- Xác định kháng nguyên phản ứng miễn dịch của bệnh nhân ung thƣ gan. - Abstract: Tìm hiểu sự biểu hiện của các protein ở mô gan ung thƣ so với mô gan bình thƣờng của các bệnh nhân ung thƣ gan thông qua các điểm protein trên bản gel điện di hai chiều. - Nhận dạng đƣợc một số protein có phản ứng miễn dịch (kháng nguyên ung thƣ gan) đặc hiệu với các kháng thể trong huyết tƣơng bệnh nhân ung thƣ gan. - Bệnh ung thƣ. - Ung thƣ gan. - Ung thƣ gan hiện là một trong các loại ung thƣ phổ biến nhất trên thế giới và Việt Nam, đây là bệnh ung thƣ có tỷ lệ tử vong cao, hơn nữa, tỷ lệ mắc bệnh đang có xu hƣớng tăng lên. - Hiện nay, các phƣơng pháp xét nghiệm lâm sàng nhƣ: sinh thiết gan, chụp cắt lớp vi tính, siêu âm chẩn đoán hình ảnh và xác định các chỉ thị sinh học nhƣ anpha fetoprotein là các “tiêu chuẩn vàng” để chẩn đoán ung thƣ gan. - Tuy nhiên, các xét nghiệm này chỉ phát hiện đƣợc bệnh vào giai đoạn muộn làm giảm khả năng sống sót của bệnh nhân ung thƣ gan. - Nhu cầu đặt ra là phải tìm kiếm các chỉ thị sinh học mới giúp chẩn đoán, phát hiện ung thƣ gan ở giai đoạn sớm.. - Trong những năm gần đây, các nhà khoa học đang tập trung nghiên cứu tìm kiếm các chỉ thị ung thƣ gan sử dụng công cụ proteomics. - Hơn nữa, nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng các protein nội bào có liên quan đến quá trình hình thành khối u, kích thích đáp ứng miễn dịch sinh ra các tự kháng thể và nhiều kháng nguyên ung thƣ đã đƣợc xác định trong cơ thể bệnh nhân ung thƣ. - đoán lâm sàng ung thƣ và dùng trong phân tích proteomics để nhận dạng các kháng nguyên liên quan đến khối u có khả năng liên quan đến sự chuyển dạng ác tính của tế bào. - Đây là hƣớng nghiên cứu mới nhằm tìm kiếm các chỉ thị sinh học ung thƣ liên quan đến đáp ứng miễn dịch.. - Trong khuôn khổ luận văn này, chúng tôi đã tiến hành đề tài nghiên cứu: “Xác định kháng nguyên phản ứng miễn dịch của bệnh nhân ung thư gan” nhằm mục đích: (a) Tìm hiểu sự biểu hiện của các protein ở mô gan ung thƣ so với mô gan bình thƣờng của bệnh nhân ung thƣ gan thông qua các điểm protein trên bản gel điện di hai chiều. - (b) Nhận dạng đƣợc một số protein khác biệt đặc trƣng giữa mô gan ung thƣ so với mô gan bình thƣờng. - (c) Xác định đƣợc protein có phản ứng miễn dịch (kháng nguyên ung thƣ gan) đặc hiệu với các kháng thể trong huyết tƣơng bệnh nhân ung thƣ gan.. - TỔNG QUAN VỀ UNG THƢ GAN. - Ung thƣ gan gồm hai dạng là ung thƣ gan nguyên phát và ung thƣ gan thứ phát (di căn). - Ung thƣ gan nguyên phát là ung thƣ xuất phát từ các loại tế bào gan, chiếm trên 80%. - ung thƣ gan nguyên phát, vì vậy, trong phạm vi luận văn này, chúng tôi chỉ đề cập tới ung thƣ gan nguyên phát với dạng phổ biến nhất là ung thƣ tế bào biểu mô gan (Hepatocellular Carcinoma-HCC) thƣờng gọi là ung thƣ gan.. - Phân loại ung thƣ gan nguyên phát. - Dựa vào phân loại mô bệnh học và loại tế bào phát sinh ung thƣ, ung thƣ gan nguyên phát đƣợc phân thành các loại chính nhƣ sau:. - Ung thƣ tế bào biểu mô gan là dạng ung thƣ biểu mô hay gặp nhất trong ung thƣ gan.. - Ung thƣ tế bào ống mật, đây là dạng ung thƣ bắt đầu ở các đƣờng mật nhỏ trong gan.. - Ung thƣ tế bào mạch là loại ung thƣ rất hiếm gặp, nó bắt nguồn từ mạch máu trong gan do gan tiếp xúc với các hóa chất công nghiệp.. - Nguyên nhân dẫn tới ung thƣ gan. - Mặc dù vẫn còn nhiều tranh cãi về cơ chế chính xác dẫn đến ung thƣ gan, song các nghiên cứu đều chỉ ra rằng tác nhân gây ung thƣ là đa nhân tố và quá trình tiến triển thành ung thƣ rất phức tạp, phải trải qua nhiều bƣớc. - Tuy rằng, các yếu tố nguy cơ có thể tác động đến tế bào gan theo các con đƣờng khác nhau nhƣng cuối cùng đều làm biến đổi di truyền và dẫn đến hình thành tế bào ung thƣ. - Ngoài ra, các yếu tố khác nhƣ tuổi, giới tính và chủng tộc cũng góp phần làm tăng nguy cơ bị ung thƣ gan.. - Các giai đoạn của ung thƣ gan. - Căn cứ theo Tiêu chuẩn phân kỳ lâm sàng Quốc tế bệnh ung thư (năm 1993), ung thƣ gan đƣợc phân loại thông qua các chẩn đoán lâm sàng, sử dụng kỹ thuật hình ảnh để xác định kích cỡ khối u nguyên phát và tình trạng bị xâm lấn các mạch máu. - Ngoài cách phân giai đoạn theo kích thƣớc u, hạch lympho, di căn (Tumor Node Metastasis - TNM), ung thƣ gan còn đƣợc phân loại thành 4 giai đoạn, gồm: giai đoạn I (T 1 , N 0 , M 0. - Các phƣơng pháp chẩn đoán ung thƣ gan. - Tuy vậy, AFP trong máu không đặc trƣng cho ung thƣ gan vì nồng độ AFP có thể cũng tăng trong một số trƣờng hợp khác. - 30% bệnh nhân ung thƣ gan mà hàm lƣợng AFP vẫn không tăng, nhất là đối với các khối u gan nhỏ hơn 3cm. - Hàm lƣợng AFP cao có thể nghĩ đến ung thƣ gan nhƣng không thể là yếu tố quyết định chắc chắn. - Vì thế, để chẩn đoán ung thƣ gan cần kết hợp xét nghiệm định lƣợng AFP và chẩn đoán hình ảnh bằng siêu âm, chụp cắt lớp vi tính hay chụp cộng hƣởng từ để có thể thấy đƣợc hình dạng, kích thƣớc và kết cấu của khối u, nhƣng để chẩn đoán chính xác u lành tính hay ác tính thì nhất thiết. - Do đó, cần tìm kiếm các chỉ thị sinh học có độ nhạy và độ đặc hiệu cao hơn để hỗ trợ cho AFP giúp chẩn đoán sớm ung thƣ gan.. - NGHIÊN CỨU CHỈ THỊ SINH HỌC ĐỐI VỚI UNG THƢ. - Các chỉ thị ung thƣ là những đại phân tử xuất hiện ở một bệnh ung thƣ, có nồng độ thay đổi theo chiều hƣớng tăng lên liên quan đến sự phát sinh và tăng trƣởng của những khối u ác tính. - Chỉ thị ung thƣ là những chất do các tế bào hoặc mô ung thƣ tổng hợp và tiết ra từ khối u bị phá vỡ hoặc đƣợc tạo ra từ các phản ứng của cơ thể đối với khối u, gồm hai dạng: chỉ thị tế bào và chỉ thị thể dịch.. - Đối với ung thƣ gan, chỉ thị ung thƣ đƣợc ứng dụng theo hai hƣớng chính sau: (a) Sàng lọc các nhóm nguy cơ cao để xác định đƣợc ung thƣ khi kích thƣớc khối u còn nhỏ (<. - (b) Xác nhận chẩn đoán ung thƣ ở những bệnh nhân có khối u lớn đã đƣợc phát hiện nhờ chụp X quang.. - MIỄN DỊCH CHỐNG UNG THƢ. - Khi nghiên cứu ung thƣ thực nghiệm, có nhiều bằng chứng thể hiện có sự kiểm soát của hệ thống miễn dịch của vật chủ đối với kháng nguyên ung thƣ, đồng thời, các nghiên cứu cũng chứng minh đƣợc sự có mặt của các kháng thể đặc hiệu trong ung thƣ.. - Khi tế bào bình thƣờng chuyển dạng ác tính thành tế bào ung thƣ, trong khối u xuất hiện các protein biểu hiện bất thƣờng, bị đột biến hoặc biến đổi sau dịch mã, đây chính là các kháng nguyên liên quan đến ung thƣ.. - Hiện nay, các nhà khoa học đang tập trung theo hƣớng nghiên cứu tìm kiếm các protein kháng nguyên liên quan đến khối u, các protein này kích thích sinh ra kháng thể trong huyết thanh, đây cũng là các dạng chỉ thị ung thƣ tiềm năng.. - Theo hƣớng nghiên cứu trên, trong đề tài này, chúng tôi đã kết hợp phân tích proteomics mô gan của bệnh nhân ung thƣ gan và thực hiện phản ứng miễn dịch Western blot hai chiều nhằm tìm ra các protein có biểu hiện khác biệt, đặc biệt là các protein kháng nguyên phản ứng miễn dịch với kháng thể trong huyết tƣơng của bệnh nhân ung. - thƣ gan, đây là các protein có tiềm năng trở thành chỉ thị sinh học giúp chẩn đoán sớm ung thƣ gan.. - Quy trình chiết protein từ mô gan. - Quy trình phân tích proteomics mô gan. - TÁCH CHIẾT PROTEIN TỪ MÔ GAN. - Dịch chiết mô gan bình thƣờng B. - Dịch chiết mô gan ung thƣ Hình 4. - Điện di kiểm tra các phân đoạn dịch chiết protein từ mô gan bình thƣờng và mô. - gan ung thƣ trên gel polyacrylamide 10% có SDS. - Phân tách hệ protein mô gan trên bản gel diện di hai chiều. - Hình ảnh bản gel 2DE mô gan bình thƣờng và mô gan ung thƣ cho thấy, các protein đã đƣợc phân tách tƣơng ứng với các spot trên bản gel. - A - Mô gan bình thƣờng B - Mô gan ung thƣ. - Đây là tiêu chí để đánh giá biểu hiện khác biệt của các spot trên các cặp bản gel gồm: spot tăng hoặc giảm ở bản gel mô ung thƣ so với bản gel mô BT. - Khi phân tích độc lập từng cặp bản gel, chúng tôi đã xác định đƣợc các spot protein biểu hiện khác biệt giữa mô gan ung thƣ so với mô gan bình thƣờng trên từng cặp bản gel 2-DE phân tách protein trong khoảng pH 3 - 10, dài 17cm (bảng 6) và phân tách protein trong khoảng pH 4 - 7, dài 7cm (bảng 7).. - Thống kê các spot biểu hiện khác biệt giữa mô gan ung thƣ so với mô gan bình thƣờng của từng bệnh nhân trên bản gel 2-DE 17cm, pH 3 - 10. - Thống kê các spot biểu hiện khác biệt giữa mô gan ung thƣ so với mô gan bình thƣờng của từng bệnh nhân trên bản gel 2-DE 7cm, pH 4 - 7. - ở bản gel mẫu ung thƣ so với bản gel mô bình thƣờng. - spot chỉ thấy xuất hiện rõ rệt ở bản gel mẫu ung thƣ. - hiện mờ nhạt hoặc không thấy trên bản gel mẫu mô ung thƣ. - Thống kê các spot protein biểu hiện khác biệt giữa bản gel mô gan ung thƣ so với bản gel mô gan bình thƣờng của cả 6 bệnh nhân HCC, chúng tôi nhận thấy có 52 spot khác biệt rõ ràng, xuất hiện trên các bản gel mô gan ung thƣ so với mô gan bình thƣờng, bao gồm: 6 spot chỉ thấy xuất hiện rõ rệt ở bản gel mô ung thƣ. - 23 spot biểu hiện tăng ở bản gel mô ung thƣ. - 18 spot biểu hiện giảm ở bản gel mô ung thƣ.. - đƣợc 13 protein tƣơng ứng với 13 spot biểu hiện khác biệt giữa bản gel mô gan ung thƣ so với bản gel mô gan bình thƣờng (bảng 8).. - Danh sách các protein biểu hiện khác biệt trên bản gel của mô gan ung thƣ so với mô gan bình thƣờng đƣợc xác định dựa trên cơ sở dữ liệu EMBL. - ĐC, bản gel mô gan bình thƣờng;. - HCC, bản gel mô gan ung thƣ.. - Sau khi phân tích hình ảnh bản gel 2-DE, những spot protein biểu hiện khác biệt giữa mô gan ung thƣ so với mô gan bình thƣờng đƣợc cắt và thủy phân, thu đƣợc hỗn hợp peptide sử dụng cho phân tích khối phổ. - Danh sách các protein đƣợc xác định bằng MALDI-TOF MS từ bản gel mô gan ung thƣ so sánh với mô gan đối chứng của bệnh nhân HCC. - Song song với việc phân tích proteomics mô gan của bệnh nhân ung thƣ gan, chúng tôi tiến hành thực hiện phản ứng western blot 2D. - Kết quả phản ứng Western Blot mẫu mô gan của bệnh nhân 8977. - Dựa vào vị trí tƣơng ứng của các spot phát sáng trên màng PVDF với các spot trên bản gel 2-DE dài 7cm và kết quả định danh protein, chúng tôi đã xác định đƣợc 4 protein trong mô gan của bệnh nhân có phản ứng miễn dịch với kháng thể trong huyết tƣơng của chính bệnh nhân đó là: protein ST7L biểu hiện tăng và protein MHC lớp I, HSP27, aldehyde dehydrogenase biểu hiện giảm ở mô gan ung thƣ so với mô gan bình thƣờng.. - Những điểm protein khác biệt, kể cả những protein biểu hiện tăng/giảm trong mô gan bệnh nhân ung thƣ gan đều là những đặc trƣng về bệnh và có thể là những protein chỉ thị ung thƣ. - Kết hợp xác định protein bằng MALDI-TOF MS và tra cứu cơ sở dữ liệu, chúng tôi đã nhận dạng đƣợc 38 protein biểu hiện khác biệt giữa mô gan ung thƣ so với mô gan bình thƣờng. - Tóm tắt chức năng chính của các protein biểu hiện khác biệt giữa mô gan ung thƣ so với mô gan đối chứng đã đƣơc nhận dạng. - Căn cứ vào chức năng chính của protein, các protein có biểu hiện khác biệt giữa mô gan ung thƣ so với mô gan bình thƣờng đƣợc nhóm thành 5 nhóm khác nhau dựa vào quá trình sinh học mà protein tham gia. - Trong nghiên cứu này, chúng tôi nhận dạng đƣợc 4 protein trong mô gan của bệnh nhân có phản ứng miễn dịch với kháng thể trong huyết tƣơng của chính bệnh nhân đó là:. - protein ST7L biểu hiện tăng và protein MHC lớp I, HSP27, aldehyde dehydrogenase biểu hiện giảm ở mô gan ung thƣ so với mô gan bình thƣờng. - Các protein này đƣợc tiếp tục tìm hiểu sâu hơn về chức năng và mối liên hệ của chúng với tình trạng ung thƣ.. - Các phân tử MHC lớp I tham gia trình diện kháng nguyên nội sinh: trong tế bào mang virus hay tế bào ung thƣ, các kháng nguyên VR, kháng nguyên ung thƣ là kháng nguyên nội sinh sẽ đƣợc các vi thể proteasome phân căt, chế biến tạo thành các peptide kháng nguyên. - Biểu hiện bất thƣờng của HSP27 cũng đƣợc phát hiện ở ung thƣ ruột kết và ung thƣ tuyến tiền liệt. - Protein này biểu hiện giảm gây ảnh hƣởng tới nhiều hoạt động chức năng trong gan và giúp tế bào ung thƣ thoát khỏi apoptosis. - Enzym này tham gia vào quá trình giải độc gan, enzym này biểu hiện giảm: có thể là hệ quả của quá trình tiến triển thành ung thƣ gây suy giảm chức năng gan. - hoặc thiếu hụt enzym này dẫn tới tình trạng gan nhiễm độc, từ đó bị biến đổi thành tế bào ung thƣ.. - Bƣớc đầu phân tích proteomics miễn dịch của bệnh nhân ung thƣ gan, chúng tôi rút ra một số kết luận sau:. - Đã phân tách đƣợc protein mô gan trên bản gel 2-DE và xác định đƣợc các spot protein biểu hiện khác biệt giữa mô gan ung thƣ và mô gan bình thƣờng của từng bệnh nhân ung thƣ gan. - Trong đó có 52 spot khác biệt chung ở các bệnh nhân gồm: 23 spot biểu hiện tăng, 18 spot biểu hiện giảm, 6 spot chỉ xuất hiện ở bản gel mô ung thƣ, 5 spot không xuất hiện ở bản gel mô ung thƣ.. - Sử dụng kit ECL Advance Western Blotting Detection , đã xa ́c đi ̣nh đƣơ ̣c t ỷ lệ pha loãng tối ƣu kháng th ể bậc mô ̣t và thẩm tách miễn dịch thành công trên 4 cặp bản gel điện di 2 chiều của 4 bệnh nhân ung thƣ gan và đã xác định đƣợc 4 protein có phản ứng miễn dịch la. - protein ST7L biểu hiện tăng và protein MHC lớp I, HSP27, aldehyde dehydrogenase biểu hiện giảm ở mô gan ung thƣ so với mô gan bình thƣờng.. - Tiếp tục nhận dạng các spot protein biểu hiện khác biệt giữa mô ung thƣ so với mô gan thƣờng và kết hợp với kết quả phân tích thẩm tách miễn dịch Western blot hai chiều trên số lƣợng bệnh nhân lớn hơn nhằm tìm ra các protein có tính kháng nguyên đặc trƣng cho ung thƣ gan.. - Tiếp tục thu thập mẫu và phân tích proteomics miễn dịch mô gan của bệnh nhân ung thƣ gan ở các giai đoạn ung thƣ khác nhau nhằm phân tích sự biến đổi thành phần các protein liên quan đến bệnh.. - Thu thập mẫu huyết tƣơng của bệnh nhân viêm gan B và C đang tiến triển thành ung thƣ gan và bệnh nhân ung thƣ gan có tiền sử nhiễm HBV và HCV nhằm tìm hiểu mối liên hệ giữa viêm gan B , C và ung thƣ gan trên ca ́c đối tƣơ ̣ng bê ̣nh nhân ung t hƣ gan ở. - Hoàng Văn Sơn (2011), “Các chỉ tố ung thƣ gan”, Tạp chí y học Việt Nam . - Bùi Phƣơng Thảo, Lê Lan Phƣơng, Trịnh Hồng Thái (2011), “Phân tích các protein biểu hiện khác biệt của mô gan ở bệnh nhân ung thƣ gan”, Tạp chí y học Việt Nam