hữu cơ.
- Điều này có thể do sự tích lũy hợp chất thứ cấp có khả năng kháng khuẩn trong sinh khối nuôi cấy trên môi trường đối chứng diễn ra sớm hơn so với sinh khối nuôi cấy trên môi trường có bổ sung các hợp chất hữu cơ.
- Cao nấm men và casein hydrolysate đều cho thấy hiệu quả tích cực khi bổ sung vào môi trường nuôi cấy ở nồng độ thích hợp.
- Từ những kết quả đạt được cho thấy môi trường thích hợp nhất cho sự nhân nhanh sinh khối cây lan kim tuyến là môi trường Albert’s có thành phần muối nitrate giảm 50% và bổ sung 30 g/L sucrose, 7 g/L cao nấm men với chiều cao cây đạt được là 9,41 cm