- Các loài metacercariae được phát hiện trên các loài cá tra (Pangasianodon hypophthamus), cá rô đồng (Anabas testudineus) và cá đối (Mugil cephalus) dựa vào đặc điểm hình thái và di truyền (sử dụng đoạn gen 28S của hệ gen ribosom). - Nghiên cứu thu được 474 metacercariae trên 3 loài cá, trong đó trên cá tra thu được 159 metacercariae bao gồm 3 loài (Clonorchis sinensis, Centrocestus formosanus, Haplorchis taichui), trên cá rô đồng thu được 181 metacercariae bao gồm 3 loài chưa xác định thuộc 3 giống (Centrocestus, Haplorchis, Metagonimoides) và trên cá đối thu được 134 metacercariae bao gồm 3 loài chưa định danh thuộc 3 giống (Procerovum, Stellantchasmus, Clonorchis). - trên cá đối. - Các loài thuộc 2 họ Heterophyidae và Opisthorchiidae được sắp xếp chung 1 nhánh. - Sự khác biệt di truyền của các loài dao động từ 2% đến 9%. - Cần tiến hành định danh các loài nghiên cứu dựa trên đặc điểm hình thái và di truyền.. - Hiện nay, việc nghiên cứu sán lá song chủ có nguồn gốc từ động vật thủy sản có khả năng lây nhiễm cho người được tiến hành ở nhiều tỉnh thành trên cả nước như: Hà Nội, Hải Dương, Nam Định, Nghệ An, Phú Yên, Khánh Hòa, Cần Thơ, An Giang (Nguyen Diem Thu et al., 2007, Vo The Dung et al., 2008, Nguyễn Văn Đề và ctv., 2003, Trần Văn Quyên và ctv., 2012). - Rất nhiều loài cá nước ngọt được ghi nhận là vật chủ trung gian của các loài ký sinh trùng ở giai đoạn metacercaria như cá tra (Pham Cu Thien et al., 2009, Dinh Thi Thuy et al., 2010). - Các chỉ thị phân tử của gen ribosom thuộc hệ gen nhân (18S, 28S, ITS1 và ITS2) được ứng dụng rộng rãi trong định danh loài và nghiên cứu di truyền phả hệ (Kim Văn Vạn và ctv., 2007, Katokhin et al. - 2008, Skow et al . - Nghiên cứu này nhằm xác định tình hình nhiễm và thành phần loài metacercariae trên cá tra, cá đối và cá rô đồng dựa vào đặc điểm hình thái và di truyền, đồng thời khảo sát mối quan hệ phát sinh loài của các loài metacercariae thu được trên cá.. - 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Phương pháp thu mẫu. - các loài cá đối, cá rô đồng thu tại chợ Vĩnh Hải, tỉnh Khánh Hòa. - Kích thước và trọng lượng trung bình của các loài cá được trình bày trong Bảng 1.. - Bảng 1: Số lượng và kích thước trung bình các loài cá nghiên cứu. - Sohn et al. - Pinto et al. - Đo các thông số hình thái gồm kích thước bào nang, thành bào nang (nếu dày), giác miệng, giác bụng, tinh hoàn, kích thước gai miệng, số lượng móc sinh dục.. - 2.5 Phân tích mối quan hệ phát sinh loài Trình tự gen 28S rDNA của các loài metacercariae thu được từ 3 loài cá nghiên cứu được xử lý và kết nối bằng phần mềm Geneious, sau đó kiểm chứng bằng chương trình BLAST (ncbi.nlm.nih.gov/Blast). - Các trình tự được dóng hàng (alignment) bằng phần mềm Bioedit (Hall, 1999), sau đó được kiểm tra, chỉnh sửa bằng mắt thường và xác định mức độ tương đồng của các loài. - Cây phát sinh loài được xây dựng dựa trên 9 trình tự của các loài metacercariae thu được và 6 trình tự từ Genbank sử dụng phần mềm MEGA 6.06 (Kumar et al., 2009) và PAUP v4.0 (Swofford, 2001) bằng thuật toán Maximum parsimony (MP) và Maximum likelihood (ML) với giá trị bootstrap (độ tin cậy) (BT) 1000 lần lặp lại.. - Echinochasmus japonicus được sử dụng làm nhóm ngoại vì trình tự của loài này thể hiện sự khác biệt cần thiết với các trình tự trong nghiên cứu hiện tại.. - 3.1 Thành phần loài metacercaria trên cá dựa vào đặc điểm hình thái và di truyền. - Nghiên cứu tiến hành thu 283 cá thể cá tra trong các đợt thu mẫu ở An Giang, Đồng Tháp, Vĩnh Long và Cần Thơ, 15 cá thể cá rô đồng, 6 cá thể cá đối được thu ở khu vực chợ Vĩnh Hải, Nha. - Dựa vào đặc điểm và các thông số hình thái và đặc điểm di truyền (trình tự gen 28S rDNA), 474 cá thể metacercariae thuộc 9 loài được phát hiện trên 3 loài cá nghiên cứu. - Hình thái ngoài, đặc điểm hình thái các loài metacercariae phát hiện được trình bày ở Bảng 2.. - So sánh kết quả trên ngân hàng quốc tế Genbank cho thấy các loài đều có trình tự tương đồng với các loài trên Genbank (Centrocestus formosanus, Clonorchis sinensis và Haplorchis taichui) với tỉ lệ tương đồng là 100%.. - Tuy nhiên, 6 loài còn lại cho thấy sự khác biệt với các loài cùng giống (tỉ lệ tương đồng dao động từ 86-90%) và không có trình tự tương đồng trên GenBank, vì vậy được ghi nhận là loài chưa xác định (Clonorchis sp. - Haplorchis sp., Metagonimoides sp,. - Centrocestus sp., Stellantchasmus sp. - Hình 1: Kết quả điện di sản phẩm PCR đoạn gen 28S rDNA của các loài metacercaria. - 3.2 Tỉ lệ cảm nhiễm các loài metacercaria trên cá. - Tỉ lệ cảm nhiễm của 9 loài metacercaria thu được trên cá tra, cá rô đồng và cá đối được thể hiện ở Bảng 2.. - Tỉ lệ cảm nhiễm của các loài metacercariae dao động giữa các loài cá, ở cá tra thu được 3 loài với tỉ lệ cảm nhiễm từ 2,13% (Centrocestus formosanus) đến 43,47% (Haplorchis taichui). - Trên cá rô đồng thu được 3 loài với tỉ lệ cảm nhiễm dao động từ 6,67% (Centrocestus sp.) đến 40% (Haplorchis sp. - và trên cá đối thu được 3 loài với tỉ lệ nhiễm dao động từ 33,33% (Clonorchis sp.) đến 83,33%. - trên cá đối.. - Bảng 2: Tỉ lệ cảm nhiễm và đặc điểm hình thái các loài metacercariae phát hiện trên các loài cá nghiên cứu. - Cá tra (Pangasianodon hypophthalmus). - Bào nang hình elip kích thước 259,5. - 0,5 x μm, thành bào nang 1 lớp mỏng, giác miệng lớn thấy rõ có kích thước 35 x 46,5 ± 0,5μm, giác bụng gần bằng giác miệng. - nằm ở giữa 2 ruột kéo dài xuống tuyến bài tiết, kích thước giác bụng x 44, hầu thấy rõ nằm dưới giác miệng, bào nang nhìn rõ dưới kính hiển vi, có sắc tố màu vàng nâu nằm rải rác khắp cơ thể, túi bài tiết hình chữ O ở phía cuối cơ thể.. - Bào nang hình ôvan, kích thước 260 x 121 μm, thành bào nang 2 lớp mỏng. - Giác miệng kích thước 34 x 46 μm. - dưới miệng là hầu có kích thước nhỏ, giác bụng có kích thước 24 x 43 μm. - Bào nang hình trứng, kích thước 220 x μm, thành bào nang 1 lớp mỏng, giác miệng có kích thước x 41 μm, giác bám giao phối. - hình găng tay có khoảng 16 gai hình que bao xung quanh gần tuyến bài tiết, kích thước mỗi gai 3 μm, giác bám bụng nằm lõm sâu vào trong 2 nhánh ruột không nhìn thấy rõ, có sắc tố màu vàng nâu nằm rải rác khắp cơ thể, túi bài tiết hình chữ O và chiếm phần lớn phía sau cơ thể.. - Bào nang hình ôvan, kích thước x μm, thành bào nang 2 lớp mỏng. - Giác miệng kích thước 32 x 44 ± 0,5 μm. - giác bụng có kích thước 20 x 39. - Bào nang hình trứng, kích thước 210 x μm, thành bào nang 1 lớp mỏng, giác miệng có kích thước x 41 μm, giác bám giao phối. - Bào nang gần tròn kích thước 154 ± 1 x 153 μm, thành bào nang 1 lớp mỏng, giác miệng nhỏ kích thước x 42 μm, giác bụng gần tròn thường lõm vào trong ở gần cuối cơ thể nên khó nhìn thấy rõ kích thước 32 x sắc tố màu vàng nâu nằm rải rác toàn bộ cơ thể, túi bài tiết hình chữ V và chiếm phần lớn phía sau cơ thể.. - Bào nang hình elip, kích thước 225 ± 5 x μm, thành bào nang 1 lớp mỏng, giác miệng có kích thước 41 x μm lớn hơn giác bụng nằm ở vị trí lệch sang bên phải của đường giữa hai ruột tịt. - kích thước x 32 ± 1, lỗ sinh dục nằm ở mép phải giác bụng gần túi bài tiết. - Bào nang hình elip kích thước 171,5. - 3,5 x μm, thành bào nang 1 lớp mỏng, giác miệng lớn thấy rõ có kích thước 38 x 46,5 ± 0,5μm, giác bụng gần bằng giác miệng. - có kích thước x 48, bào nang nhìn rõ dưới kính hiển vi, có sắc tố màu vàng nâu nằm rải rác khắp cơ thể, túi bài tiết nhỏ hình chữ D ở phía cuối cơ thể.. - taichui, Centrocestus formosanus và Procerovum sp.) trên cá tra với tỉ lệ nhiễm dao động từ tùy theo mô hình nuôi. - Pham Cu Thien et al. - Nghiên cứu hiện tại phát hiện 3 loài metacercariae trên cá tra và ghi nhận sự xuất hiện của metacercaria theo kích thước và khu vực địa lý. - Tỉ lệ cảm nhiễm cao nhất đối với loài Haplorchis taichui (43,47%) tập trung chủ yếu ở cá thu tại Cần Thơ là khá cao so với các nghiên cứu trước đây.. - Vo The Dung et al. - Kim et al.. - Các nghiên cứu trên khác với nghiên cứu hiện tại trên cá đối tìm thấy được 3 loài metacercariae (Procerovum sp., Stellantchasmus sp. - và Clonorchis sp.) dựa vào đặc điểm hình thái và di truyền. - Chai et al. - Nghiên cứu này phù hợp với nghiên cứu hiện tại ở metacercaria thuộc 2 giống Procerovum và Stellantchasmus), tuy nhiên tỉ lệ cảm nhiễm của 2 giống trên trong nghiên cứu hiện tại cao hơn (lần lượt là 88,33 và 66,67%). - Rim et al. - trên cá rô đồng. - Luangphai et al. - (2003) phát hiện được 3 loài metacercariae (Stellantchasmus falcatus, Acanthostomum sp, Centrocestus caninus) trên cá rô đồng ở Thái Lan. - Pham Cu Thien et al.. - Các nghiên cứu trên giống với nghiên cứu hiện tại cũng phát hiện được 3 loài metacercariae trong đó có 2 loài cùng giống với nghiên cứu trên là Centrocestus sp và Stellantchasmus sp. - Tỉ lệ cảm nhiễm dao động từ 6,67-40% cũng phù hợp với nghiên cứu của Pham Cu Thien et al. - Hình 2: Cây phát sinh loài dựa vào trình tự gen 28S rDNA của các loài metacercaria với giá trị BT của thuật toán MP và ML được thể hiện trên các nhánh. - Cây phát sinh loài dựa trên trình tự gen 28S rDNA (Hình 2) cho thấy sự hiện diện của 2 nhóm chính: Nhóm 1 gồm các loài thuộc giống Haplorchis, Procerovum, Clonorchis, Centrocestus và Metagoninoides. - Nhóm 1 được chia thành các nhóm nhỏ: Nhóm 1.1 gồm các loài thuộc giống Haplorchis và Procerovum. - Kết quả cho thấy các loài thuộc họ Opisthorchiidae (Clonorchis spp.) và Heterophyidae (các loài còn lại trừ giống Stellantchasmus) nằm cùng 1 nhánh đồng dạng (monophyly).. - thuộc họ Opisthorchiidae nhưng sắp xếp cùng nhánh với các loài thuộc họ Heterophyidae cho thấy sự không phù hợp giữa phân loại dựa trên hình thái và di truyền. - Các loài Haplorchis sp. - và Haplorchis taichui thể hiện sự gần gũi với các loài thuộc giống Procerovum hơn là với các loài Haplorchis khác (H. - Điều này chứng tỏ các loài này có quan hệ gần gũi với nhau. - Nghiên cứu này phù hợp với nghiên cứu của Thaenkham et al. - Hai loài này tách ra một nhánh riêng biệt so với các loài khác dù thuộc cùng họ Heterophyidae. - Giống như loài Stellantchasmus sp., các loài Clonorchis sp., Metagonimoides sp. - Skov et al. - (2009) nghiên cứu ký sinh trùng gây hại cho người trên cá nước ngọt tại Việt Nam.. - Nhóm nghiên cứu ghi nhận sự hiện diện của metacercariae thuộc giống Haplorchis (H. - Trình tự tương đồng của gen ITS2 rDNA được xác nhận giữa cercaria Type A từ ốc Melanoides tuberculata với metacercariae từ cá và cá thể trưởng thành của Haplorchis pumilio từ miền Bắc, Việt Nam, tuy nhiên có sự khác biệt giữa trình tự gen ITS2 rDNA của các loài trong nghiên cứu này với các trình tự. - từ nghiên cứu ở Isaren (Dzikowski et al. - taichui (cá thể trưởng thành từ người và metacercariae từ cá) với các loài sán lá tương tự ở Thái Lan (Ando et al., 2001). - Nhóm tác giả cũng ghi nhận mức độ tương đồng thấp với nghiên cứu từ Isarel (Dzikowski et al., 2004). - (2010) sử dụng gen ITS2 rDNA để kiểm chứng phân loại các loài metacercaria trên cá tra.. - Nghiên cứu hiện tại cho thấy dựa vào đặc điểm hình thái rất khó phân biệt các loài metacarcariae thuộc cùng một giống. - Kết quả cho thấy sự tương đồng về trình tự gen 28S rDNA của các loài metacercariae tìm thấy trên cá tra với các loài tương tự trên Genbank (Thaenkham et al., 2010), tuy nhiên trên cá đối và cá rô đồng, các loài đều cho thấy sự khác biệt trình tự với các loài cùng giống. - Các chỉ thị phân tử cần được áp dụng trong việc phát hiện và nghiên cứu dịch tễ ký sinh trùng gây hại cho người, đồng thời nghiên cứu cũng cần tập trung xác định các đặc điểm phân loại đặc trưng cho các loài nghiên cứu.. - “Đánh giá mức độ nhiễm ký sinh trùng bằng các phương pháp kết hợp trong các sản phẩm cá nhập vào EU” đã cung cấp kinh phí và hỗ trợ thực hiện nghiên cứu này.. - Viện Nghiên cứu và Nuôi trồng thủy sản I, P.. - pumilio với các loài sán lá khác sử dụng chỉ thị ITS- 2 (Internal transcribed spacer). - Nghiên cứu mức độ nhiễm ấu trùng sán lá song chủ trên cá chép và cá trắm cỏ giai đoạn cá giống ương nuôi tại Thừa Thiên Huế