- Qui trình vi nhân giống cỏ Vetiver (Vetiveria zizanioides) với giá thành thấp được phát triển. - Môi trường Murashige và Skoog (MS) lỏng có bổ sung 2-4 mg BA/lít cho hiệu quả nhân giống tốt nhất, trung bình khoảng 8 chồi mới/chồi từ một chồi ban đầu sau 6 tuần nuôi cấy. - Giai đoạn nhân chồi và giai đoạn ra rễ in vitro có thể thực hiện ngoài điều kiện môi trường tự nhiên của nhà lưới thay vì trong phòng tăng trưởng. - Không có sự khác biệt thống kê về sinh trưởng của cây giữa 2 điều kiện ngoại cảnh nuôi cấy cỏ vetiver và khả năng sống sót gần 100% sau 10 tuần đem ra ngoài nhà lưới. - Sử dụng môi trường tự nhiên để nhân giống bằng phương pháp cấy mô so với cây được nhân trong phòng tăng trưởng được ước tính rẻ hơn khoảng 22% giá thành sản xuất.. - Từ khóa: cỏ vetiver, vi nhân giống giá thành thấp. - Cỏ vetiver nhân giống vô tính bằng giâm chồi thì rất đơn giản và dễ thực hiện nhưng hệ số nhân giống không cao, cần phải có một lượng giống lớn dùng làm vật liệu ban đầu và diện tích phải lớn để thực hiện. - Ngược lại, nhân giống vô tính bằng phương pháp cấy mô có nhiều ưu điểm hơn như hệ số nhân giống cao, cây con có độ đồng đều cao, diện tích nhân giống nhỏ. - Tuy nhiên, giá thành sản xuất chồi cấy mô rất đắt bởi vì được thực hiện trong phòng tăng trưởng có nhiệt độ và ánh sáng ổn định.. - Để làm giảm giá thành sản xuất cây cấy mô, các nhà khoa học phát triển qui trình nuôi cấy cải tiến như: tự động hóa khâu cấy chuyền để giảm công lao động (Hartney, 1986), sử dụng nguồn sáng tự nhiên thay cho ánh sáng đèn (George, 1993, Escalona et al., 1998. - Gutterson, 2003), sử dụng môi trường. - Kodym et al., 2001), hoặc sử dụng môi trường tự nhiên của nhà lưới để nuôi cấy (Be &. - Trong qui trình vi nhân giống thì giai đoạn nhân chồi cần nhiều thời gian nhất.. - Tương tự như vậy, khâu ra rễ cũng cần nhiều thời gian để cây vươn dài và hoàn chỉnh hệ thống rễ trước khi đem cây cấy mô ra ngoài. - Do vậy, một lượng lớn điện năng được tiêu thụ vào mục đích thắp sáng và điều hoà nhiệt độ phòng tăng trưởng luôn luôn ổn định ở nhiệt độ 24±1 o C, 12 giờ chiếu sáng trong ngày bằng bóng đèn.. - Nếu hai giai đoạn này được thực hiện ngoài nhà lưới với nhiệt độ và ánh sáng của môi trường tự nhiên thì chúng ta sẽ tiết kiệm một lượng năng lượng lớn, tất nhiên cây con tạo ra sẽ có giá thành thấp.. - Do đó, mục đích của thí nghiệm này là sản xuất cây con cấy mô với giá thành thấp bằng cách đặt cây cấy mô trong ống nghiệm vào giai đoạn nhân chồi và ra rễ (giai đoạn II và III) ở nhà lưới có ánh sáng và nhiệt độ tự nhiên thay vì trong phòng tăng trưởng.. - 2 PHƯƠNG PHÁP VÀ PHƯƠNG TIỆN 2.1 Giai đoạn tạo chồi (giai đoạn I). - Các đoạn của cọng phát hoa dài 20 cm mang một mắt được đặt vào ống nghiệm chứa môi trường lỏng Murashige &. - Các ống nghiệm này được đặt trong phòng tăng trưởng có nhiệt độ ổn định 24±1 o C, 12 giờ chiếu sáng trong ngày, cường độ sáng khoảng 30 µmol.m -2 .s -1. - 2.2 Giai đoạn nhân chồi (giai đoạn II). - Vật liệu để nhân chồi là những chồi con được chọn từ giai đoạn I có chiều cao khoảng 4 cm, 5-6 lá. - Các chồi con này được cấy vào trong những keo thủy tinh chứa môi trường MS lỏng có bổ sung benzyl adenine (BA) với nhiều hàm lượng khác nhau và 10 mg BA.l -1 . - Keo thủy tinh có kích thước 6 cm đường kính, 12 cm chiều cao, đậy bằng nắp nhựa và bọc lại bằng nhựa trong trước khi đem ra ngoài đặt trong điều kiện môi trường tự nhiên của nhà lưới có nhiệt độ 30±1 o C lúc 11 giờ trưa và 15 giờ chiều, cường độ ánh sáng khoảng 95-125 µmol.m -2 .s -1 và so với điều kiện phòng tăng trưởng (đã đề cập bên trên). - Thể tích 20 ml môi trường lỏng/keo, cây con không ngập hoàn toàn trong môi trường cấy nên không cần phải lắc.. - Số liệu được phân tích theo hai chiều về số chồi, trọng lượng cụm chồi, chiều cao chồi, hàm lượng diệp lục tố a, b sau 6 tuần nuôi cấy là biến phụ thuộc. - Biến độc lập là hai điều kiện nuôi cấy khác nhau trong phòng tăng trưởng, ngoài phòng tăng trưởng và 10 hàm lượng BA khác nhau. - Hàm lượng diệp lục tố trong lá của chồi con được phân tích theo phương pháp của Wellburn (1994).. - 2.3 Giai đoạn ra rễ trong ống nghiệm (giai đoạn III). - Cụm chồi thu được từ giai đoạn II có khoảng 7-9 chồi/cụm được tách ra làm thành những cụm chồi nhỏ hơn, mỗi cụm có khoảng 4-5 chồi/cụm, chiều cao chồi khoảng lớn hơn 4 cm được sử dụng để ra rễ. - Môi trường MS lỏng có bổ sung đường sucrose (3% và 4. - Điều kiện yếu tố ngoại cảnh nuôi cấy, hàm lượng NAA và lượng đường sử dụng là biến độc lập.. - 2.4 Giai đoạn thuần dưỡng (giai đoạn IV). - Các cụm chồi sau khi ra rễ trong ống nghiệm được đem ra vườn ươm để thuần dưỡng. - Các cụm chồi được cấy vào bồn giâm chứa đất trộn chất hữu cơ, ánh sáng vườn ươm 130 - 140 µmol.m -2 .s -1 , ẩm độ không khí 70-80%. - Ghi nhận tỷ lệ sống của cụm chồi sau 8 tuần thuần dưỡng trong vườn ươm. - Thí nghiệm này được bố trí theo khối hoàn toàn ngẫu nhiên, 5 lần lặp lại, 100 cụm chồi/lần lặp lại.. - Các đoạn của phát hoa có một mắt mang mầm ngủ được cấy vào môi trường MS lỏng không có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng. - Các chồi con xuất hiện tại những mắt vào 14 ngày sau khi cấy vào (Hình 1 và 2). - Tỷ lệ nhiễm khi đưa mẫu cấy vào ống nghiệm phụ thuộc nhiều vào kích thước mẫu sử dụng. - trường nuôi cấy khoảng 2-4 mg.l -1 là tối hảo cho việc nhân chồi cỏ vetiver vì từ một chồi ban đầu sau 6 tuần nuôi cấy thu được trung bình 8 chồi mới có chiều cao 4-5 cm (Hình 3a). - Nếu nồng độ BA cao hơn nữa trong môi trường nuôi cấy sẽ kích thích hình thành vô số những chồi li ti (có chiều cao 0,8-2 cm) không thể sử dụng cho việc cấy chuyền hoặc ra rễ (Hình 3b). - Tương tự, trọng lượng cụm chồi cũng phụ thuộc nhiều vào nồng độ BA được sử dụng trong môi trường.. - (b) Chồi vô hiệu cỏ vetiver sau 6 tuần sau nuôi cấy với môi trường MS có bổ sung lần lượt 2 và 10 mgBA.l-1. - Bảng 1: So sánh ảnh hưởng của nồng độ BA (1) (NĐ) và môi trường ngoại cảnh (2) (NC) đến vi nhân giống của cỏ vetiver sau 6 tuần quan sát. - TL cụm chồi (g). - Chiều cao chồi (cm). - 4 8,2 a 1,1 a 4,6 b 114,2 d 109,4 de 5 4,0 c 0,7 cd 2,3 cd 143,7 bcd 134,0 bcd 6 4,4 c 1,1 a 2,9 c 132,0 cd 112,9 de 7 1,1 d 0,8 bcd 1,7 de 149,5 bcd 119,9 cde 8 0,8 d 0,6 de 1,3 e 146,6 bcd 110,7 de 9 1,6 d 0,3 ef 1,3 e 221,6 a 163,2 ab 10 0,2 d 0,3 ef 0,8 e 167, 3 abcd 90,2 e Môi trường ngoại cảnh. - Phòng tăng trưởng . - Nhà lưới . - (2) Hai môi trường ngoại cảnh nuôi cấy: phòng tăng trưởng (24±1 o C, 12 giờ chiếu sáng, cường độ sáng 30 µmol.m -2 .s -1. - So sánh hai điều kiện môi trường ngoại cảnh nuôi cấy đã không ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của các chồi con như số chồi được hình thành, trọng lượng cụm chồi. - Hàm lượng diệp lục tố a trong lá của các chồi con sinh trưởng. - trong phòng tăng trưởng là 142 µg.g -1 so với 168 µg.g -1 của những chồi đặt ngoài phòng tăng trưởng. - Một cách tổng quát, có thể sử dụng môi trường ngoại cảnh tự nhiên (30±1 o C, cường độ ánh sáng khoảng 95-125 µmol.m -2 .s -1 ) để nuôi cấy cỏ vetiver thay cho điều kiện phòng tăng trưởng (24±1 o C, 12 giờ chiếu sáng trong ngày, cường độ sáng khoảng 30 µmol.m -2 .s -1 ) (Bảng 1).. - 3.3 Ra rễ trong ống nghiệm (giai đoạn III). - Bảng 2: Ảnh hưởng của NAA, môi trường ngoại cảnh nuôi cấy (NC), hàm lượng đường (LĐ) đến sự ra rễ của cụm chồi cỏ vetiver trong ống nghiệm (4-5 chồi/cụm), quan sát 10 ngày sau khi cấy trong môi trường ra rễ. - Nghiệm thức Số rễ/cụm chồi TL cụm chồi (g). - 0 mg NAA + 30 g đường/lít 7,5 a 0,34 7,3 b. - 0 mg NAA + 40 g đường/lít 7,6 a 0,35 6,7 a. - 1 mg NAA + 40 g đường/lít 18,5 b 0,34 6,4 a. - Môi trường ngoại cảnh nuôi cấy (NC). - Hàm lượng đường sử dụng (LĐ). - Chúng tôi chỉ sử dụng những chồi có chiều cao gần 4 cm của những môi trường có chứa 2-4 mg BA.l -1 . - Sau khi đặt vào môi trường ra rễ, các chồi tiếp tục gia tăng chiều cao và đạt gần 7 cm lúc 10 ngày sau khi cấy (Bảng 2). - Trong hai môi trường ngoại cảnh nuôi cấy, sự ra rễ của các chồi con như nhau. - Bổ sung 1 mg NAA.l -1 vào trong môi trường ra rễ có ảnh hưởng rất lớn đến sự hình thành số rễ/chồi, trung bình 19 rễ/chồi so với nghiệm thức không bổ sung NAA vào môi trường cấy là 7,6 rễ/chồi. - Những chồi con có đầy đủ rễ 10 ngày sau khi đem ra vườn ươm (Hình 4a, b).. - Hình 4: (a) Cụm chồi cỏ vetiver ra rễ trong những hộp nhựa chứa môi trường ra rễ MS. - (b) Cụm chồi ra rễ 10 ngày sau khi cấy. - 3.4 Giai đoạn ra vườn ươm (giai đoạn IV). - Tỷ lệ sống sót của những chồi con sau khi đem ra vườn ươm là chỉ tiêu quan trọng nhất vì nó quyết định sự thành công của việc nuôi cấy mô. - Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến tỷ lệ sống sót của chồi con sau khi đem ra vườn ươm là chất lượng của chồi con và môi trường ngoại cảnh của vườn ươm. - Kết quả cho thấy tỷ lệ sống sót của cụm chồi rất cao (hơn 95%) và các cụm chồi này phát triển rất tốt 10 tuần sau khi đem ra vườn ươm (Bảng 3 và Hình 5a, b, c). - Từ những kết quả này, chúng tôi có thể kết luận rằng các chồi cỏ vetiver nhân bằng phương pháp vi nhân giống thích nghi rất tốt với điều kiện ngoại cảnh của vườn ươm.. - Phương pháp vi nhân giống cỏ vetiver có nhiều ưu điểm hơn phương pháp nhân giống truyền thống trong túi nylon ngoài đồng vì phương pháp này cho ra những chồi con nhỏ, dễ vận chuyển từ nơi này sang nơi khác (Namwongprom &. - Tuy vậy, cây con cấy mô ít được sử dụng ngoài thực tế vì giá thành cao. - Sử dụng môi trường tự nhiên của nhà lưới thay cho phòng tăng trưởng có nhiệt độ ổn định và ánh sáng nhân tạo để nhân giống là phương pháp làm giảm giá thành cây con cấy mô.. - Bảng 3: Tỷ lệ sống sót của cụm chồi cỏ vetiver (4-5 chồi/cụm) 10 tuần sau khi đem ra vườn ươm Phương pháp ra rễ trong ống nghiệm Tỷ lệ sống sót của cụm chồi. - Ra rễ trong phòng tăng trưởng. - 0 mg NAA + 40 g đường/lít 98,3. - 0 mg NAA + 30 g đường/lít 97,3. - 1 mg NAA + 30 g đường/lít 97,5. - 1 mg NAA + 40 g đường/lít 98,4. - Ra rễ trong điều kiện ngoại cảnh của nhà lưới. - 0 mg NAA + 40 g đường/lít 99,7. - 0 mg NAA + 30 g đường/lít 96,3. - 1 mg NAA + 40 g đường/lít 99,6. - 1 mg NAA + 30 g đường/lít 98,8. - So với phương pháp khác như sử dụng bình có kích thước lớn, dung dịch tự động bơm vào không phải tốn công lao động cấy chuyền sang môi trường mới đã làm giảm 35% giá thành cây cấy mô (Firoozabady &. - Thí nghiệm sử dụng ánh sáng tự nhiên thay cho ánh sáng đèn trong nuôi cấy mô cây chuối đã tiết kiệm chi phí tiền điện là 6USD/m 2 /tuần so với nuôi cấy trong phòng tăng trưởng có nhiệt độ và ánh sáng đạt tiêu chuẩn (Kodym et al., 2001) và trong nuôi cấy mô cây khóm đã làm giảm 20% chi phí sản xuất (Be &. - Trong thí nghiệm này, sử dụng điều kiện ngoại cảnh tự nhiên để vi nhân giống cây cỏ vetiver là hoàn toàn khả thi. - Thực tế trong những năm qua chúng tôi đã sử dụng qui trình này để sản xuất hàng triệu chồi cỏ vetiver hàng năm phục vụ sản xuất tại đồng bằng sông Cửu Long.. - Sử dụng môi trường MS lỏng có bổ sung BA (2-4 mg.l -1 ) từ một chồi ban đầu có thể thu được trung bình 8 chồi con mới trong vòng 6 tuần nuôi cấy. - Chồi con mới đạt tiêu chuẩn mập khỏe, cao hơn 4 cm. - Nồng độ BA cao hoặc thấp hơn trong khoảng này thì chất lượng chồi con giảm xuống. - Giai đoạn nhân chồi và ra rễ (giai đọan II và III) có thể nuôi cấy trong môi trường ngoại cảnh tự nhiên của nhà lưới thay cho phòng tăng trưởng đã làm giảm khoảng 22% chi phí sản xuất trên mỗi. - Hính 5: (a) Cụm chồi trong vườn ươm. - (b) Cụm chồi phát triển tốt sau 10 tuần trong vườn ươm. - (c) Cụm chồi trưởng thành có thể đem trồng ngoài đồng