- VŨ THỊ BÍCH NGỌC. - Vũ Thị Bích Ngọc. - Vũ Thị Bích Ngọc iii Cao học K20. - Xác định hoạt tính thủy phân fibrin. - Xác định các yếu tố ảnh hƣởng lên hoạt tính và độ bền của enzyme. - Vũ Thị Bích Ngọc iv Cao học K20. - Biểu hiện P. - Tối ƣu môi trƣờng biểu hiện. - Tối ƣu thời gian biểu hiện. - Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên hoạt tính và độ bền enzyme rLK. - Ảnh hƣởng của pH lên hoạt tính và độ bền enzyme rLK. - Hoạt tính thủy phân fibrin và casein của một số protease. - Hoạt tính rLK ở các môi trƣờng biểu hiện khác nhau. - Đĩa thử hoạt tính thủy phân fibrin của dịch nổi thu từ các dòng P. - Vũ Thị Bích Ngọc vii Cao học K20. - Tối ƣu thời gian biểu hiện rLK. - Ảnh hƣởng nhiệt độ đến hoạt tính enzyme rLK. - Ảnh hƣởng của pH lên hoạt tính enzyme rLK. - Vũ Thị Bích Ngọc viii Cao học K20. - Vũ Thị Bích Ngọc ix Cao học K20. - Vũ Thị Bích Ngọc 1 Cao học K20 MỞ ĐẦU. - Sử dụng công nghệ gen và công nghệ protein để biểu hiện và tinh sạch đƣợc enzyme lumbrokinase có hoạt tính thủy phân fibrin.. - Vũ Thị Bích Ngọc 3 Cao học K20 CHƢƠNG 1. - Vũ Thị Bích Ngọc 9 Cao học K20 1.2. - Có thể nói, việc nghiên cứu phát hiện các enzyme có hoạt tính thủy ph n fibrin cao là một trong nh ng vấn đề hiện nay rất đƣợc quan t m. - Vũ Thị Bích Ngọc 10 Cao học K20 Năm 1996, Kim và cs đã tinh sạch đƣợc một enzyme có hoạt tính thủy ph n fibrin mạnh từ Bacillus sp. - acutus có hoạt tính g y xuất huyết [63].. - Ngƣời ta thƣờng nhận ra chúng nhờ vào hoạt tính thủy ph n fibrin mạnh (đƣợc so sánh với hoạt tính của plasmin). - Do thuộc nhóm protease nên hầu hết các enzyme thủy ph n fibrin đã đƣợc nghiên cứu đều có hoạt tính thủy ph n casein. - tìm một enzyme có hoạt tính thủy ph n fibrin mạnh có thể làm thuốc ch a tắc nghẽn mạch máu. - Rõ ràng, không phải enzyme có hoạt tính thủy ph n fibrin nào cũng có thể đáp ứng đƣợc yêu cầu ấy. - Loại protease Hoạt tính thủy. - Hoạt tính thủy phân fibrin (U). - rubellus có hoạt tính thủy ph n fibrin bằng phƣơng pháp tủa muối ammonium sulfate và sắc k cột. - Vũ Thị Bích Ngọc 15 Cao học K20 Hình 1.5. - Vũ Thị Bích Ngọc 16 Cao học K20 đƣợc các loài giun đất có hoạt tính thủy ph n fibrin cao và bƣớc đầu tìm cách nh n dòng trình tự gen mã hóa LK từ loài giun quế Perionyx excavatus.. - L Thị Bích Thủy và cs đã tinh sạch enzyme có hoạt tính thủy ph n fibrin từ P. - excavatus và tách chiết đƣợc 8 ph n đoạn có hoạt tính thủy ph n fibrin cao [6. - và biểu hiện trong E. - EFE-3 tái tổ hợp đã đƣợc biểu hiện trong E. - Hai sản phẩm tái tổ hợp này đều ở dƣới dạng thể vùi và protease đƣợc tiết ra có hoạt tính thủy ph n fibrin. - Lumbrokinase tái tổ hợp có hoạt tính cao khi biểu hiện ở E. - Bằng phƣơng pháp SDS- PAGE và Western blot, kết quả đã chỉ ra rằng PI239 tái tổ hợp đã tiết vào dịch nuôi cấy và có hoạt tính thủy ph n fibrin [25]. - Sau khi cảm ứng, hoạt tính thủy ph n fibrin của dịch nổi đã đƣợc xác định bằng đĩa fibrin. - Nh ng dòng có hoạt tính thủy ph n fibrin cao (100 U/ml) đã đƣợc thu nhận [68].. - Mức độ biểu hiện cao của LK-3 trong nấm men đã đƣợc thể hiện ở các giai đoạn cảm ứng khác nhau và thể hiện hoạt tính thủy ph n fibrin của LK-3 tái tổ hợp [67].. - Lumbrokinase tái tổ hợp rPI239 đã thể hiện hoạt tính ở mô hình in vitro. - Hoạt tính in vivo rPI239 đã đƣợc xác định bằng phản ứng thủy ph n fibrin. - pastoris và protein tái tổ hợp này có hoạt tính thủy ph n fibrin ở cả hai mô hình in vivo và in vitro [24].. - Vũ Thị Bích Ngọc 19 Cao học K20 1.4. - Protein tái tổ hợp đƣợc biểu hiện trong E. - pastoris làm hệ vật chủ để biểu hiện protein ngoại bào, thuận tiện hơn trong quá trình tinh sạch dạng có hoạt tính.. - Vũ Thị Bích Ngọc 20 Cao học K20 P. - Vũ Thị Bích Ngọc 21 Cao học K20 Hình 1.6. - Các vector biểu hiện trong P. - Vũ Thị Bích Ngọc 23 Cao học K20 Hình 1.7. - Nếu sử dụng chủng biểu hiện P. - pastoris X33 (Invitrogen, Mỹ) đƣợc sử dụng để biểu hiện.. - Vũ Thị Bích Ngọc 25 Cao học K20 2.1.3. - Vũ Thị Bích Ngọc 26 Cao học K20. - Nuôi biểu hiện: Chủng P. - Mật độ tế bào và hoạt tính enzyme đƣợc xác định tại các thời điểm khảo sát khác nhau.. - pastoris tái tổ hợp đƣợc nuôi biểu hiện trong 6 môi trƣờng khác nhau (BMMY, MMY, MM, YPM, YPTM, YPTCM). - Các mẫu nuôi biểu hiện đƣợc thu để xác định mật độ tế bào và hoạt tính rLK.. - Dịch nuôi biểu hiện đƣợc thu để xác định mật độ tế bào và hoạt tính.. - Cơ chất dùng để xác định hoạt tính enzyme trong quá trình nghiên cứu là fibrin. - Vũ Thị Bích Ngọc 31 Cao học K20 2.2.5. - Hoạt tính enzyme đƣợc xác định theo phƣơng pháp đĩa fibrin của Astrup và Mullertz, sử dụng plasmin (yếu tố thủy phân fibrin có sẵn trong cơ thể ngƣời) làm chuẩn [9].. - Hoạt tính thủy phân fibrin của rLK đƣợc xác định dựa trên đƣờng chuẩn plasmin.. - Vũ Thị Bích Ngọc 32 Cao học K20 Hình 2.1. - Hoạt tính còn lại của enzyme đƣợc xác định. - Vũ Thị Bích Ngọc 34 Cao học K20 2.2.8. - Vũ Thị Bích Ngọc 35 Cao học K20 2.2.9. - Vũ Thị Bích Ngọc 46 Cao học K20 3.1.2. - Vũ Thị Bích Ngọc 48 Cao học K20 Hình 3.5. - Vũ Thị Bích Ngọc 49 Cao học K20 Nhƣ vậy, đã thiết kế thành công vector biểu hiện pPLK. - Vũ Thị Bích Ngọc 50 Cao học K20 đúng với kích thƣớc vector biểu hiện pPLK theo tính toán lý thuyết. - Vũ Thị Bích Ngọc 53 Cao học K20 Hình 3.9. - Hoạt tính rLK (U/mg). - Kiểm tra hoạt tính thủy phân fibrin cho thấy môi trƣờng YPTCM thích hợp nhất cho biểu hiện rLK (đạt 0,767 U/ml) (Bảng 3.1).. - Hoạt tính còn lại 81% ở 2%. - Ảnh hƣởng của nồng độ MeOH cảm ứng lên mức độ biểu hiện rLK (A) Hoạt tính rLK. - Vũ Thị Bích Ngọc 56 Cao học K20 3.2.6. - Dịch nuôi biểu hiện theo giờ đƣợc xác định sinh khối theo mật độ quang học tại bƣớc sóng 600 nm và xác định hoạt tính thủy ph n fibrin.. - Tối ƣu thời gian biểu hiện rLK (A) Hoạt tính rLK. - Hoạt tính enzyme đạt cao nhất ở 37- 40 o C (100. - Khi nhiệt độ tăng quá giới hạn, hoạt tính enzyme giảm. - Hu và cs (2005) cho biết hoạt tính enzyme rLK biểu hiện ở P. - Hoạt tính đƣợc xác định theo cùng một phƣơng pháp nhƣ trên.. - Vũ Thị Bích Ngọc 62 Cao học K20 nhiệt độ phòng trong 30 phút, nhỏ dịch lên đĩa fibrin, ủ 37 o C trong 5 giờ và xác định hoạt tính còn lại. - Đo diện tích vòng phản ứng và xác định hoạt tính còn lại.. - Biểu hiện thành công protein tái tổ hợp rLK có hoạt tính thủy ph n fibrin đạt 2,47 U/mg. - Vũ Thị Bích Ngọc i Cao học K20 PHỤ LỤC. - Hoạt tính tƣơng đối. - Hoạt tính LK (UI/ml) Hoạt tính riêng (UI/mg) Hoạt tính tƣơng đối. - Vũ Thị Bích Ngọc ii Cao học K20. - pH Hoạt tính LK (UI/ml) Hoạt tính riêng (UI/mg) Hoạt tính tƣơng đối. - Vũ Thị Bích Ngọc v Cao học K20 Hình P1. - Vũ Thị Bích Ngọc vi Cao học K20. - Vũ Thị Bích Ngọc x Cao học K20. - Vũ Thị Bích Ngọc xi Cao học K20