- Phát hiện đột biến gen ty thể A1555G gây bệnh điếc cảm ứng bởi Aminoglycoside ở một bệnh nhân người Việt Nam. - Tóm tắt: Đột biến gen ty thể A1555G là nguyên nhân của hội chứng điếc cảm ứng bởi kháng sinh nhóm aminoglycoside. - Trong nghiên cứu này, bằng phương pháp PCR-RFLP, 173 mẫu bệnh phẩm bị nghi ngờ mắc bệnh ty thể được kiểm tra sự có mặt của đột biến A1555G. - Đoạn gen 282 (từ vị trí 1301 đến 1582 trong hệ gen ty thể) được nhân lên bằng PCR và sau đó được cắt bằng HaeIII, phổ băng PCR-RFLP của người bình thường có 2 băng DNA 164 bp và 118 bp trong khi bệnh nhân có băng 164 bp, 91 bp và 27 bp. - Kết quả chúng tôi phát hiện 1 trường hợp mang đột biến A1555G ở dạng đồng nhất. - Đột biến này cũng xuất hiện ở mẹ và em trai bệnh nhân nhưng không thấy ở bố bệnh nhân. - Đồng thời đột biến A1438G cũng được tìm thấy trong khi giải trình tự đoạn gen mang đột biến A1555G. - Tuy bệnh nhân mang đồng thời cả hai đột biến A1555G và A1438G nhưng chưa phát hiện được mối liên hệ tin cậy nào giữa hai đột biến này.. - Từ khóa: DNA ty thể, đột biến A1555G, đột biến A1438G, Hội chứng điếc cảm ứng bởi aminoglycoside, RFLP-PCR.. - Ty thể là bào quan sản xuất năng lượng cho tế bào bằng cách oxy hóa các hợp chất hữu cơ thành H 2 O, CO 2 và năng lượng dưới dạng ATP.. - Hệ gen ty thể có kích thước 16.569 bp gồm 37 gen. - mã hóa cho 13 loại protein, 2 loại rRNA và 22 tRNA khác nhau liên quan đến hoạt động và chức năng của ty thể [1]. - bào thì ADN của ty thể dễ bị tổn thương do môi trường trong ty thể giàu oxy phản ứng và do thiếu cơ chế sửa chữa hiệu quả. - Hơn 250 đột biến khác nhau trong hệ gen ty thể đã được xác định kể từ khi đột biến đầu tiên được phát hiện vào năm 1988 [2]. - Nghiên cứu các đột biến gen ty thể cho phép phát hiện ra nguyên nhân của nhiều loại bệnh khác nhau.. - Đột biến thay thế nucleotide A thành G tại vị trí 1555 trên gen mã hóa cho rRNA 12S là nguyên nhân chính gây mất thính giác khi có. - Nhiều nghiên cứu cho rằng đột biến A1555G có thể tạo ra cặp base mới C-G khiến cấu trúc bậc 2 của gen 12S rRNA ty thể người giống với vùng tương ứng ở gen 16S rRNA của E. - Khi sử dụng các kháng sinh thuộc nhóm aminoglycoside, kháng sinh này sẽ bám vào 12S rRNA ty thể (dạng đột biến A1555G) ở tế bào lông ốc tai, làm cho việc dịch mã (tổng hợp) phức hệ I (chiếm 56% protein ty thể) bị ảnh hưởng, dẫn đến tích lũy nhiều gốc superoxide gây chết tế bào tai trong và hậu quả là làm mất thính giác [4, 5]. - Đột biến A1555G thường ở dạng đồng nhất (homoplasmy) nhưng biểu hiện triệu chứng bệnh của các thành viên trong gia đình là rất khác nhau. - Mục đích của nghiên cứu này điều tra sự có mặt của đột biến A1555G ở các bệnh nhân nghi bị bệnh ty thể, góp phần đưa ra liệu pháp phù hợp cho người bệnh.. - 173 mẫu bệnh phẩm nghi bị bệnh ty thể với các biểu hiện bệnh lý ở nhiều cơ quan khác nhau, đặc biệt là thần kinh và cơ, thường có hàm lượng lactate máu hoặc dịch não tủy cao hơn giới hạn bình thường (trên 2,2 mmol/L).. - Các mẫu nghiên cứu được lấy theo các quy. - Phát hiện sự có mặt của đột biến A1555G trên hệ gen ty thể được thực hiện theo các điều kiện do Trương và tập thể thiết lập [8]. - Cụ thể, đoạn gen 1301-1582 (282 bp) được nhân bản bằng phản ứng chuỗi polymerase (PCR) với cặp mồi đặc hiệu có trình tự DAGFw: 5’ GCG CAA GTA CCC ACG TAA AGA C 3’ (1301-1322) và DAGRv:. - Mồi DAGFw được thiết kế dựa trên trình tự hệ gen chuẩn [1]. - Mồi DAGRv chứa 1 nucleotide không ghép cặp (T được thay bằng G) tạo điểm cắt cho HaeIII khi có đột biến. - Sản phẩm PCR được cắt bằng enzyme giới hạn HaeIII ủ ở 37 o C trong 10-12 giờ, sản phẩm cắt được điện di trên gel polyacylamide 12%. - Plasmid được tách chiết, kiểm tra bằng enzyme giới hạn và giải trình tự bởi Công ty 1st Base (Singapore) và được dùng làm đối chứng dương trong quy trình PCR-RFLP.. - Phát hiện đột biến A1555G bằng PCR-RFLP. - Đầu tiên chúng tôi nhân bản đoạn gen 1301- 1582 có kích thước 282 bp chứa vị trí đột biến từ hệ gen của các bệnh nhân nghi bị bệnh ty thể bằng cặp mồi đặc hiệu DAGFw/ DAGRv.. - Điện di sản phẩm nhân bản đoạn gen 1301- 1582.1: Thang chuẩn ADN, 2: Đối chứng âm (không. - có ADN khuôn), 3-8: Sản phẩm PCR các mẫu bệnh phẩm. - Kết quả thu được (hình 1) cho thấy sản phẩm PCR có một băng nhân bản ở vị trí phù hợp với kích thước băng theo tính toán lý thuyết là 282 bp (đường chạy 3-8), chứng tỏ chúng tôi đã nhân bản thành công đoạn gen 1301-1582.. - Để phát hiện đột biến A1555G, sản phẩm PCR được cắt bằng enzyme giới hạn HaeIII và chạy điện di trên gel polyacylamide 12%. - Theo cách thiết kế thí nghiệm thì đoạn ADN không đột biến sẽ bị cắt làm 2 băng có kích thước là 164 bp và 118 bp. - Đoạn ADN bị đột biến sẽ cắt thành 3 băng là 164 bp, 91 bp và 27 bp (băng 118 bp bị cắt thành 91 bp và 27 bp).. - Điện di sản phẩm cắt đoạn gen 1301-1582 bằng HaeIII. - 1: Thang chuẩn ADN, 2: Sản phẩm PCR không cắt bằng HaeIII. - 4-6: Sản phẩm PCR từ. - DNA bệnh nhân và được cắt HaeIII. - Kết quả điện di cho thấy các mẫu ở đường chạy 4-6 đều bị cắt làm 2 băng là 164 bp và 118 bp chứng tỏ các mẫu này không mang đột biến A1555G. - theo tính toán lý thuyết thì mẫu bệnh phẩm này có thể mang đột biến A1555G và đột biến này tồn tại ở dạng đồng nhất. - Trong tổng số 173 mẫu bệnh phẩm, chúng tôi chỉ phát hiện một trường hợp có sai khác với các mẫu còn lại (hình 2, đường chạy 3). - Đây là mẫu của một bệnh nhân nhi nữ 11 tuổi (BN 164, mã số 140226).. - Phân tích phổ băng PCR-RFLP của các thành viên gia đình bệnh nhân. - Để đi sâu nghiên cứu về khả năng có mặt của đột biến A1555G, chúng tôi đã phân tích phổ băng PCR-RFLP của các thành viên trong gia đình bệnh nhân (được kí hiệu gia đình 164).. - Kết quả thu được (hình 3) cho thấy ADN khuôn của bố bệnh nhân khi cắt bằng HeaIII cho hai băng là 164 bp và 118 bp giống như mẫu không mang đột biến. - Trong khi mẫu ADN của bệnh nhân, mẹ bệnh nhân và em trai bệnh nhân đều bị cắt thành ba băng 164 bp, 91 bp, 27 bp, chứng tỏ mẹ và em trai bệnh nhân có mang đột biến. - theo dòng mẹ của đột biến gen ty thể đồng thời cũng khẳng định được tính đồng nhất số bản sao trong tế bào của đột biến A1555G.. - Điện di sản phẩm PCR được cắt bằng HaeIII đoạn gen 1301-1582 của gia đình bệnh nhân 164.. - 2: Đối chứng không mang đột biến. - 3: Đối chứng dương mang đột biến. - băng PCR-RFLP tương ứng của bệnh nhân, em trai bệnh nhân, mẹ bệnh nhân và bố bệnh nhân. - Phân tích trình tự nucleotide của đoạn gen nhân b ả n nghi ch ứ a độ t bi ế n. - Để khẳng định chắc chắn sự tồn tại của đột biến A1555G, chúng tôi tiến hành nhân dòng sản phẩm PCR vào vector pJET 1.2, biến nạp vào tế bào khả biến DH5α. - Plasmid tái tổ hợp được tách chiết và kiểm tra bằng HeaIII trước khi đọc trình tự (kết quả không nêu ở đây). - Kết quả giải trình tự được so sánh với trình tự đoạn gen tương ứng trên ngân hàng thế giới với mã số J01415.2 bằng phần mềm Clustal.. - So sánh trình tự nucleotide đoạn gen 1301-1582 của gen ty thể bệnh nhân 164 với trình tự gen chuẩn (J01415.2) trên GenBank.. - Kết quả so sánh đoạn gen quan tâm với trình tự gen chuẩn J01415.2 trên GenBank (hình 4) cho thấy đoạn gen nghiên cứu từ bệnh nhân có 3 vị trí sai khác với trình tự gen chuẩn, trong đó vị trí 1557 có sự thay đổi A thành C. - Kết quả này. - lần nữa khẳng định việc phát hiện bệnh nhân có mang đột biến A1555G bằng PCR-RFLP là chính xác. - Ngoài ra trình tự đoạn gen cho thấy bệnh nhân đồng thời mang đột biến A1438G có liên quan đến hội chứng tiểu đường type 2 [9].. - Qua điều tra sự có mặt của đột biến A1555G bằng PCR-RFLP cho thấy trong số 173 bệnh nhân nghi bị bệnh ty thể chúng tôi phát hiện 1 mẫu bệnh phẩm có mang đột biến A1555G, chiếm tỷ lệ 0,58%. - Trước đó, Trương Thị Huệ và tập thể [8] đã sàng lọc đột biến A1555G trên 106 mẫu bệnh nhân thần kinh cơ nhưng không phát hiện được bênh nhân nào mang đột biến A1555G. - Khi điều tra tỷ lệ đột biến này ở các bệnh nhân mất khả năng nghe với độ ồn lớn hơn 90 dB cho thấy tỷ lệ mang đột biến ở người Đức là 0,7%, người Ba Lan là 2,4%, người Hunggary là 1,8% [10], tỷ lệ mang đột biến này ở bệnh nhân mất khả năng nghe không triệu chứng ở người Italy là 5,4% [11], ở người dân tỉnh Otago, New Zealand là 0,48%. - Chúng tôi chưa có điều kiện để điều tra sự có mặt của đột biến A1555G trên đối tượng bệnh nhân điếc không triệu chứng, và đây cũng là lý do vì sao tỷ lệ đột biến phát hiện được trong nghiên cứu của chúng tôi là rất thấp.. - Trong nghiên cứu này, bệnh nhân mang đột biến A1555G là một cháu gái 11 tuổi, không bị điếc, trẻ bị teo và yếu cơ gốc chi cả hai bên, có nghiệm pháp Gowers dương tính nhưng không có phì đại hai bắp chân, hàm lượng acid lactic cao hơn 4 lần mức bình thường. - Ngoài ra, khi tìm hiểu về gia đình được biết, các thành viên của gia đình (bố, mẹ và em trai) không ai bị điếc, duy chỉ có em gái của mẹ bệnh nhân bị điếc nhẹ, co giật và mất ở tuổi 19. - Bệnh nhân 164, như đã nêu ở trên, đồng thời mang đột biến A1438G. - Tuy vậy, trong khuôn khổ của nghiên cứu này chúng tôi chưa phát hiện được sự liên quan giữa hai đột biến A1555G và A1438G.. - Kết quả phát hiện đột biến giúp giải thích một phần nguyên nhân gây bệnh và đồng thời có thể góp phần tư vấn những người mang đột biến A1555G trong việc tránh sử dụng nhóm kháng sinh aminoglycoside.. - Sử dụng phương pháp PCR-RFLP kết hợp giải trình tự nucleotide chúng tôi đã phát hiện 1/173 bệnh nhân thần kinh cơ mang đột biến A1555G ở dạng đồng nhất. - Đột biến A1555G được di truyền từ mẹ sang con. - Bệnh nhân cũng được phát hiện đồng thời mang đột biến A1438G, tuy vậy chúng tôi chưa phát hiện được có mối liên hệ nào giữa hai đột biến này.