- CỦA CÁ TRA (PANGASIANODON HYPOPHTHALMUS). - CẢM NHIỄM VI KHUẨN EDWARDSIELLA ICTALURI NHƯỢC ĐỘC. - Cá tra (Pangasianodon hypophthalmus), đáp ứng miễn dịch, Edwardsiella ictaluri, vaccine nhược độc Keywords:. - The challenge test by injecting virulent E.ictaluri (1.5×10 5 CFU/fish) were done at 2 weeks post exposure. - The results showed that specific antibody against E.ictaluri of all experimented fishes were detected at 2 nd week after soaking. - These results demonstrated that using attenuated E.ictaluri at concentration of 1×10 8 CFU/mL can stimulate striped catfish generate specific antibody against E.ictaluri infection in experimental condition.. - Nghiên cứu được thực hiện nhằm xác định khả năng sinh kháng thể đặc hiệu của cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) cảm nhiễm vi khuẩn Edwardsiella ictaluri nhược độc. - kháng thể đặc hiệu của cá tra sau mỗi tuần ngâm cá với vi khuẩn E.ictaluri nhược độc ở các nồng độ CFU/mL và đối chứng. - Sau 2 tuần, cá tra được cảm nhiễm với chủng E.ictaluri có độc lực với nồng độ 1,5×10 5 CFU/mL. - Kết quả cho thấy mức kháng thể của cá ở tất cả các nghiệm thức tăng dần từ tuần thứ 2, tăng nhanh đến tuần thứ 3 sau khi ngâm vi khuẩn nhược độc và cao nhất đến cuối giai đoạn khảo sát. - Trong đó, cá ở nghiệm thức ngâm vi khuẩn nhược độc 1×10 8 CFU/mL có hiệu giá kháng thể trung bình tăng cao nhất (gần 9,0), khác biệt có ý nghĩa so với nhóm đối chứng (chỉ 2,0) (p<0,05).. - Ngoài ra, cá tra ở nghiệm thức ngâm vi khuẩn nhược độc 1×10 8 CFU/mL có tỉ lệ chết thấp nhất (25%) trong khi đó ở nhóm đối chứng tỉ lệ cá chết là 70% (p<0,05). - Qua những kết quả trên cho thấy cá tra trong điều kiện thí nghiệm khi ngâm E.ictaluri nhược độc nồng độ 1×10 8 CFU/mL có khả năng tạo kháng thể đặc hiệu chống lại vi khuẩn E.ictaluri.. - Cá tra (Pangasianodon hypopthalmus) là loài cá nuôi và chế biến xuất khẩu đạt thế mạnh kinh tế thứ hai của nền kinh tế thủy sản Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) nên diện tích nuôi không ngừng được mở rộng và mật độ nuôi cũng được tăng cao. - Tuy nhiên, những năm gần đây do việc sử dụng hóa chất và kháng sinh không đúng qui định, không kiểm soát làm tác động đến môi trường, hệ sinh thái của khu vực hoặc để lại dư lượng trong sản phẩm thủy sản và dẫn đến hiện tượng kháng kháng sinh trong các loài vi khuẩn gây bệnh trên cá (Aoki, 1988. - Theo Nguyễn Trọng Bình (2008) bệnh mủ gan xuất hiện cao nhất ảnh hưởng nghiêm trọng đến cá tra. - Tác nhân gây bệnh mủ gan được đa số các nghiên cứu khoa học công bố là do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri (Crumlish và ctv., 2002;. - Vaccine từ vi khuẩn E.ictaluri nhược độc có nhiều ưu điểm là kích thích sinh kháng thể miễn dịch đặc hiệu nhanh và kéo dài, dễ sản xuất, chi phí thấp. - Do đó, đề tài được thực hiện trong điều kiện phòng thí nghiệm nhằm cung cấp thêm thông tin về miễn dịch cũng như vaccine trên cá làm cơ sở cho việc sản xuất vaccine nhược độc phòng bệnh ở cá tra sau này.. - Cá thí nghiệm: Cá tra giống (Pangasianodon hypophthalmus) có kích cỡ khoảng 20-25 g/con, cá khỏe. - Vi khuẩn E.ictaluri: Chủng vi khuẩn E.ictaluri được phân lập và định danh từ mẫu cá bệnh thu tại ao. - Chủng vi khuẩn E.ictaluri nhược độc DeltaE3 được tạo bằng phương pháp biến đổi gen do phòng thí nghiệm Bệnh Thủy sản, Khoa Thú y, Đại học Quốc gia Gyeongsang, Hàn Quốc cung cấp. - Vi khuẩn gây cảm nhiễm được phục hồi trên môi trường tryptic soy agar (TSA. - Merck) từ 24-30 giờ, ly tâm 4000 vòng/phút trong 3 phút, rửa 2 lần bằng dung dịch 0,85% NaCl và xác định mật độ vi khuẩn bằng máy so màu quang phổ ở bước sóng 590 nm kết hợp với phương pháp đếm số khuẩn lạc phát triển trên môi trường TSA (CFU/mL).. - Thí nghiệm ngâm vaccine vi khuẩn E.ictaluri nhược độc: bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 5 nghiệm thức (NT) ngâm vi khuẩn (VK) E.ictaluri nhược độc DeltaE3 ở nồng độ CFU/mL, đối chứng ngâm nước muối sinh lý (0,85% NaCl) (ĐC NaCl 0,85%) và đối chứng âm không ngâm vi khuẩn hay nước muối sinh lý (ĐC. - Bảng 1: Bố trí thí nghiệm ngâm vi khuẩn E.ictaluri nhược độc Nghiệm. - Chất ngâm E.ictaluri nhược độc. - E.ictaluri nhược độc. - nhược độc NaCl 0.85% không Cảm nhiễm E.ictaluri E.ictaluri E.ictaluri E.ictaluri E.ictaluri E.ictaluri không Liều tiêm. - cảm nhiễm. - vaccine: Sau 2 tuần ngâm với vi khuẩn nhược độc, cá tra được tiêm cảm nhiễm với chủng vi khuẩn E.. - kỳ mỗi tuần sau ngâm vi khuẩn nhược độc và thu trong 4 tuần. - Mỗi lần thu 3 con/nghiệm thức lặp lại 2 lần. - ictaluri có độc lực được ghi nhận và thu lấy thận trữ trong ethanol (Merck) để kiểm tra sự hiện diện của vi khuẩn bằng phương pháp PCR.. - B) Cá tra được ngâm vi khuẩn E.ictaluri nhược độc. - (C) Cá tra được gây nhiễm bằng phương pháp tiêm. - 2.3 Phản ứng ngưng kết kháng nguyên- kháng thể. - Lấy phần huyết thanh phía trên cho vào ống eppendorf khác và đem xác định hàm lượng kháng thể hoặc trữ lạnh (Hình 2).. - Phương pháp bất hoạt vi khuẩn bằng formaline: Chủng vi khuẩn E.ictaluri có độc lực HL3 sau khi nuôi tăng sinh được bất hoạt bằng formalin (37. - Xác vi khuẩn được rửa sạch formaline bằng nước muối sinh lý và bảo quản trong ngăn mát tủ lạnh hoặc ở -20 0 C.. - Phản ứng ngưng kết kháng nguyên-kháng thể: Phản ứng được thực hiện trên các đĩa nhựa (microplate) 96 giếng theo phương pháp vi ngưng kết kháng nguyên-kháng thể của Roberson (1990).. - Cuối cùng cho 25 µL huyền dịch xác vi khuẩn vào giếng rồi trộn đều. - Sau 4-5 giờ, khảo sát hiệu giá kháng thể trung bình ở các nghiệm thức từ 10 4 đến 10 8 để xác định khả năng đáp ứng kháng thể của cá tra. - 2.4 Kiểm tra sự hiện diện của vi khuẩn E.. - DNA từ vi khuẩn được chiết tách theo phương pháp của Bartie và đồng tác giả (2006). - Vi khuẩn được nuôi tăng sinh từ 16-18 giờ trong 5 mL môi trường NB ở nhiệt độ 28ºC, sau đó được sử dụng để ly trích DNA bằng cách cho cho 1,5 mL dung dịch vi khuẩn vào ống ly tâm cùng với 100 µL 10 mM Tris-HCL, 1 mM EDTA, pH 8,0 (TE). - Trọng lượng phân tử đọan DNA của vi khuẩn E.ictaluri cần phát hiện là 407bp.. - 3.1 Kết quả kiểm tra hàm lượng kháng thể đặc hiệu của cá tra. - Mẫu máu của cá trước khi ngâm vi khuẩn E.ictaluri nhược độc đều có hiệu giá kháng thể bằng 0. - (1997) những cá thể khỏe sống trong môi trường sạch bệnh sẽ có hiệu giá kháng thể bằng 0. - Sau khi ngâm vi khuẩn E.ictaluri nhược độc hàm lượng kháng thể xuất hiện và khác nhau ở mỗi nghiệm thức, đặc biệt tăng nhanh kể từ tuần thứ 2 (Bảng 2). - Tuy nhiên, ở nhóm đối chứng vẫn chưa có sự đáp ứng miễn dịch, cho đến tuần thứ 4 sau khi ngâm vi khuẩn E.ictaluri nhược độc, cá ở nhóm đối chứng (NaCl 0,85%) xuất hiện kháng thể trong máu với hiệu giá kháng thể trung bình (HGKT TB ) là 1,67. - Vì nhóm này có tỉ lệ chết cao nhất (71,43%) nên không có mẫu máu để tiếp tục quan sát hàm lượng kháng thể.. - Theo Vinitnantharat và Plumb (1993) cho thấy những cá sống sót sau khi tiếp xúc với mầm bệnh có hàm lượng kháng thể cao và bảo vệ được cơ thể kháng lại vi khuẩn E. - Sự khác biệt về hàm lượng kháng thể giữa nhóm đối chứng và các nghiệm thức cảm nhiễm vi khuẩn được thể hiện rõ từ tuần thứ 3: trong khi nhóm đối chứng vẫn ở mức 0,00 thì HGKT TB ở các nghiệm thức còn lại đều tăng vọt có ý nghĩa (p<0,05), và đạt mức cao nhất là 6,33 ở nghiệm thức 10 8 và không khác biệt nhiều với mức 5,83 của nghiệm thức 10 7 . - Ngược lại, nghiệm thức 10 4 có sự đáp ứng miễn dịch thấp nhất (mức 3,50) trong số các nghiệm thức được cảm nhiễm vi khuẩn.. - Bảng 2: Hiệu giá kháng thể trung bình của cá tra trong giai đoạn khảo sát. - Nghiệm thức/ tuần I II III IV V VI. - Theo nghiên cứu thăm dò đặc tính gây đáp ứng miễn dịch của tác nhân gây bệnh đốm trắng mủ trên cá tra của Nguyễn Thị Mộng Hoàng và ctv.. - (2009) đã chỉ ra rằng việc tiêm nhắc vào ngày thứ 14 kích thích đáp ứng miễn dịch thứ phát nên kháng thể hình thành sớm, cao hơn và duy trì lâu. - hơn so kháng thể nguyên phát. - Bên cạnh đó, những thí nghiệm của Phạm Công Thành (2010) cũng cho thấy trên cá tra khi tiêm nhắc với vi khuẩn E.. - ictaluri bất hoạt thì nhận thấy lượng kháng thể tăng lên đáng kể so với khi tiêm lần đầu. - Bởi vậy, kháng thể đặc hiệu tăng nhanh là do cá sau khi ngâm (tiếp. - xúc với E.ictaluri lần thứ nhất) đã hình thành kháng thể nguyên phát. - sau 2 tuần lại được gây cảm nhiễm (tiếp xúc lần 2) hình thành kháng thể thứ phát.. - Do đó HGKT TB của cá ở các nghiệm thức tiếp tục tăng cao ở các tuần tiếp theo và đạt mức cao nhất vào cuối giai đoạn khảo sát (tuần thứ 6).. - Nghiệm thức 10 8 là nghiệm thức có đáp ứng miễn dịch cao nhất, HGKT TB là 8,67 và vẫn không khác biệt nhiều so với nghiệm thức 10 7 (mức 8,00) nhưng khác biệt có ý nghĩa so với nghiệm thức 10 6 (mức 7,00). - Đối với nghiệm thức và đối chứng (NaCl 0,85%) có tỉ lệ chết cao nên không còn mẫu thu. - ứng kháng thể của cá tra ở tất cả nghiệm thức điều diễn ra đến cuối giai đoạn khảo sát.. - Cá tra bệnh mủ gan bên ngoài bình thường, một số cá bị xuất huyết ở da và vây, mang tái nhạt. - Dấu hiệu bệnh lý của cá tra sau khi cảm nhiễm vi khuẩn E. - Cá bệnh trong những ngày đầu và chết vào ngày thứ 4 đến ngày thứ 9 sau khi tiêm vi khuẩn E. - Hình 3: (A) Cá tra sau khi cảm nhiễm vi khuẩn E. - (B) Kết quả điện di sản phẩm PCR Kết quả định danh vi khuẩn bằng phương pháp. - với E.ictaluri (Hình 3B). - Như vậy có thể nói cá chết trong đợt gây nhiễm này nguyên nhân chính là do vi khuẩn E.ictaluri gây ra.. - Bên cạnh đó, có sự khác biệt đáng kể về tỉ lệ chết và tỉ lệ bảo hộ vaccine ở các nghiệm thức được trình bày ở Bảng 3, Hình 5, nghiệm thức đối chứng NaCl 0,85% có tỉ lệ chết cao nhất (71,43. - tỉ lệ bảo hộ vaccine thấp nhất (30%) và cũng là nghiệm thức có HGKT TB thấp nhất. - Trong số các nghiệm thức được ngâm vi khuẩn E.ictaluri nhược. - Hầu hết các thử nghiệm về ngâm vaccine, kết quả cho thấy, kháng thể sinh ra không được phát hiện trong huyết thanh, ngay khi có sự xuất hiện thì cũng không có liên quan tới việc bảo hộ (Nakanishi và Ototake, 1997). - Bảng 3: Tỉ lệ chết và tỉ lệ bảo hộ của cá tra ở các nghiệm thức Nghiệm thức ĐC. - Tỉ lệ chết. - Tỉ lệ bảo hộ. - Như vậy, có sự liên quan giữa hàm lượng kháng thể trong máu và tỉ lệ chết của cá tra thí nghiệm. - Lượng kháng thể càng cao thì tỉ lệ chết càng thấp, ngược lại, lượng kháng thể càng thấp thì tỉ lệ chết càng cao. - Đối với các nghiệm thức thí nghiệm có sự cảm nhiễm của vaccine nhược độc: tỉ lệ chết càng thấp thì tỉ lệ bảo hộ của vaccine càng. - Cá tra có đáp ứng miễn dịch đặc hiệu đối với vi khuẩn E.ictaluri nhược độc. - Đáp ứng miễn dịch mạnh nhất khi được ngâm vi khuẩn E.ictaluri. - nhược độc ở nồng độ 1x10 8 CFU/mL và gây nhiễm ở liều 1,5x10 5 CFU/mL (HGKT TB là 8,7, tỉ lệ bảo hộ 65. - Việc tiêm cảm nhiễm ở tuần thứ 2 còn có vai trò như mũi tiêm nhắc giúp kích thích quá trình sinh kháng thể diễn ra nhanh, mạnh hơn và mức HGKT TB ở tất cả các nghiệm thức vẫn tiếp tục tăng nhanh từ tuần thứ 3 đến cuối giai đoạn khảo sát.. - Cần thử nghiệm vaccine E.ictaluri nhược độc với số lượng cá tra lớn hơn, thời gian khảo sát dài hơn nhằm tìm ra quy luật biến động của lượng kháng thể trong máu cá. - Ứng dụng REP-PCR và PFGE để định týp vi khuẩn kháng choloramphenicol phân lập tại các trại nuôi thủy sản ở đồng bằng sông Cửu Long. - Nghiên cứu ứng dụng qui trình PCR chẩn đoán vi khuẩn Edwardsiella ictaluri trên thận cá tra (Pangasianodon hypopthalmus). - Phát hiện vi khuẩn. - Edwardsiella ictaluri gây bệnh mủ gan trên cá tra (Pangasianodon hypophthamus) bằng phương pháp PCR. - Định danh và thăm dò đặc tính gây đáp ứng miễn dịch của tác nhân gây bệnh đốm trắng mủ trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) nuôi ở Đồng bằng sông Cửu Long. - Khảo sát đáp ứng miễn dịch của cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) nhiễm vi khuẩn. - Xác định vi khuẩn gây bệnh. - trắng gan trên cá tra (Pangasius