- Chitin huyền phù, Litopenaeus vannamei, lysozyme, oligosaccharide, thủy phân. - Nghiên cứu được thực hiện nhằm khảo sát ảnh hưởng của thời gian, pH, nhiệt độ và nồng độ cơ chất lên quá trình thủy phân chitin bằng lysozyme từ lòng trắng trứng gà Hisex Brown để tạo bột oligosaccharide. - Hiệu suất của quá trình thủy phân ở mỗi nghiệm thức được đánh giá bởi hàm lượng đường khử tạo ra theo phương pháp của Schales. - Kết quả cho thấy hàm lượng đường khử tạo ra trong quá trình thủy phân bị ảnh hưởng đáng kể bởi thời gian, pH, nhiệt độ và nồng độ cơ chất (p <. - Điều kiện thích hợp để thủy phân chitin huyền phù bằng lysozyme được xác định ở nhiệt độ 65ºC, pH 5,5 trong thời gian 12 giờ với hàm lượng cơ chất chitin huyền phù là 0,1 mg/mL.. - Giá trị V max và K m trong quá trình thủy phân được ghi nhận có giá trị lần lượt là 0,225 µM/phút và 0,022 mg/mL. - Sản phẩm của quá trình thủy phân được đông khô trong 48 giờ và thu nhận được bột oligosaccharide hòa tan.. - Cùng với sự phát triển nuôi thì quá trình chế biến tôm tạo ra khoảng hơn 200.000 tấn phế phẩm vỏ tôm (bao gồm tôm thẻ chân trắng và tôm sú) hàng năm (Trung and Phuong, 2012). - Tuy vậy, vỏ tôm là nguồn nguyên liệu tiềm năng trong sản xuất chitin và các dẫn xuất có giá trị từ chitin với hoạt tính sinh học cao được ứng dụng nhiều trong các lĩnh vực y dược, thực phẩm, nông nghiệp.. - Tuy nhiên, do là polymer có khối lượng phân tử cao, độ tan thấp ở giá trị pH trung tính nên hoạt tính của chitin vẫn còn bị hạn chế (Ahmed et al., 2012). - 2.2 Phương pháp. - Phân đoạn F1 sau quá trình tinh sạch sẽ được thu, trữ lại và sử dụng cho nghiên cứu.. - Bột chitin thô được chuyển thành dạng chitin huyền phù theo phương pháp của Nguyễn Thị Hà (2012).. - Hàm lượng protein được xác định dựa vào phương pháp của Lowry (1951). - Hàm lượng chitin được xác định bằng phương pháp đo khối lượng còn sót lại sau khi xử lý vỏ tôm theo quy trình của Phạm Thị Đan Phượng và Trang Sĩ Trung (2012).. - Hàm lượng protein hòa tan của lysozyme được phân tích bằng phương pháp đo quang phổ theo Bradford (1976). - Hoạt tính đặc hiệu là tỷ số giữa hoạt tính và hàm lượng protein.. - 2.2.3 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng lên quá trình thủy phân chitin huyền phù tạo oligosaccharide bằng lysozyme. - Khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian lên quá trình thủy phân chitin huyền phù: Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, 3 lần lặp lại. - Chitin huyền phù (0,1 mg/mL) được thủy phân bằng lysozyme lòng trắng trứng (100 μL/mL) trong môi trường dung dịch đệm phosphate 0,05M pH 5,5 ở nhiệt độ 60 o C với các mốc thời gian thủy phân từ và 24 giờ.. - Khảo sát sự ảnh hưởng tương tác của pH và nhiệt độ lên quá trình thuỷ phân chitin huyền phù: Thí nghiệm được bố trí theo thể thức thừa số 2 nhân tố (pH và nhiệt độ), 3 mức độ cho nhân tố pH và 4 mức độ đối với nhân tố nhiệt độ và 75 o C).. - Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến tốc độ phản ứng thủy phân chitin huyền phù bằng lysozyme: Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, 3 lần lặp lại với 6 mức nồng độ chitin huyền phù (0,005. - Dịch thủy phân sau khi được ly tâm trong 10 phút với tốc độ 10.000 vòng/phút sẽ được đông khô trong 48 giờ để thu nhận bột oligosaccharide.. - Nồng độ đường khử sinh ra của sản phẩm thủy phân và bột oligosaccharide là các oligosaccharide hòa tan được xác định theo phương pháp Schales (Imoto and Yagishita, 1971).. - Giá trị. - 3.1 Thành phần hóa học vỏ tôm thẻ chân trắng và hoạt tính lysozyme. - Hàm lượng protein và chitin của vỏ tôm lần lượt là Bảng 1). - So với hàm lượng protein trong các nghiên cứu về vỏ tôm của Brasileiro et al.. - thì hàm lượng protein trong nghiên cứu này cao hơn.. - Hàm lượng chitin trong vỏ tôm thẻ chân trắng là 28,1% và thấp hơn so với nghiên cứu của Phạm Thị Đan Phượng và Trang Sĩ Trung (2012) là 29,4%.. - Nhìn chung, các giá trị này chênh lệch không lớn và đều thể hiện rằng chitin là một thành phần chính chiếm hàm lượng lớn trong vỏ tôm thẻ chân trắng.. - Các giá trị được tính trên khối lượng vật chất khô. - Hoạt tính đặc hiệu của lysozyme được trích ly và tinh sạch từ lòng trắng trứng gà Hisex Brown là 23.891 U/mg (Bảng 1), thấp hơn so với nghiên cứu của Mai Chí Linh và ctv. - Trong phương pháp thủy phân sinh học chitin bằng enzyme, ngoài chitinase là loại enzyme có khả năng cắt đặc hiệu với cơ chất chitin thì lysozyme cũng là một enzyme tiềm năng có thể được dùng trong quá trình thủy phân này (Jeon et al., 2000). - Với khả năng phân cắt được liên kết β-1,4-glycoside thì việc ứng dụng lysozyme sẽ thuận lợi hơn trong quá trình sản xuất chitin oligosaccharide khi sản phẩm thu được có sản lượng nhiều hơn với mức độ trùng hợp cao hơn.. - 3.2 Các yếu tố ảnh hưởng lên quá trình thủy phân chitin huyền phù tạo oligosaccharide bằng lysozyme. - 3.2.1 Sự ảnh hưởng của thời gian lên quá trình thủy phân chitin huyền phù. - Hàm lượng đường khử tạo ra trong quá trình thủy phân chitin huyền phù bằng lysozyme có xu hướng tăng dần theo thời gian (Hình 1). - Khi thời gian thủy phân tăng từ 4 giờ đến 24 giờ thì hàm lượng đường khử tăng từ 126 µM đến 150 µM.. - Nguyên nhân là do khi thời gian phản ứng càng dài thì lysozyme có khả năng tiếp xúc với lượng cơ chất chitin huyền phù càng nhiều, dẫn đến hàm lượng đường khử tạo ra tăng dần. - Tuy nhiên, quá trình này không phải là một quá trình tuyến tính, sau 12 giờ thì hàm lượng đường khử đã đạt được giá trị cao nhất là 150 µM, khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức 4 và 8 giờ, sau đó giá trị này tiếp tục giữ nguyên ở các mốc 16, 20 và 24 giờ. - Kết quả này chứng tỏ việc tăng thời gian thủy phân chitin huyền phù từ 12 đến 24 giờ sẽ không làm tăng thêm lượng sản phẩm do các sản phẩm này đã ức chế khả năng hoạt động của lysozyme. - Cụ thể, với nghiên cứu của Jolleès et al. - Xu hướng lượng đường khử tăng dần theo thời gian cũng đã từng được ghi nhận bởi các nghiên cứu của Skujins et al. - (1982) khi các nghiên cứu này lần lượt thủy phân chitin huyền phù và chitin được deacetyl hóa một phần bằng lysozyme. - Bên cạnh, với việc sử dụng các mốc thời gian thủy phân ngắn (cao nhất là 180 phút), các nghiên cứu này vẫn chưa thể hiện rõ được sự ảnh. - Chính vì vậy, với hàm lượng đường khử được tạo ra cao nhất trong thí nghiệm này (150. - µM), nghiệm thức thời gian thủy phân 12 giờ đã được chọn để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.. - Hình 1: Ảnh hưởng của thời gian đến hàm lượng đường khử sinh ra của phản ứng thủy phân chitin huyền phù bằng lysozyme. - Các giá trị có cùng ký tự thể hiện sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở mức 5%. - 3.2.2 Ảnh hưởng tương tác của pH và nhiệt độ lên quá trình thuỷ phân chitin huyền phù. - Hai nhân tố nhiệt độ và pH đều ảnh hưởng độc lập và tương tác đến quá trình thủy phân chitin. - huyền phù khi p <. - Hình 2: Ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến hàm lượng đường khử sinh ra trong quá trình thủy phân chitin huyền phù bằng lysozyme. - Quá trình thủy phân chitin huyền phù ở các nghiệm thức pH 5,5 thì tạo ra lượng đường khử cao hơn so với các nghiệm thức pH 4,5 và pH 6,5 (Hình 2). - Cụ thể, hàm lượng đường khử ở các mốc nhiệt độ tại pH 5,5 thì có giá trị nằm trong khoảng 149- 165 µM, trong khi tại pH 4,5 và pH 6,5 thì các giá trị này lần lượt nằm trong khoảng 113-149 µM và. - Như vậy, pH 5,5 là giá trị pH thích hợp cho lysozyme để thủy phân chitin huyền phù. - Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Thammasirirak et al. - (2001) khi nghiên cứu này cho rằng giá trị pH tối ưu cho lysozyme từ lòng trắng trứng gà để thủy phân glycol chitin là vào khoảng pH 5. - So với giá trị pH thích hợp để thủy phân thành peptidoglycan ở vi khuẩn là khoảng 6,2 (Smolelis and Hartsell, 1951). - Hàm lượng đường khử (μM). - Thời gian (giờ). - Nhiệt độ (ºC). - thì lysozyme cần một môi trường có tính acid hơn để thủy phân các liên kết β-1,4-glycoside của cấu trúc chitin. - Tóm lại, pH là nhân tố ảnh hưởng trực tiếp đến mức độ ion hóa, cấu trúc và tính ổn định của trung tâm hoạt động cũng như ái lực liên kết giữa cơ chất và enzyme, vì thế các enzyme cũng như lysozyme đều cần môi trường pH thích hợp đối với từng loại cơ chất khác nhau.. - Tại giá trị pH 5,5, khi tăng dần nhiệt độ từ 45 o C đến 65 o C thì hàm lượng đường khử tạo ra tăng dần và đạt giá trị cao nhất tại nhiệt độ 65 o C (165 µM), khác biệt có ý nghĩa thống kê so với các nghiệm thức còn lại (Hình 2) và vận tốc phản ứng thủy phân chitin huyền phù của lysozyme tăng dần theo nhân tố nhiệt độ. - Tuy nhiên, khi nhiệt độ được tăng đến 75 o C thì hàm lượng đường khử tạo ra lại giảm xuống còn 158 µM. - Nguyên nhân là do ở nhiệt độ quá cao thì lysozyme có thể bị biến tính dẫn đến tốc độ phản ứng thủy phân giảm dần, tương tự như phát hiện của Fleming và Allision (1922) khi nghiên cứu này gây bất hoạt lysozyme ở nhiệt độ 75 o C.. - Một xu hướng khác, các nghiệm thức pH 4,5, hàm lượng đường khử có xu hướng tăng dần theo nhiệt độ và duy trì ở giá trị khoảng 149 µM tại 65 o C và 75 o C. - Xu hướng kết quả này cũng đã được ghi nhận trong nghiên cứu của Thammasirirak et al.. - (2001) khi hoạt tính thủy phân chitin của lysozyme đạt giá trị cao nhất tại khoảng 65 - 75 o C trong môi trường pH 4,75. - Theo Smolelis and Hartsell (1951) lysozyme có khả năng chịu nhiệt tốt hơn khi được hòa tan trong môi trường đệm có tính acid và enzyme này chỉ bị mất hoàn toàn hoạt tính ở nhiệt độ cao khi giá trị pH lớn hơn 7. - Do đó, so với các nghiệm thức ở pH 4,5 và pH 5,5 thì lysozyme ở môi trường pH 6,5 có khả năng chịu nhiệt kém hơn, dẫn đến hàm lượng đường khử tạo ra ở vùng pH này giảm dần sau mốc nhiệt độ 65 o C.. - Những kết quả trên cho thấy, để đảm bảo lysozyme có thể thủy phân tốt chitin huyền phù, nghiệm thức pH 5,5 ở nhiệt độ 65 o C đã được chọn để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo của nghiên cứu.. - 3.2.2 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất chitin huyền phù lên hoạt tính lysozyme. - Khi tăng dần nồng độ cơ chất chitin huyền phù, vận tốc thủy phân của lysozyme tăng dần và đạt giá trị cao nhất là 0,2150 µM/phút tại nồng độ 0,1 mg/mL (Hình 3), khác biệt có ý nghĩa thống kê so. - với các nghiệm thức có nồng độ cơ chất từ 0,01 đến 0,05 mg/mL. - Tuy nhiên, khi tiếp tục tăng nồng độ cơ chất từ 0,1 mg/mL đến 0,3 mg/mL thì hoạt tính lysozyme gần như không tăng thêm khi vận tốc thủy phân ở các nghiệm thức này khác biệt không có ý nghĩa về mặt thống kê. - Nguyên nhân do khi nồng độ cơ chất thấp, lượng lysozyme có trong phản ứng sẽ ngay lập tức kết hợp với các cơ chất để tạo thành phức chất “enzyme-cơ chất” rồi bắt đầu thủy phân tạo sản phẩm. - Vận tốc thủy phân sẽ đạt được giá trị cực đại khi toàn bộ lượng enzyme liên kết được với cơ chất và vận tốc này sẽ không tăng thêm dù lượng cơ chất có được bổ sung tiếp tục (Michaelis and Menten, 1913).. - Sự ảnh hưởng của nồng độ cơ chất chitin huyền phù lên tốc độ thủy phân của lysozyme được thể hiện ở Hình 3 theo 2 phương trình Lineweaver-Bur và Michaelis-Menten. - Có thể thấy rằng, nồng độ cơ chất chitin huyền phù và tốc độ thủy phân của lysozyme có mối tương quan chặt chẽ với nhau khi hệ số R 2 ở phương trình Lineweaver-Bur có giá trị là 0,965. - Vận tốc thủy phân của lysozyme phụ thuộc rất nhiều vào nồng độ chitin huyền phù có trong phản ứng. - Ngoài ra, tốc độ thủy phân của lysozyme còn được biểu diễn dưới dạng một hàm của nồng độ cơ chất với hình dạng đường cong theo phương trình Michaelis-Menten (Hình 3B), tuân theo phản ứng bậc một (first order kinetic) ở các nghiệm thức có nồng độ cơ chất thấp và phản ứng bậc không (zero order kinetic) ở các nghiệm thức có nồng độ cơ chất cao. - Giá trị vận tốc cực đại (V max ) và hằng số Michelis Menten (K m ) trong quá trình thủy phân chitin huyền phù được ghi nhận có giá trị lần lượt là 0,225 µM/phút và 0,022 mg/mL. - So với nghiên cứu của Pangburn et al. - (1982) về quá trình thủy phân của lysozyme trên cơ chất chitin được khử một phần gốc acetyl (partially deacetyled chitin) thì tốc độ phản ứng thủy phân của lysozyme trên cơ chất chitin huyền phù được thể hiện trong nghiên cứu này chậm hơn. - Nguyên nhân có thể là do tính chất khác nhau của 2 loại cơ chất. - Trong khi chitin huyền phù là dạng chitin có khối lượng phân tử nhỏ lơ lửng trong môi trường phản ứng thì chitin được khử một phần gốc acetyl là dẫn xuất của chitin có khả năng hòa tan được trong nước. - Do đó, cơ chất này đã hỗ trợ tích cực cho quá trình thủy phân của lysozyme.. - Những kết quả trên, với vận tốc thủy phân cực đại là 0,225 µM/phút, nồng độ chitin huyền phù 0,1 mg/mL được xem là nồng độ thích hợp cho quá trình thủy phân chitin huyền phù bằng lysozyme.. - Hình 2: Sự phụ thuộc tốc độ phản ứng của lysozyme vào nồng độ cơ chất chitin huyền phù theo phương trình Lineweaver-Burk (A) và Michaelis-Menten (B). - 7,69 Sản phẩm thủy phân được đông khô 48 giờ thu. - Kết quả mô tả này phù hợp với nghiên cứu của Ngo et al. - (2009) khi nghiên cứu này đã tiến. - Hình 4: Bột vỏ tôm (A). - Điều kiện thích hợp để thủy phân chitin huyền phù bằng lysozyme để tạo chế phẩm oligosaccharide là ở nhiệt độ 65ºC, pH 5,5 trong thời gian 12 giờ.. - Vận tốc thủy phân chitin huyền phù với nồng độ 0,1 mg/mL của lysozyme lòng trắng trứng gà đạt vận tốc cực đại là 0,225 µM/phút, và giá trị hằng số K m. - Nghiên cứu khoa học sinh viên. - Nghiên cứu tách chiết chitin từ đầu - vỏ tôm bằng các phương pháp sinh học