- Nguyễn Thị Tuyền Vi khuẩn oxy hóa fe(ii) và khử nitrate ở việt nam: tính đa dạng và tiềm năng ứng dụng Luận văn thạc sĩ khoa học Hà Nội - 2009. - Nguyễn Thị Tuyền Vi khuẩn oxy hóa fe(ii) và khử nitrate ở việt nam: tính đa dạng và tiềm năng ứng dụng Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60 42 40. - Quá trình oxy hóa Fe(II) nhờ vi khuẩn. - Lịch sử nghiên cứu vi khuẩn oxy hóa Fe(II) (FOM). - Vai trò của vi khuẩn trong chu trình oxy hóa - khử sắt. - Vi khuẩn hiếu khí oxy hóa Fe(II) ở pH trung tính. - Vi khuẩn quang hợp kỵ khí oxy hóa Fe(II). - Vi khuẩn kỵ khí oxy hóa Fe(II). - Khử nitrate nhờ vi khuẩn. - Vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate. - ý nghĩa của việc nghiên cứu tính đa dạng di truyền và tiềm năng ứng dụng của các vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate. - Các phương pháp sinh học phân tử hiện đại được sử dụng trong các nghiên cứu về tính đa dạng và cấu trúc di truyền của quần xã vi khuẩn. - Xác định số lượng vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate. - Phân lập vi khuẩn kỵ khí oxy hóa Fe(II), khử nitrate. - Xác định số lượng vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate tại các môi trường sinh thái khác nhau. - Phân tích cấu trúc quần xã vi khuẩn bằng điện di biến tính (DGGE). - Đánh giá đa dạng di truyền vi khuẩn trong các môi trường nghiên cứu bằng phương pháp FISH. - Mức độ oxy hóa Fe(II) và khử nitrate của vi khuẩn trong các mẫu nghiên cứu. - Phân lập vi khuẩn oxy hoá Fe(II), khử nitrate từ các mẫu nghiên cứu. - Đánh giá tính đa dạng di truyền của các chủng vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate bằng phương pháp ARDRA. - Nghiên cứu đặc điểm sinh lý, phân loại và hoạt tính sinh học của các chủng vi khuẩn đại diện. - Vi khuẩn dùng ion Fe(II) làm nguồn cho điện tử để khử nitrate được phân lập đầu tiên từ các lớp trầm tích ao, hồ nước ngọt tại Bremen, Đức năm 1996 (Straub và cs, 1996). - Các nghiên cứu về nhóm vi khuẩn này ở châu Âu với điều kiện sinh thái hoàn toàn khác biệt với nước ta.. - Tiếp sau đó, vào năm 1996 Straub và cộng sự lần đầu tiên phân lập được vi khuẩn kỵ khí oxy hóa Fe(II), khử nitrate (Straub và cs, 1996). - Năm 1997 lần đầu tiên vi khuẩn vi hiếu khí ở pH trung tính có khả năng oxy hóa Fe(II) được phân lập và mô tả đặc điểm bởi Emerson và Moyer năm 1997 (Emerson và Moyer, 1997).. - Trước khi phản ứng oxy hóa khử nhờ vi khuẩn được phát hiện ra thì cơ chế vô sinh đã được cho là chi phối quá trình oxy hóa khử sắt trong môi trường. - Nhiều loài vi khuẩn, kể cả vi khuẩn cổ, có khả năng sử dụng thế oxy hóa khử của cặp Fe(II)/Fe(III) (+770 mV đối với môi trường acid. - Hầu hết các nghiên cứu và công bố về quá trình oxy hóa Fe(II) đều tập trung vào các vi khuẩn hiếu khí, ưa acid như Thiobaccillus ferrooxidans (Temple và Colmer, 1951. - Sự cạnh tranh của các vi khuẩn hiếu khí có khả năng oxy hóa Fe(II) (FOM) với động học của quá trình oxy hóa vô sinh Fe(II) bằng O2 đã được chứng minh là góp phần hoàn thiện chu trình sắt trong môi trường hiếu khí (Emerson và Moyer, 1997. - Quá trình oxy hóa Fe(II) nhờ vi khuẩn đi kèm với khử oxy ở pH trung trính và acid đã được biết đến trong hơn một thế kỷ nay. - Vi khuẩn quang hợp kỵ khí là vi khuẩn oxy hóa Fe(II) bằng con đường kỵ khí được biết điến đầu tiên (Widdel và cs, 1993). - Những nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng vi khuẩn quang hợp oxy hóa Fe(II) không có khả năng sử dụng Fe(II) ở dạng khoáng mà chỉ có thể oxy hóa Fe(II) ở dạng ion hòa tan (Kappler và Newman, 2004), do đó chúng chỉ đóng vai trò nhỏ trong quá trình oxy hóa - khử sắt và sự phong hóa sắt trong môi trường trên cạn.. - Trong môi trường không có oxy, quá trình oxy hóa Fe(II) nhờ vi khuẩn đã được chứng minh là thường đi kèm với quá trình khử perchlorate, chlorate và đặc biệt là nitrate (Straub và cs, 1996. - Khử nitrate nhờ vi khuẩn Hình 2. - Các loài vi khuẩn cố định nitơ được chia vào hai nhóm (1) các loài sống cộng sinh trong nốt sần ở rễ của thực vật (Rhizobium) và (2) các loài sống tự do trong đất, tập trung quanh vùng rễ thực vật (Azotobacter) (Shapleigh, 2000). - Nitrate hoá là quá trình chuyển hoá ammonium thành nitrate do hai nhóm vi khuẩn riêng biệt đảm nhiệm. - Những môi trường này chứa quần xã vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate khoảng 103 - 5ì108 tế bào/g trầm tích tham gia vào chu trình oxy hóa - khử sắt. - Trong tất cả các vi khuẩn được biết đến, oxy hóa Fe(II) luôn đi kèm với khử nitrate thành N2 (Straub và cs, 1996. - Đáng chú ý là hầu hết các thí nghiệm làm giàu hay nuôi cấy vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate đã tiến hành đều phụ thuộc vào nguồn carbon hữu cơ (như Na-acetate) (Straub và cs, 1996. - Vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate tự dưỡng mới chỉ được biết đến với hai chủng Ferroglobus placidus, là một vi khuẩn cổ ưa nhiệt (Hafenbradl và cs, 1996) và chủng 2002, là vi khuẩn ưa ấm thuộc phân lớp β-Proteobacteria (Weber và cs, 2006 b).. - Tuy nhiên, quá trình oxy hóa Fe(II) ở vi khuẩn hiếu khí, ưa acid Acidithiobacillus ferrooxidans đã được nghiên cứu khá chi tiết. - Cơ chế tạo năng lượng trong quá trình oxy hóa Fe(II) ở vi khuẩn A. - Khó khăn trong việc nghiên cứu có thể là do môi trường sống kỵ khí của những vi khuẩn quyết định hoặc là do trong môi trường pH trung tính, cơ chất và sản phẩm của quá trình oxy hóa Fe(II) ít hòa tan gây khó khăn trong quá trình nghiên cứu sinh lý cũng như di truyền hay cơ chế chuyển hóa diễn ra trong tế bào (Straub và cs, 2001).. - ý nghĩa của việc nghiên cứu tính đa dạng di truyền và tiềm năng ứng dụng của các vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate Với khả năng hô hấp kỵ khí bằng nitrate, vi khuẩn oxy hóa Fe(II) khử nitrate có thể tham gia vào quá trình loại bỏ nitơ trong các nguồn nước thải hay nước sinh hoạt có nồng độ nitơ cao. - Do tác động của vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate, cùng một lúc ion Fe(II) và nitrate dư trong nguồn nước có thể được loại bỏ. - Còn trong nước thì chưa có nghiên cứu nào đề cập đến nhóm vi khuẩn tiềm năng này.. - Các phương pháp sinh học phân tử hiện đại được sử dụng trong các nghiên cứu về tính đa dạng và cấu trúc di truyền của quần xã vi khuẩn 1.7.1.. - ARDRA được sử dụng để phân tích quần xã vi khuẩn trong các môi trường khác nhau (Moyer và cs, 1994. - Hóa chất sử dụng nuôi cấy vi khuẩn: Các chất khoáng (bảng 1), vi lượng (bảng 2), vitamine (bảng 2), chất cho điện tử (FeSO4 và MnSO4), chất nhận điện tử (NaNO3), khí N2 và CO2.. - Môi trường khoáng kỵ khí nước ngọt và nước lợ cho vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate (Ratering, 1999).. - Số lượng vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate được xác định thông qua phương pháp MPN (American Public Health Association, 1969). - ống MPN ở nồng độ pha loãng cao nhất có vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate phát triển được sử dụng để làm nguồn phân lập các khuẩn lạc đơn. - Xác định số lượng vi khuẩn oxy hoá Fe(II), khử nitrate trong các môi trường sinh thái khác nhau. - Số lượng vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate xác định thông qua phương pháp MPN.. - Đây là những môi trường có sự tham gia hoạt động tích cực của vi khuẩn trong chu trình chuyển hoá sắt và nitơ (Ratering và Schnell, 2001). - Số lượng vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate trong các mẫu bùn đáy và trầm tích thu thập tại ba môi trường sinh thái khác nhau được xác định thông qua phương pháp MPN (Most Probable Number) sử dụng môi trường dịch thể chứa FeSO4 làm chất cho điện tử và NaNO3 làm chất nhận điện tử cuối cùng. - Sự phát triển của vi khuẩn sinh trưởng nhờ oxy hoá Fe(II) đồng thời với khử nitrate trong các ống MPN được nhận biết thông qua sự biến đổi màu sắc của môi trường từ trắng xanh (màu của Fe(II)) sang màu vàng nâu (màu của Fe(III)) (hình 8A).. - Mật độ và mối tương quan giữa số lượng vi khuẩn oxy hoá Fe(II), khử nitrate với các điều kiện môi trường tại mỗi vùng sinh thái như trên cũng đã được tìm thấy trong một số nghiên cứu trước đây. - Bên cạnh đó, nhiều nghiên cứu khác cũng cho thấy số lượng vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate tại nhiều vùng sinh thái khác nhau trên thế giới dao động trong khoảng từ 1 ì 103 đến 5 ì 108 tế bào/g mẫu khô (Straub và cs, 1996. - Phương pháp điện di biến tính - DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) được ứng dụng phổ biến trong nghiên cứu đa dạng, phân tích cấu trúc di truyền của quần xã vi khuẩn cũng như xác định các nhóm vi khuẩn chiếm ưu thế trong các môi trường sinh thái khác nhau (Norris và cs, 2002. - Với mục đích xác định nhóm vi khuẩn oxy hoá Fe(II), khử nitrate chiếm ưu thế tại các môi trường nghiên cứu, chúng tôi tiến hành phân tích cấu trúc quần xã vi khuẩn trong các ống MPN ở độ pha loãng 10(3 (là nồng độ gần tới hạn của dãy MPN đối với cả 3 mẫu) bằng phương pháp PCR-DGGE đoạn gen 16S rDNA (hình 9). - Phổ điện di biến tính (DGGE) phân tích đoạn 16S rDNA của quần xã vi khuẩn trong các ống MPN của các mẫu nghiên cứu. - Có thể thấy rằng nhóm vi khuẩn thuộc chi Anaeromyxobacter có mặt trong cả 3 dạng môi trường nghiên cứu. - Tuy nhiên, trong môi trường nước lợ bằng phương pháp này hiện chưa xác định được nhóm vi khuẩn chiếm ưu thế. - Hình ảnh hiển vi của tế bào vi khuẩn trong các mẫu nghiên cứu bắt cặp với đầu dò huỳnh quang. - Theo kết quả nghiên cứu của một số công trình đã công bố, nhóm vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate thường thuộc vào phân lớp. - Kết quả phân tích đa dạng di truyền vi khuẩn trong các mẫu nghiên cứu bằng phương pháp FISH.. - Hiện tượng này có thể lý giải bằng sự có mặt của nhóm vi khuẩn Anaeromyxobacter trong cả 3 mẫu phân tích (kết quả thí nghiệm điện di biến tính, mục 3.2) cùng với các nhóm vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate làm chuyển hoá liên tục giữa Fe(III) và Fe(II) trong môi trường.. - Hoạt tính oxy hoá Fe(II) (A) và khử nitrate (B) của quần xã vi khuẩn tại ba môi trường nghiên cứu sau khi đã làm giàu thông qua phương pháp MPN. - Phân lập vi khuẩn oxy hoá Fe(II), khử nitrate từ các mẫu nghiên cứu Song song với các phương pháp phân tích đa dạng và cấu trúc di truyền quần xã vi khuẩn không qua bước phân lập và nuôi cấy như phương pháp PCR-DGGE và FISH đã tiến hành ở phần trên, chúng tôi tiếp tục tiến hành phân lập các chủng vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate đại diện với mục đích (i) đánh giá mức độ đa dạng di truyền của quần xã vi sinh vật thông qua phân lập và nuôi cấy. - Phân lập vi khuẩn oxy hoá Fe(II), khử nitrate đại diện tại các môi trường nghiên cứu. - Nuôi cấy chủng đơn vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate trong môi trường dịch thể ở điều kiện kỵ khí hoàn toàn.. - Vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate được phân lập theo phương pháp pha loãng trên dãy ống thạch bán lỏng (1%) đến độ pha loãng 10-8 (Widdel và Bak, 1992) (hình 13A). - Vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate phân lập được từ các môi trường nghiên cứu. - Tính đa dạng di truyền của 12 chủng vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate đã phân lập ở trên được phân tích bằng phương pháp ARDRA (Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis) sử dụng hai enzyme giới hạn HaeIII và MspI (hình 14). - Kết quả thu được cho thấy 12 chủng vi khuẩn này có thể xếp vào 5 nhóm di truyền khác nhau (bảng 9). - Phổ điện di gen 16S rDNA của 12 chủng vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate sau khi xử lý bằng các enzyme giới hạn HaeIII và MspI. - Tính đa dạng di truyền về di truyền của 12 chủng vi khuẩn oxy hóa Fe(II) khử nitrate đã phân lập (IN1 - IN12) dựa trên phân tích ARDRA.. - Chủng vi khuẩn. - subtilis là loài vi khuẩn được chọn làm outgroup.. - Paracoccus là chi vi khuẩn nằm trong phân lớp (-Proteobacteria, gồm các loài sinh trưởng kỵ khí tuỳ tiện, hô hấp bằng nitrate hoặc oxy (Schapleigh, 2000). - Bằng phương pháp PCR-DGGE trình bày ở trên, nhóm vi khuẩn chiếm ưu thế trong môi trường nước lợ chưa xác định được. - Hai chủng vi khuẩn IN2 và IN12 đại diện cho hai nhóm vi khuẩn chiếm ưu thế trong các môi trường nghiên cứu là Anaeromyxobacter và Paracoccus (phần 3.6). - Để tìm hiểu khả năng ứng dụng của nhóm vi khuẩn oxy hoá Fe(II), khử nitrate, chúng tôi tiến hành nghiên cứu các đặc điểm sinh lý của hai chủng này.. - Đặc điểm sinh lý của hai chủng vi khuẩn IN2 và IN12. - Trong nghiên cứu này, lần đầu tiên vi khuẩn Anaeromyxobacter mà đại diện là chủng IN2 thể hiện khả năng sinh trưởng bằng oxy hoá Fe(II), khử nitrate, tuy nhiên hình thức sinh trưởng này không vượt trội so với sinh trưởng kỵ khí khử Fe(III). - Nghiên cứu này chỉ ra rằng trầm tích có chứa các chủng vi khuẩn Geobacter sp. - Khác với IN2, chủng IN12 là một vi khuẩn oxy hoá Fe(II) khử nitrate điển hình. - trong môi trường do tác động của chủng vi khuẩn IN12.. - Số lượng vi khuẩn oxy hoá Fe(II), khử nitrate trong các mẫu bùn thu thập ở thủy vực nước ngọt, chân ruộng ngập nước và vùng nước lợ ven biển nằm trong khoảng 103 - 104 tế bào/g, trong đó mẫu bùn ở chân ruộng ngập nước có số lượng tế bào vi khuẩn này cao hơn cả tế bào/g). - Paracoccus và Pseudomonas là hai nhóm vi khuẩn chính thực hiện quá trình oxy hoá Fe(II), khử nitrate tương ứng ở mẫu bùn đáy ao và chân ruộng ngập nước. - Vi khuẩn oxy hoá Fe(II), khử nitrate tại các môi trường nghiên cứu có tính đa dạng khá cao. - Nghiên cứu tìm giá thể phù hợp để tạo chế phẩm chứa vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate.. - Nghiên cứu thử nghiệm áp dụng vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate để xử lý nước ngầm nhiễm sắt và nitơ.. - Đa dạng vi khuẩn oxy hoá Fe(II), khử nitrate tại một số môi trường sinh thái ở Việt Nam. - Nghiên cứu vi khuẩn ưu thế tham gia chu trình Fe trong các điều kiện môi trường khác nhau tại Việt Nam. - Đa dạng vi khuẩn khử nitrate trong một số môi trường sinh thái ở Việt Nam và các chủng đại diện. - Nghiên cứu đa dạng vi khuẩn oxy hoá Fe(II), khử nitrate tại một số môi trường sinh thái ở Việt Nam và khả năng ứng dụng.. - Trình tự gen 16S rDNA của chủng vi khuẩn Anaeromyxobacter sp. - Trình tự gen 16S rDNA của chủng vi khuẩn Paracoccus sp