- THĂM DÒ KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI ĐỘC TỐ CỦA MỘT SỐ CHỦNG MICROCYSTIS BẰNG VI KHUẨN SPHINGOMONAS PHÂN LẬP Ở HỒ HOÀN KIẾM, HÀ NỘI. - Hồ Hoàn Kiếm là môi trường sống của các loài vi tảo quý hiếm với tính đặc hữu và cũng đa dạng về thành phần loài. - Trong số các chi vi khuẩn lam độc hại, Microcystis chiếm mật độ cao nhất (khoảng 80% tổng số vi khuẩn lam gây nở hoa nước). - Chúng sản xuất độc tố microcystin có tác dụng gây hại trên cả động vật và thực vật trong vùng nước. - Chính vì vậy việc nghiên cứu về vi khuẩn lam Microcystis độc hại trong hồ Hoàn Kiếm, Hà Nội và tìm phương pháp hiệu quả để giảm thiểu tác động tiêu cực của chúng là rất cần thiết. - Trong báo cáo này, chúng tôi chúng tôi trình bày kết quả phân lập, tuyển chọn, xác định vị trí phân loại và khả năng phân giải microcystin của vi khuẩn Sphingomonas từ hồ Hoàn Kiếm, làm cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo. - Trên cơ sở giải trình tự rDNA16S, vi khuẩn này được xác định là Sphingomonas asaccharolytica N7. - Phân tích HPLC cho thấy hàm lượng độc tố MC-RR của Microcystis LT2 và LT8 lần lượt 474,3 và 512,8 ng/mg trọng lượng khô là cao nhất. - hàm lượng độc tố của MC-YR là 132,6 và 236,8 ng/mg trọng lượng khô và thấp nhất 114,1 và 114,25ng/mg trọng lượng khô của MC-LR.. - Kết quả cho thấy Sphingomonas asaccharolytica N7 có hoạt tính phân giải microcystin ở mức tương đối tốt. - Thời gian bán phân giải đối với nồng độ microcystin 10μg/l của chủng Sphingomonas N7 là 3,4 giờ.. - Nhiệt độ thích hợp cho phân giải độc tố microcystin ở 30°C và sự phân giải độc tố kết thúc sau 6 ngày.. - Chất lượng nước thay đổi dẫn tới sự phát triển thường xuyên và không bình thường của vi khuẩn lam, làm biến đổi cấu trúc thành phần loài của hệ vi tảo trong hồ. - Sự suy giảm một số loài vi tảo đặc hữu đồng thời với sự gia tăng thành phần loài và mật độ của vi khuẩn lam gây độc ở hồ Hoàn Kiếm đã được cảnh báo và gây nên những lo ngại về môi trường cho khu hệ động, thực vật sống trong hồ [1, 2].. - Trong số các loài vi khuẩn lam gây nở hoa nước hồ, Microcystis aeruginosa là loài bị bắt gặp thường xuyên và phổ biến nhất M.aeruginosa chứa độc tố thuộc nhóm hepatotoxin (độc tố gan) cấu tạo từ các peptid mạch vòng có tên gọi là microcystin (MC) [3]. - Độc tố cũng gây ảnh hưởng xấu lên hai loại protein serine và threonine phosphatase. - Đã có một số bài báo chứng minh hiện tượng nở hoa của vi khuẩn lam gây hại tới sinh vật thủy sinh, động vật và con người [4]. - Đã có không ít các công trình nghiên cứu hiện tượng nở hoa nước và giảm thiểu tác hại của độc tố vi khuẩn lam gây độc, tuy nhiên kết quả vẫn còn ở các mức độ khác nhau.. - ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tƣợng nghiên cứu bao gồm. - Vi khuẩn lam Microcystis LT2 và LT8 được phân lập từ hồ Hoàn Kiếm Vi khuẩn Sphingomonas được phân lập từ hồ Hoàn Kiếm. - Phƣơng pháp tách chiết độc tố microcystin từ tế bào vi khuẩn lam Microcystis. - Trong thí nghiệm của chúng tôi, microcystin được tách chiết từ vi khuẩn lam Microcystis theo phương pháp đông tan (Lee et al.,2000). - Sinh khối thu được đông khô ở nhiệt độ – 83 o C, chiết rút độc tố bằng methanol : nước cất (80:20) và bằng methanol : n-hexane (85:15). - Dịch chiết được chạy qua sắc ký bản mỏng (TLC) để làm sạch độc tố, cạo phần độc tố trên bản TLC. - Thành phần và nồng độ của dịch chiết được xác định bằng máy HPLC (Hewlett Packard model 1100 LC) qua cột ODS II (4,6mm. - Phƣơng pháp xác định khả năng phân giải microcystin. - Sự phân giải được bắt đầu bằng cách bổ sung dịch chiết microcystin thô vào các mẫu nước vô trùng để thu được các nồng độ microcystin khác nhau. - Các chủng vi khuẩn phân giải vi khuẩn lam được đưa vào với mật độ 2.5 × 10 6 tế bào/ml. - Sau 20 phút kiểm tra mẫu một lần bằng cách lấy 50ml dịch đem lọc qua màng lọc kích thước 0,2µm, sau đó đem đo ở bước sóng 242nm để xác định nồng độ độc tố còn lại. - Hiệu quả phân giải microcystin được xác đinh nhờ phương pháp bán thời gian như mô tả của Kenefick (Kenefick et al.,1993):. - Trong đó: C t – nồng độ microcystin tại thời điểm đo (µg/ml) C o – nồng độ microcystin trước phân giải (µg/ml) k – hằng số phân giải bậc đầu tiên (ngày -1 ) t – thời gian bán phân giải (ngày). - KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU. - Kết quả phân tích sắc ký đồ của dịch chiết trên HPLC (bảng 1) cho thấy biểu hiện đặc trưng độc tố từ mẫu vi khuẩn lam, microcystin được thăm dò với nhiều giới hạn. - Kết quả phân tích cho thấy cả 2 chủng LT2 và LT8 tế bào đều chứa độc tố với các loại microcystin trong tế bào như MC - LR, -YR và - RR. - Hàm lượng MC-LR trong chủng LT2 là 114,1ng. - Hàm lượng MC-YR trong chủng LT2 là 132,6ng. - Hàm lượng MC - RR trong chủng LT2 là 474,3ng. - Từ kết quả ở bảng 1 cho thấy trong dịch chiết microcystin từ tế bào khô Microcystis, hàm lượng độc tố MC – RR đạt lớn nhất. - Như vậy nồng độ MC - LR trong hai chủng này 1,14µg/L với LT2 và 1,1425µg/L với LT8 đã vượt quá ngưỡng cho phép của WHO, sẽ là nguy cơ đe dọa cho nguồn nước nếu sau khi tế bào phân giải, toàn bộ lượng độc tố nội bào giải phóng vào trong nước.. - Hàm lượng microcystin của 2 chủng LT2 và LT8 Ký hiệu chủng. - Thời gian Vùng xuất hiện cột. - Lượng MC (ng/mg trọng. - Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn. - Do tầm quan trọng và mức độ gây độc của các vi khuẩn lam nở hoa trong các thuỷ vực ngày càng gia tăng nên các nghiên cứu về độ bền vững và phân giải độc tố của chúng trở nên rất cần thiết. - Người ta đã chứng minh rằng microcystin có thể bị phân giải bởi các vi sinh vật có trong hệ sinh thái thuỷ vực tự nhiên (Kenefick et al.,1993). - Các nghiên cứu tập trung vào vấn đề vi khuẩn là cách để giảm thiểu tác hại của vi khuẩn lam và độc tố của chúng.. - Sau đó đem nuôi giữ trong điều kiện nhiệt độ 30 o C dưới ánh sáng đèn neon yếu với cường độ ánh sáng là 1000 lux theo quang chu kỳ là 12 giờ chiếu sáng : 12 giờ tối. - Sau đó đem nuôi cấy lại trong thời gian 24 giờ dưới các điều kiện trên (để kích thích các chủng vi khuẩn thích ứng với sự phân giải tế bào M. - aeruginosa và phân giải độc tố microcystin).. - Nuôi cấy làm giàu chủng vi khuẩn trên môi. - Cấy ria thuần khiết chủng vi khuẩn trên môi trường NA. - Hình 1 và 2 cho thấy sau 24 giờ nuôi cấy làm giàu trên môi trường NA, bắt đầu xuất hiện màu xanh của dịch nuôi cấy. - Điều này cho thấy môi trường NA thích hợp cho việc phân lập và nuôi cấy các chủng vi khuẩn. - Các mẫu tiếp tục được cấy ria trên môi trường thạch NA. - Sau 12 giờ quan sát sự xuất hiện các khuẩn lạc có tiết sắc tố xanh vào trong môi trường (Dvid et al.,1996). - Tách các khuẩn lạc đơn cấy ria trên môi trường thạch nhiều lần cho đến khi tách được chủng thuần khiết. - Trong thí nghiệm này chúng tôi chọn được chủng vi khuẩn có ký hiệu N7 có khả năng sinh trưởng tốt chỉ sau 12 giờ đã tiết sắc tố xanh vào môi trường. - Nuôi giữ giống gốc vi khuẩn trên môi trường thạch nghiêng (môi trường NA) và bảo quản ở nhiệt độ 4 o C, dùng cho các nghiên cứu tiếp theo.. - Xác định và phân tích trình tự rADN 16S chủng N7. - Để có được nhiều hơn nữa thông tin xác định về vị trí phân loại và phát sinh chủng loại của chủng N7, ADN genome của chủng N7 được dùng làm khuôn để khuyếch đại bằng phản ứng PCR.. - Chúng tôi đã xác định trình tự rADN 16S của nó và so sánh với trình tự có sẵn trong Ribosomal Data Project. - Cây phả hệ dựa trên phân tích giải trình tự rADN 16S của chủng N7 với các loài có quan hệ họ hàng gần Khoảng cách tiến hóa được tính toán để thiết lập cơ sở dữ liệu bao gồm trình tự của chủng N7 và 27 trình tự khác của nhóm Sphingomonas phân lớp alpha của Proteobacteria với Rhodospirillum rubrum là outgroup (ngoài nhóm). - Cây phả hệ vẽ theo phương pháp neighbour joining thước đo = 0,02 Knor trong trình tự nucleotid. - Các giá trị hiển thị tại các nhánh cây là kết quả phân tích boostrap với độ lập lại 1000 (với những giá trị >50%. - Khả năng phân giải độc tố microcystin của chủng Sphingomonas N7 Hiệu quả phân giải microcystin của chủng Sphingomonas N7. - Sự phân giải được bắt đầu bằng cách bổ sung dịch chiết microcystin thô vào các mẫu nước vô trùng để thu được nồng độ microcystin tổng số là 10µg/l. - Chủng vi khuẩn Sphingomonas N7 được tuyển chọn dùng để phân giải microcystin cho các thí nghiệm có nồng độ microcystin cao từ 2, 5 và 10 µg/l theo như phương pháp đã trình bày. - Hiệu quả phân giải microcystin được xác định nhờ phương pháp bán thời gian như mô tả của Kenefick. - Kết quả được trình bày ở bảng 2.Khả năng phân giải độc tố của chúng khá nhanh, đặc biệt ở nồng độ độc tố thấp 2µg/l, thời gian bán phân giải microcystin của chủng Sphingomonas N7 tương đối ngắn là 0,092 ngày (2 giờ 12 phút). - Với nồng độ microcystin cao gấp 5 lần (tương ứng 10 µg/l), thời gian bán phân giải chủng Sphingomonas N7 là 0,153 ngày (3 giờ 40 phút). - tích khác nhau của tế bào còn lại không bị tách chiết từ môi trường nuôi cấy vi khuẩn phân giải microcystin.. - Hằng số tốc độ phân giải (K) và thời gian bán phân giải microcystin ở các nồng độ khác nhau. - Chủng vi khuẩn. - Nồng độ microcystin ban đầu. - Hằng số tốc độ theo Kenefick [6] là 0,25/ngày cũng phản ánh sự phân giải chậm hơn. - Các kết quả trên cho phép chúng tôi sơ bộ kết luận chủng vi khuẩn Sphingomonas N7 phân lập từ nước hồ có hoạt tính phân giải độc tố microcystin. - Khả năng phân giải đối với từng loại độc tố microcystin cụ thể sẽ được tiến hành trong các nghiên cứu tiếp theo.. - Xác định điều kiện nhiệt độ thích hợp cho sự phân giải microcystin của chủng Sphingomonas N7 Một trong các yếu tố gây ảnh hưởng nhiều nhất tới tốc độ phân giải độc tố của vi khuẩn Sphingomonas được xác định là nhiệt độ. - Chính vì vậy, trong nghiên cứu này tiến hành các thử nghiệm khả năng phân giải độc tố microcystin bởi vi khuẩn Sphingomonas N7 ở các nhiệt độ là 20, 25, 30°C, dải nhiệt độ này cho phù hợp với điều kiện tự nhiên của hồ. - Nồng độ microcystin trong dịch chiết ban đ ầu dùng là 350 µg/l. - Kết quả được trình bày trong bảng 3. - Tỷ lệ % microcystin không bị phân giải do chủng Sphingomonas N7 ở các nhiệt độ khác nhau Nhiệt độ. - Tỷ lệ % microcystin không bị phân giải sau các khoảng thời gian (ngày). - Kết quả cho thấy tốc độ phân giải microcystin của chủng vi khuẩn Sphingomonas N7 phụ thuộc nhiều vào nhiệt độ. - Tốc độ phân giải có sự khác biệt rõ ràng ở các nhiệt độ từ 20-30 o C. - Trong khoảng nhiệt độ thử nghiệm này, tốc độ phân giải tỷ lệ thuận với sự gia tăng nhiệt độ. - Tại nhiệt độ 20°C tỷ lệ phân giải độc tố của chủng N7 đạt 42% sau 5 ngày. - Tốc độ phân giải lớn nhất đạt được khi tiến hành khảo sát ở 30°C, sau 6 ngày, nồng độ độc tố microcystin còn lại trong dịch chiết nằm dưới ngưỡng phát hiện.. - Sự phân giải microcystin đã bắt đầu trong vòng 1 ngày khi ở nhiệt độ nằm trong khoảng 20 - 30 o C. - Lúc này ngưỡng nhiệt độ dao động trong khoảng 25 - 30 o C, tối thích cho sự phát triển của Microcystis. - Mối quan hệ dinh dưỡng mật thiết giữa Microcystis và Sphingomonas kéo theo hoạt động mạnh mẽ của loại vi khuẩn này vào cùng thời điểm.. - Thí nghiệm này là cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo về điều kiện tuyển chọn và phân lập thêm các chủng vi khuẩn có khả năng phân giải các loại độc tố microcystin.. - Dựa vào kết quả phân tích trên HPLC, hàm lượng độc tố MC – RR của Microcystis LT2 và LT8 đạt lớn nhất tương ứng là 474,3 và 512,8 ng/mg trọng lượng khô, độc tố MC – YR là 132,6 và 236,8ng/mg và thấp nhất là độc tố MC – LR: 114,1 và 114,25ng/mg.. - Dựa trên phân tích trình tự rADN 16S, chủng vi khuẩn N7 được xác định thuộc loài Sphingomonas asaccharolytica. - Sphingomonas N7 có khả năng phân giải nồng độ microcystin 10μg/l với thời gian bán phân giải của là 3,4 giờ. - Nhiệt độ thích hợp cho sự phân giải microcystin. - của chủng vi khuẩn Sphingomonas asaccharolytica N7 là 30°C và sau 6 ngày sự phân giải gần như hoàn toàn là 100%.. - Công trình này được thực hiện với sự hỗ trợ về kinh phí nghiên cứu của Đại học Quốc Gia, Hà Nội (mã số đề tài QG.07.24).. - Đặng Đình Kim, Đặng Hoàng Phước Hiền (2006), Điều tra phát hiện tảo độc tại các thuỷ vực trọng điểm của Hà Nội và một số tỉnh phía Bắc làm cơ sở cho việc xây dựng chỉ tiêu quan trắc sinh học trong giám sát chất lượng nguồn nước, Báo cáo Tổng kết nhiệm vụ khoa học công nghệ phục vụ quản lý nhà nước và bảo vệ môi trường, Viện Công nghệ Môi trường – Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.. - cs (2002), Bảo vệ nguồn gen vi tảo (microalgae) đặc hữu quý hiếm ở hồ Hoàn Kiếm – Hà Nội, Báo cáo khoa học trong chương trình tài trợ bảo vệ môi trường và gìn giữ di sản văn hoá - Công ty Ford Motor.