- XÁC ĐỊNH MẦM BỆNH HIỆN DIỆN TRÊN HẠT LÚA GIỐNG IR 50404 TẠI HẬU GIANG. - Phát Triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ. - Hạt lúa giống, Hậu Giang, IR 50404, phương pháp giấy thấm, xác định mầm bệnh Keywords:. - Đề tài được thực hiện với mục tiêu xác định mầm bệnh hiện diện trên hạt lúa giống IR 50404 tại Hậu Giang nhằm tạo tiền đề cho các nghiên cứu phòng trị bệnh trên hạt. - Tổng số 28 mẫu hạt được thu thập từ các đại lý cung cấp lúa giống thuộc 7 địa điểm trồng lúa trọng điểm của tỉnh Hậu Giang gồm: huyện Châu Thành A, huyện Phụng Hiệp, huyện Vị Thủy, huyện Long Mỹ, thị xã Ngã Bảy, thị xã Long Mỹ và thành phố Vị Thanh.. - Kết hợp phương pháp đặt hạt trên giấy thấm và khảo sát hình thái, 7 mầm bệnh nấm được xác định gồm: Sarocladium oryzae, Fusarium moniliforme, Alternaria padwickii, Bipolaris oryzae, Curvularia spp., Aspergillus sp. - Tuy nhiên, không ghi nhận sự hiện diện của mầm bệnh vi khuẩn từ các mẫu hạt lúa giống IR 50404.. - Xác định mầm bệnh hiện diện trên hạt lúa giống IR 50404 tại Hậu Giang. - Quá trình canh tác lúa luôn chịu ảnh hưởng bởi rất nhiều yếu tố như khí hậu, dịch hại, côn trùng, đặc biệt là sự gây hại của các mầm bệnh như nấm và vi khuẩn trên hạt lúa làm ảnh hưởng đến sức khỏe của hạt (Ou, 1972). - Savary et al., 2000). - Mầm bệnh kí sinh trên hạt lúa giống gây hại trong suốt thời kì sinh trưởng, phát triển của cây lúa và còn liên quan mật thiết đến tình hình dịch bệnh sau khi gieo trồng (Fakir, 1983. - Kato et al., 1988. - Cottyn et al., 2001).. - Theo các nghiên cứu, có nhiều bệnh trên lúa có nguồn gốc phát sinh từ hạt giống như bệnh cháy bìa lá lúa gây ra bởi vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. - oryzae, vi khuẩn Pseudomonas avenae gây bệnh sọc nâu (Mew and Misra, 1994. - Do đó, đề tài được thực hiện nhằm xác định mầm bệnh nhiễm trên hạt lúa giống IR 50404 để làm tiền đề hỗ trợ cho các nghiên cứu phòng trị mầm bệnh trên hạt trước khi gieo trồng.. - Cụ thể, hạt lúa giống IR 50404 được lấy tại các đại lý cung cấp lúa giống thuộc 7 địa điểm trồng lúa trọng điểm của tỉnh Hậu Giang gồm: huyện Châu Thành A, huyện Phụng Hiệp, huyện Vị Thủy, huyện Long Mỹ, thị xã Ngã Bảy, thị xã Long Mỹ và thành phố Vị Thanh. - 2.2 Phương pháp. - 2.2.1 Xác định mầm bệnh nấm nhiễm trên hạt lúa giống. - Thí nghiệm kiểm tra sự hiện diện của nấm bệnh lưu tồn trên hạt được thực hiện theo phương pháp giấy thấm (blotter method) của ISTA (International. - Sau 6-8 ngày, hạt được quan sát dưới kính hiển vi nhìn nổi để xác định những hạt bị nhiễm nấm. - Sau đó, nấm bệnh được phân lập và tách ròng trên môi trường PDA (200 g khoai tây, 20 g dextrose, 20 g agar, nước cất 1000 mL) (Atlas, 2010) bằng phương pháp cấy đơn bào tử hoặc đỉnh sinh trưởng (Burgess et al., 2008).. - Hình thái tản nấm trên môi trường PDA được quan sát kết hợp với quan sát hình thái sợi nấm, màu sắc của sợi nấm, dạng bào tử, kích thước của bào tử dưới kính hiển vi quang học để xác định thành phần nấm bệnh dựa trên mô tả của Mew and Misra (1994), Mew and Gozales (2002).. - 2.2.2 Xác định mầm bệnh vi khuẩn nhiễm trên hạt lúa giống. - Phương pháp xác định vi khuẩn trên hạt được thực hiện theo mô tả của Cottyn et al. - Vi khuẩn P. - fuscovaginae gây bệnh thối nâu bẹ được xác định bằng cách trải 40 µL dung dịch trên môi trường Miyajima’s (450 mg penicillin G, 45 mg novobiocin, 75 mg cycloheximide, 3 mL ethanol 75%, 940 mL môi trường King’s B, 50 mL nước cất) (Miyajima et al., 1983) và ủ ở nhiệt độ 28ºC. - Sau 5 ngày, các khuẩn lạc có đặc điểm tròn, trơn, lồi, trong suốt, màu kem và tạo sắc tố xanh lá cây ở giữa khuẩn lạc thì mẫu hạt được xác định đã nhiễm vi khuẩn P. - avenae gây bệnh sọc nâu được xác định bằng cách trải 40 µL dung dịch trên môi trường chuyên biệt S-PG (1,3 g KH 2 PO 4 , 1,2 g Na 2 HPO 4 , 5 g (NH 4 ) 2 SO 4 , 0,25 g MgSO 4 .7H 2 O, 24 mg Na 2 MoO 4 .2H 2 O, 10 mg EDTA-Fe, 10 µg L- cystine, 10 g D-sorbitol, 50 mg pheneticillin potassium, 10 mg ampicillin sodium, 10 mg cetrimide, 1 mg methyl violet, 20 mg phenol red, 15 g agar và thêm nước cất đến 1000 mL) (Tsushima et al., 1986) và ủ ở nhiệt độ 28ºC. - 3-5 ngày nuôi cấy, nếu trên môi trường xuất hiện khuẩn lạc dạng A sẽ có màu nâu đỏ, tròn, trơn và bề mặt cong lồi thì mẫu được xác định đã nhiễm vi khuẩn P. - Nếu môi trường xuất hiện khuẩn lạc dạng B có màu tím, tròn, trơn và bề mặt cong lồi thì mẫu hạt có thể bị nhiễm vi khuẩn P. - glumae hoặc vi khuẩn P. - Để phân biệt hai loài vi khuẩn này, khuẩn lạc dạng B được tiếp tục nuôi trên môi trường muối khoáng Ayers (0,2 g KCl, 0,2 g MgSO 4 .7H 2 O, 1 g NH 4 H 2 PO 4 , 12 g agar, thêm nước cất đến 1000 mL) (Mew and Misra, 1994) có bổ sung đường inositol và ủ ở nhiệt độ 28ºC. - Sau 3 ngày nuôi cấy, nếu khuẩn lạc phát triển được trên môi trường chứng tỏ mẫu hạt bị nhiễm vi khuẩn P.. - glumae và ngược lại là vi khuẩn P. - avenae (Cottyn et al., 1994).. - syringae gây bệnh thối bẹ được xác định bằng cách trải 40 µL dung dịch trên môi trường Nutrient Agar (NA) (5 g peptone, 3 g beef extract, 5 g NaCl, 15 g nutrient agar, nước cất 1000 mL, pH 6.8) (Shivaji et al., 2006) và ủ ở nhiệt độ 28ºC. - Sau 3-5 ngày, các khuẩn lạc có đặc điểm tròn, nhỏ, trơn, lồi có màu trắng mờ được chọn và cấy lên môi trường King’s B (20 g peptone, 1,5 g K 2 HPO 4 , 1,5 g MgSO 4 , 20 g agar, 15 mL glycerol, 1000 mL nước cất) (King et al., 1954. - Sau 3-5 ngày, đĩa vi khuẩn được đặt dưới ánh sáng tia UV, nếu khuẩn lạc có khả năng phát quang chứng tỏ mẫu hạt bị nhiễm vi khuẩn P. - Sau đó, các chủng vi khuẩn được xác định bằng phương pháp chủng bệnh (pathogenicity test), hạt được gieo vào hộp nhựa có đường kính 30 cm trong 3 tuần, sau đó huyền phù các chủng vi khuẩn được pha loãng ở mật số 10 9 CFU/ml và chủng bệnh bằng phương pháp cắt lá. - Trước khi chủng bệnh khử trùng kéo bằng ethanol 70% sau đó nhúng vào huyển phù vi khuẩn. - Các chủng vi khuẩn là P. - Vi khuẩn thuộc chi Xanthomonas được xác định bằng cách trải 40 µL dung dịch trên môi trường Wakimoto cải tiến (0,5 g Ca(NO 3 ) 2 .4H 2 O, 0,82 g Na 2 HPO 4 , 5 g pepton, 20 g sucrose, 0,05 g FeSO 4 .7H 2 O, 15 g agar, nước cất 1000 mL, pH 7.0) (Karganilla et al., 1973). - Sau 3-5 ngày nuôi cấy, dựa vào đặc điểm hình thái khuẩn lạc đặc trưng của vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. - oryzicola (Xcola) gây bệnh sọc trong trên môi trường Wakimoto cải tiến có dạng tròn, trơn, viền rõ và có màu vàng chanh chọn các khuẩn lạc có các đặc điểm trên để phân lập và tách ròng. - chủng vi khuẩn này được chủng lên cây lúa tại thời điểm 45 ngày sau khi gieo bằng phương pháp cắt chóp lá để xác định vi khuẩn Xoo và phun lên lá để xác định vi khuẩn Xcola với mật số 10 9 CFU/mL (Khoa, 2005). - Sau 14 ngày chủng bệnh, quan sát triệu chứng với triệu chứng điển hình của bệnh cháy bìa lá và bệnh sọc trong để từ đó xác định vi khuẩn Xoo và Xcola. - 3.1 Thành phần mầm bệnh nhiễm trên hạt lúa giống tại Hậu Giang. - Kết quả sau khi phân lập và xác định mầm bệnh của tổng số 28 mẫu hạt được thu tại các địa điểm thuộc tỉnh Hậu Giang cho thấy hạt lúa giống IR 50404 có sự hiện diện 7 mầm bệnh nấm gồm Sarocladium oryzae, Fusarium moniliforme, Alternaria padwickii, Bipolaris oryzae, Curvularia spp., Aspergillus sp. - Nấm Sarocladium oryzae: trên hạt, tản nấm có màu trắng, sợi nấm ít phân nhánh, mọc sát bề mặt hạt lúa, nấm mọc một phần đôi khi bao phủ toàn bộ hạt lúa (Hình 1A1). - Trên môi trường PDA, có thể thấy những khoanh màu trắng bằng phẳng, sợi nấm ở mép mọc rất mượt và tản nấm có màu cam nhạt (Hình 1A2). - Dưới kính hiển vi ở vật kính 40X, sợi nấm có màu trắng, bào tử nhẵn, đơn bào, hình trụ với đầu tròn, dạng thẳng và hình thành đơn lẻ, kích thước bào tử 2,5-8,5 µm × 1,5-3,5 µm (Hình 1A4).. - Nấm Fusarium moniliforme: trên hạt, sợi nấm phát triển dày đặc như bông gòn, màu trắng, tơi xốp bao quanh một phần hoặc toàn bộ hạt lúa và đến thời điểm 7 ngày sợi nấm bắt đầu chuyển sang màu vàng (Hình 1B1). - Trên môi trường PDA, tản nấm phát triển khá nhanh, lúc đầu tản nấm có màu trắng, sau đó ở mặt dưới tản nấm chuyển sang màu vàng nhạt từ tâm và lan ra xung quanh. - Dưới kính hiển vi ở vật kính 40X, bào tử có 2 dạng là tiểu bào tử và đại bào tử. - Tiểu bào tử không màu, trong suốt, không có vách ngăn, hình trứng, kích thước 5,0-7,5 µm x 2,5-4,5 µm. - Đại bào tử không màu, hơi cong ở hai đầu và có từ 3-5 vách ngăn, kích thước 30,0-40,5 µm x 2,5-4,0 µm (Hình 1B4).. - Tản nấm trên môi trường PDA mọc đều sau đó phát triển thành những khoanh tròn đồng tâm có màu xám trắng, sợi nấm mịn và hơi nhô lên khỏi môi trường (Hình 1C2). - Mặt dưới tản nấm có màu đen, phía rìa ngoài có màu trắng mọc đều (Hình 1C3). - Dưới kính hiển vi ở vật kính 40X, sợi nấm phân nhánh và có nhiều vách ngăn, bào tử nấm thẳng, có dạng hình chùy một đầu to và thon nhỏ dần về đầu kia. - Bào tử có vách dày, có 3-5 vách ngăn và thắt eo lại tại vách ngăn, tế bào thứ 2 và thứ 3 thường phình to hơn các tế bào còn lại, kích thước µm x 12,5-17,5 µm (Hình 1C4).. - Trên môi trường PDA, sợi nấm mọc tơi lên nhiều trung tâm và cuộn chặt vào nhau, khi phát triển đến mép thì có màu nâu đen, ở mặt dưới đĩa tản nấm có màu đen (Hình 1D2,3). - Dưới kính hiển vi ở vật kính 40X, bào tử có màu nâu tối hoặc nâu oliu, hình thuyền hơi cong thon dần về phía hai đầu, mỗi bào tử có 5-9 vách ngăn, kích thước 60-112,5 µm x 12,5-23 µm (Hình 1D4).. - Nấm Curvularia spp.: trên hạt, tản nấm có màu đen bao quanh một phần hay toàn bộ hạt và khi phát triển lâu ngày làm cho hạt bị biến đổi màu (Hình 1E1). - Trên môi trường PDA, tản nấm phát triển nhanh, ở mặt trên và mặt dưới đĩa đều có màu đen (Hình 1E2,3). - Dưới kính hiển vi ở vật kính 40X, bào tử màu nâu sẫm, hình thuyền, tròn ở đầu, hơi thắt lại ở đế cuống, thành trơn, nâu nhạt tới đậm gồm 3 vách ngăn, tế bào thứ 2 lớn hơn tế bào 1, 3, 4 và uốn lại ở tế bào thứ 2, kích thước µm x 7,5-13,0 µm (Hình 1E4).. - Nấm Aspergillus sp.: trên hạt, nấm mọc thành từng cụm trên bề mặt, khi phát triển tản nấm có màu xám xanh và thường được tìm thấy ở phần đầu và đuôi hạt (Hình 1F1). - Trên môi trường PDA, tản nấm phát triển và tạo thành những cụm trên bề mặt hạt, mặt dưới tản nấm có màu vàng (Hình 1F2,3).. - Dưới kính hiển vi ở vật kính 40X, cuống bào tử. - mang thể bình không có vách ngăn, không màu, phía trên đỉnh có một túi phình to, trên thể bình là các bào tử đính xếp thành chuỗi, không màu, có hình dạng tròn với kích thước trung bình 4,5 µm (Hình 1F4).. - Nấm Mucor sp.: trên hạt, sợi nấm phát triển bao phủ toàn bộ bề mặt hạt (Hình 1G1), trên môi trường PDA, sợi nấm có dạng như sợi bông vải khi còn non và sau đó có màu sậm hơn do hình thành lập thể mang bọc bào tử vách dày (Hình 1G2,3).. - Dưới kính hiển vi ở vật kính 40X, sợi nấm không phân nhánh, mỗi bọc bào tử phát triển ở ngọn, thể mang bọc bào tử phát triển riêng biệt, không cùng nhóm, bọc bào tử đổi sang màu nâu khi bào tử trưởng thành, kích thước trung bình của bào tử 3,5 µm (Hình 1G4).. - Kết quả phân lập không ghi nhận sự hiện diện của mầm bệnh vi khuẩn trên hạt lúa giống IR 50404. - Nguyên nhân có thể do thời gian lưu tồn của vi khuẩn trên hạt ngắn hơn so với nấm bệnh.. - Cụ thể, vi khuẩn P. - glumae ở điều kiện tồn trữ chỉ tồn tại trên hạt được 2 tháng (Bradbury, 1984).. - Nghiên cứu của Kauffman and Reddy (1975) cũng cho rằng hạt lúa giống khi được tồn trữ trên 2 tháng không phải là nơi lưu tồn của mầm bệnh vi khuẩn. - Tuy nhiên, đối với một số loài nấm thì thời gian lưu tồn trên hạt rất lâu, như nấm B. - oryzae bào tử nấm có thể tồn tại trên hạt trung bình là 2 năm, nấm F. - moniliforme ở điều kiện ngoài đồng hay ở nhiệt độ phòng nấm có thể tồn tại trên hạt sau 4-10 tháng và hơn 3 năm trong điều kiện bảo quản lạnh 7ºC (Ou, 1985). - Do đó, kết quả nghiên cứu không ghi nhận sự hiện diện của mầm bệnh vi khuẩn trên hạt có thể do mẫu hạt đã được tồn trữ quá lâu (trên 2 tháng). - Ngoài ra, nếu hạt lúa giống được phơi trong điều kiện thời tiết khô nóng thì các phản ứng hóa học trong tế bào vi khuẩn bị phá vỡ bởi bức xạ mặt trời làm cho một số vi sinh vật bị tiêu diệt hoặc hạt được sấy khô hay nhiệt độ tồn trữ cao hơn 30ºC cũng làm hạn chế sức sống của mầm bệnh vi khuẩn (Ou, 1985. - Hình 1: Hình thái 7 loài nấm được phân lập trên mẫu lúa giống IR 50404 thu thập tại Hậu Giang.. - Hình thái sợi nấm phát triển trên hạt, tản nấm trên môi trường PDA ở mặt trên, tản nấm trên môi trường PDA ở mặt dưới và bào tử nấm dưới kính hiển vi quang học của nấm Sarocladium oryzae (A1,. - 3.2 Sự hiện diện của nấm bệnh trên các mẫu hạt lúa giống tại các địa điểm thu mẫu ở Hậu Giang. - Trong số 7 loài nấm hiện diện trên hạt lúa giống thì tại huyện Phụng Hiệp có 6 loài, kế đến là huyện Châu Thành A, huyện Long Mỹ và thành phố Vị Thanh có 5 loài, huyện Vị Thủy và thị xã. - Bảng 1: Sự hiện hiện của nấm bệnh trên các mẫu hạt lúa được thu tại các địa điểm thu mẫu ở Hậu Giang. - Kết quả nghiên cứu tương đồng với kết quả của Mew and Misra (1994), Mew and Gonzales (2002) khi xác định các mầm bệnh trên hạt lúa thu từ nhiều vùng khác nhau trên thế giới. - bằng phương pháp giấy thấm, Butt et al. - (2011) phân lập nấm trên hạt giống tồn trữ, Trần Thị Thu Thủy và Nguyễn Văn Lực (2014) phân lập nấm bệnh trên hạt ở Sóc Trăng đều ghi nhận sự hiện diện của nấm F. - Nấm có khả năng sinh ra hạch nấm trong nội nhũ của hạt nên có thể tồn tại trên hạt trong thời gian dài làm giảm chất lượng hạt lúa, nấm tồn trữ trong rơm rạ và gây hại cho lúa qua các mùa vụ (Ou, 1985. - Kết quả phân lập tương đồng với nghiên cứu của nhiều tác giả khi phân lập nấm trên hạt ở nhiều quốc gia trong đó có Việt Nam và kết quả cho thấy phần lớn các mẫu hạt đều có sự hiện diện của nấm Aspergillus sp. - (Ora et al., 2011. - Zafar et al., 2014). - Bên cạnh đó, nấm mốc không có diệp lục tố, không tự tổng hợp được chất hữu cơ, cần lấy chất dinh dưỡng từ bên ngoài môi trường mà phần nội nhũ của hạt lúa chứa chủ yếu là chất đường bột, protein, chất béo. - Nhóm nấm này chủ yếu nhiễm vào hạt lúa trong quá trình tồn trữ làm thay đổi màu hạt, ảnh hưởng đến sức nảy mầm và làm giảm chất lượng hạt đáng kể (Koirala et al., 2005).. - Từ kết quả nghiên cứu cho thấy việc xác định mầm bệnh trên hạt lúa giống IR 50404 là cần thiết để ứng dụng các biện pháp xử lý hạt giống trước khi gieo trồng nhằm loại bỏ những mầm bệnh không mong muốn bằng các biện pháp sinh học như sử dụng vi khuẩn đối kháng hay dịch trích thực vật để phòng trị mầm bệnh trên hạt.. - Thí nghiệm đã xác định được 7 loài nấm nhiễm trên hạt lúa giống IR 50404 tại Hậu Giang gồm Sarocladium oryzae, Fusarium moniliforme, Alternaria padwickii, Bipolaris oryzae, Curvularia spp., Aspergillus sp., và Mucor sp.. - Tuy nhiên, không ghi nhận được sự hiện diện của mầm bệnh vi khuẩn trên hạt lúa giống IR 50404.. - Sở Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn Hậu Giang, 2016. - Xác định nấm gây bệnh trên hạt lúa tại Tỉnh Sóc Trăng