- Nghiên cứu được thực hiện nhằm xác định thành phần loài và mức độ nhiễm vi bào tử trùng Microsporidia nhiễm trong cơ cá tra ở giai đoạn cá hương, cá giống và cá nuôi thương phẩm (cá thịt). - Cường độ nhiễm ở cá hương dao động từ 2-14 bào nang/cá, ở cá giống từ 1-160 bào nang/cá và cá thịt từ 1- 83 bào nang/cá. - Kết quả mô học xác định vùng cơ của cá tra nhiễm bào nang gạo bị mất cấu trúc và hoại tử, các tế bào mô bị vi bào tử trùng Mirosporidia ly giải hoàn toàn. - Phân tích PCR mẫu cơ cá tra bệnh gạo cho thấy vi bào tử trùng nhiễm trong cơ với vạch sản phẩm khuếch đại có kích thước là 1100 bp. - Kết quả định danh bằng quan sát hình thái kết hợp giải trình tự gen xác định vi bào tử trùng thuộc giống Kabatana.. - Xác định mầm bệnh vi bào tử trùng (Microsporidia) nhiễm trong cơ cá tra (Pangasianodon hypophthalmus). - Cá tra (P. - Trong đó, vi bào tử trùng Microsporidia có thể gây thiệt hại về kinh tế cho nghề nuôi cá tra. - Thực tế cho thấy bệnh do vi bào tử trùng nhiễm trong cơ cá tra ở dạng bào nang hình tròn hoặc bầu dục, màu trắng sữa nên còn được gọi là bệnh “gạo”. - Kết quả nghiên cứu của một số tác giả nước ngoài ghi nhận vi bào tử trùng Microsporidia ký sinh trong tổ chức cơ quan của cá thường có dạng bào nang màu trắng sữa. - Lúc cá nhiễm nặng có thể nhìn thấy rõ các bào nang rất lớn trên thân cá (Lom and Dykova, 1992. - Hiện nay, các phương pháp thường được sử dụng như soi tươi, nhuộm mẫu, cắt mô cũng được thực hiện để chẩn đoán nhanh cá bị nhiễm vi bào tử trùng Microsporidia (Woo, 2006. - Hiện nay, chưa có nhiều nghiên cứu về đặc điểm bệnh học của vi bào tử trùng gây bệnh gạo trên cá tra nuôi ở ĐBSCL. - Vì vậy, nghiên cứu “Xác định mầm bệnh vi bào tử trùng (Microsporidia) nhiễm trong cơ cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) là cần thiết để làm tiền đề cho những nghiên cứu sâu hơn về bệnh gạo trên cá tra.. - Thu mẫu cá còn sống hoặc vừa mới chết, tiến hành tách (phi lê) cơ cá, dùng dao cắt phần cơ bị nhiễm bào nang gạo cho vào dung dịch Formol trung tính 10%, sau 24 giờ tiến hành rửa mẫu cho đến hết formol thì chuyển sang trữ trong cồn 70% cho đến khi phân tích mô học. - Trên cùng mẫu cá bệnh, một số phần cơ khác có bào nang gạo và không có bào nang gạo được trữ trong ethanol 100% để chiết tách DNA dùng cho phân tích PCR.. - Tiến hành phi lê phần cơ của cá, dùng đĩa petri ép mẫu cơ cá và quan sát mẫu dưới ánh sáng đèn neon hoặc ánh sáng mặt trời để tìm các túi bào nang màu trắng sữa lẫn trong cơ cá. - Thu bào nang bằng cách loại bỏ các phần cơ xung quanh bào nang, sau đó để lên lame sạch, dùng kim mũi giáo chọc thủng bào nang. - Nhuộm mẫu: Phết mẫu bào nang gạo, để khô tiêu bản ở nhiệt độ phòng. - CĐN = số bào nang/cơ cá.. - Các mẫu cơ cá nhiễm bào nang trữ trong cồn 70% sẽ được xử lý qua 3 giai đoạn: loại nước, làm trong mẫu, tẩm paraffin. - Sản phẩm PCR của vi bào tử trùng Microsporidia được gửi đến Công ty sinh học Nam Khoa để giải trình tự DNA trực tiếp thông qua hệ thống giải trình tự mao quản tự động (CEQ 8000, Beckman Coulter).. - Cơ thịt cá ở giai đoạn cá hương có kích thước nhỏ, trong suốt nên có thể nhìn thấy rõ các bào nang gạo màu trắng sữa rất to ký sinh bên trong (Hình 1A).. - Khi tách lớp cơ, các bào nang có lớp màng bao khá ổn định, không bị vỡ (Hình 1B). - Giai đoạn cá giống và cá thịt nhiễm vi bào tử trùng, một số trường hợp trên da cá xuất hiện những vết nhỏ li ti (Hình 1C), hoặc có một vài đến rất nhiều vết hoại tử tròn lõm sâu vào trong cơ của cá.. - Sau khi tách phần cơ của cá, hầu hết các bào nang tồn tại trong cơ dưới dạng những túi tròn hoặc hình thoi hoặc những vệt dài, bên trong chứa chất lỏng màu trắng sữa, đôi khi có màu hơi vàng, với đường kính bào nang từ 2-9 mm. - Đặc biệt, ở một số mẫu cá nhiễm bào nang bệnh gạo nặng, các bào nang hình hạt gạo này từ màu trắng sữa sẽ chuyển sang màu nâu hoặc ở giữa bào nang gạo có chấm màu đen nhỏ, sau đó màu đen lan rộng dần hết bào nang. - Các bào nang thường có xu hướng tập trung nhiều ở phần cơ gần lớp da của cá.. - Ở những ao cá thịt nhiễm vi bào tử trùng Microsporidia trong thời gian dài, các bào nang gạo chuyển sang màu vàng, đông vón lại và vẫn nằm trong cơ cá. - Các bào nang này có thể được tách ra khỏi phần cơ của cá. - Hoặc những mẫu cá bị dị hình cũng nhiễm vi bào tử trùng Microsporidia.. - Một số bào nang có vệt màu vàng, sau chuyển dần sang màu đen.. - Bằng phương pháp soi tươi, kết quả phân tích 578 mẫu cá ở Cần Thơ, An Giang và Vĩnh Long đã phát hiện 473 mẫu nhiễm vi bào tử trùng Misrosporidia. - Trong đó, kiểm tra 30 mẫu cá hương thu ở Cần Thơ cho thấy có đến 28 mẫu nhiễm bào nang gạo, tỉ lệ nhiễm chiếm 93,3%, cường độ nhiễm dao động từ 2-14 bào nang/cá.. - Tỉ lệ nhiễm trên cá giống ở Cần Thơ từ 70-83,3%, cường độ nhiễm dao động từ 1-181 bào nang/cá, cá giống ở An Giang có tỉ lệ nhiễm khá cao, chiếm từ 86,6-96,6%. - và cường độ nhiễm từ 1-160 bào nang/cá. - Mẫu cá ở Vĩnh Long có tỉ lệ nhiễm và cường độ nhiễm từ 1-83 bào nang/cá. - Đối với cá thịt, tỉ lệ nhiễm trên mẫu ở Cần Thơ từ 66,6-80%, cường độ nhiễm từ 1-70 bào nang/cá. - Tỉ lệ nhiễm trên mẫu cá ở An Giang chiếm từ và cường độ nhiễm từ 1-44 bào nang/cá. - Mẫu cá ở Vĩnh Long có tỉ lệ nhiễm từ 40-73,3% và cường độ nhiễm từ 1-76 bào nang/cá.. - Nhìn chung, tỉ lệ nhiễm ở các ao cá giống dao động từ 70-96,6% và cường độ nhiễm từ 1-181 bào nang/cá. - cường độ nhiễm từ 1-76 bào nang/cá. - Kết quả nghiên cứu của đề tài cho thấy tỉ lệ nhiễm và cường độ nhiễm vi bào tử trùng Microsporidia nhiễm trong cơ cá tra khá cao, điều này là do đề tài không thu mẫu ngẫu. - Theo đó, nghiên cứu này ghi nhận tỷ lệ nhiễm chỉ dao động từ 40- 85,7% và cường độ nhiễm từ 0-9 bào nang/cá.. - Tổng cộng có 195 mẫu mô cơ cá tra thu được từ các vùng cơ nhiễm bào nang gạo. - Quan sát tiêu bản mô Hình 3A có sự xuất hiện bào nang tiên khởi (sporophorocyst) trong các bó cơ. - Từ lát cắt của tiêu bản rất dễ dàng nhận thấy các bào nang tiên khởi bắt đầu hình thành ngay từ bên trong của các bó cơ vân. - Bào nang ký sinh làm tổn thương nghiêm trọng cho các bó cơ vân, vi bào tử trùng được bào nang bảo vệ và chúng phát triển lớn dần bên trong bào nang. - Tuy nhiên, quan sát kỹ có thể thấy các bào nang tiên khởi có mật độ bào tử rất ít và chúng chưa được bao bọc bởi màng liên kết dày. - Các bào nang mới bắt đầu phân hủy các tế bào cơ trong từng sợi cơ, chưa gây ra các biểu hiện như xuất huyết và trương phồng các bó cơ. - Vì vậy, mức độ gây tổn thương mô học trong giai đoạn này thấp và bào tử dễ dàng bị tiêu diệt bởi các tác nhân lý hóa từ bên ngoài.. - Cần Thơ Cá giống 46 15 Hoại tử, mất cấu trúc tế bào, xuất hiện các bào nang tiên khởi Cá thịt 12 4 Hoại tử, vùng cơ bị ly giải, xuất hiện các bào nang tiên khởi Vĩnh. - Long Cá giống 44 15 Ly giải các tế bào cơ, màng bào nang dày, lan tỏa. - Cá thịt 9 3 Hoại tử, vùng cơ bị ly giải, xuất hiện các bào nang tiên khởi An Giang Cá giống 75 25 Xuất hiện các bào nang tiên khởi, ly giải vùng cơ bên trong bào. - nang, bào nang hình thoi, màng dày. - Cá thịt 9 3 Các bào nang hình thoi đến tròn, màng dày, lan tỏa nhiều hướng, bó cơ mất cấu trúc và bị phân hủy. - Tiêu bản mô ở Hình 3B, C cho thấy màng bào nang gồm một lớp mô liên kết khá dày, màng bảo vệ các bào tử Microsporidia bên trong và kết nối với các bó cơ để giữ vững chắc bào nang. - Khi nhuộm mẫu cơ với H&E thì các bào tử sẽ bắt màu tím của Haematocyline. - nang, các vi bào tử Microsporidia rất khó bị tiêu diệt.. - Các tiêu bản mô cơ cho thấy các bào tử hình thành bên trong tế. - Ở giai đoạn cuối cùng, cấu trúc bên trong sợi cơ được thay thế bằng các bào tử và được bảo vệ bởi chính màng sợi cơ đó.. - arthuri cho thấy các bào tử K. - Theo kết quả nghiên cứu của Joh et al., (2007) trên loài cá chình Anguilla japonica ở Hàn Quốc nhiễm Heterosporis anguillarum đã ghi nhận sự xuất hiện các bào nang tiên khởi trong các sợi cơ ở giai đoạn đầu của quá trình nhiễm bệnh. - Bên cạnh đó, quá trình ly giải các sợi cơ, sự xuất hiện các bào nang tiên khởi với kích thước và hình dạng khác nhau cũng được ghi nhận bên trong các bó cơ.. - Hình 3: Tiêu bản cắt mô cơ cá tra nhiễm bào nang gạo (20X). - A: Bào nang mới hình thành (mũi tên. - B&C: Bào nang chứa các bào tử với vùng cơ bị ly giải (mũi tên. - D: Bào tử trùng lây nhiễm qua vùng cơ lân cận, cơ mất cấu trúc và bị phân hủy - mô cá thịt. - 3.3 Kết quả định danh vi bào tử trùng Kết quả quan sát tiêu bản tươi cho thấy các bào tử có cấu tạo bên ngoài dạng hình quả lê hoặc hình trứng, hơi thon nhỏ ở cả 2 đầu. - Các bào tử này có kích thước rất nhỏ, nhỏ hơn gần 10 lần so với kích thước của các loài vi bào tử trùng khác. - Bên trong có thể quan sát thấy 1 sợi cực dạng xoắn nối liền với 1 cực nang ở phần sau của bào tử. - Bảng 2: Đặc điểm của bào tử Kabatana sp. - Hình dạng bào tử Hình trứng, quả lê Chiều dài bào tử 3,1±1,5 µm Đường kính bào tử 2,3±1,2 µm. - Sợi cực của bào tử Cấu tạo liền mạch, xoắn và khó phân biệt rõ. - Không bào của bào tử Nhỏ, chiếm 1/3 chiều dài bào tử Bào nang Hình thoi hoặc bầu dục. - (2009) có thể xác định vi bào tử trùng ký sinh trong bào nang gạo ở cơ các tra thuộc giống vi bào tử trùng Kabatana.. - nội ký sinh trong các mô cơ vân, cơ trơn của cá, có kích thước nhỏ nhất trong nhóm vi bào tử trùng, dao động từ 2x3 µm. - bào tử. - tạo những bào nang hình thoi, màu trắng đục, kích thước từ 1,5-6 mm bên trong các sợi cơ của cá (Sprague, 1992. - Cần Thơ Cá hương 1 3 Cơ có bào nang. - Cá thịt 1 5 Cơ có bào nang. - Vĩnh Long Cá giống 2 6, 7 Cơ có bào nang. - An Giang Cá giống 2 9, 13 Cơ có bào nang. - Tổng cộng có 9 mẫu chứa bào nang gạo ở các giếng và 3 mẫu ở vùng cơ không chứa bào nang gạo (các giếng . - Kết quả điện di sản phẩm PCR (Hình 5) cho thấy 9 mẫu chứa bào nang cho kết quả dương tính và hiện vạch ở vị trí 1100 bp. - Kết quả PCR ở 2 giếng 10 và 11 là mẫu cơ không có bào nang gạo, tuy nhiên, vẫn có vạch hiện ở vị trí 1100 bp khá mờ, điều này cho thấy có lẽ trong mẫu cơ vẫn có vi bào tử Microsporidia ký sinh ở mật độ rất thấp. - Kết quả này hoàn toàn phù hợp với kết quả phân tích mô học ở phần trên, vì có thể các mẫu cơ này nhiễm Microsporidia trong giai đoạn đầu (giai đoạn nhiễm bào tử tiên khởi) nên chưa hình thành bào nang gạo. - Sự phá hủy cấu trúc song song với sự phát sinh bào tử mới diễn ra bên trong các bó cơ và không làm thay đổi hình dạng của các bó cơ. - Tuy nhiên, phương pháp PCR khuếch đại vùng gen đặc hiệu của Microsporidia được sử dụng đã phát hiện mẫu nhiễm bệnh mặc dù mẫu cơ chưa có dấu hiệu hình thành bào nang.. - Kết quả nghiên cứu của Castillon et al. - (2000) đã sử dụng kỹ thuật PCR để phát hiện 3 loài vi bào tử trùng Glugea anomala, G. - Ngoài ra, realtime PCR và multiplex PCR cũng đạt nhiều kết quả khả thi trong phát hiện các loài vi bào tử trùng Microsporidia thuộc giống Thelohania, Enterocytozoon và Encephalitzoon từ các mẫu tươi hoặc mẫu đã qua xử lý formol (Dowd et al., 1998. - Để xác định chính xác thành phần giống loài vi bào tử trùng ký sinh trong bào nang gạo của cá tra, từ kết quả điện di đề tài chọn 5 mẫu đã khuếch đại PCR thể hiện vạch tương đối rõ ràng ở 1100 bp (Giếng để giải trình tự sản phẩm PCR. - Kết quả nhận được cho thấy đoạn gen này của vi bào tử trùng Microsporidia phân lập từ cá bệnh gạo có độ tương đồng base) so với trình tự gen của giống Kabatana, với số đăng ký trên ngân. - Tuy nhiên, theo kết quả so sánh có thể nhận thấy vi bào tử trùng Microsporidia phân lập từ cá bệnh gạo là Kabatana sp.. - Cường độ nhiễm ở cá hương dao động từ 2-14 bào nang/cá, ở cá giống từ 1-160 bào nang/cá và cá thịt từ 1-83 bào nang/cá. - Mô học: Vùng cơ của cá tra nhiễm bào nang gạo bị mất cấu trúc và hoại tử, các tế bào mô bị vi bào tử trùng Mirosporidia ly giải hoàn toàn. - Một số vùng cơ xuất hiện bào nang tiên khởi.. - Quan sát đặc điểm hình thái kết hợp với so sánh trình tự gen từ sản phẩm PCR có kích thước là 1100 bp đã xác định vi bào tử Kabatana sp. - Xác định nhóm ký sinh trùng tạo bào nang trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus)