- PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN LACTIC DÙNG TRONG CHẾ BIẾN VÀ BẢO QUẢN THỨC ĂN THÔ XANH VÀ PHỤ PHẨM NÔNG. - Đào Thị Lƣơng, Nguyễn Thị Anh Đào, Nguyễn Thị Kim Quy, Trần Thị Lệ Quyên, Dƣơng Văn Hợp Viện Vi sinh vật và CNSH-Đại học Quốc Gia Hà Nội Trần Quốc Việt, Ninh Thị Len, Bùi Thị Thu Huyền Viện Chăn nuôi. - Bảo quản thức ăn cho gia súc ở quy mô lớn là vấn đề đang được các nhà chăn nuôi quan tâm. - Bảo quản thức ăn cho gia súc bằng phương pháp ủ chua có bổ sung vi khuẩn lactic dựa vào khả năng ức chế các vi khuẩn gây thối, gây bệnh của axit lactic và kháng sinh bacterioxin do chúng sinh ra là một phương pháp bảo quản được nhiều quốc gia trên thế giới ứng dụng.. - Tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic có hoạt tính sinh học cao nhằm ứng dụng trong bảo quản thức ăn gia súc, giúp cho quá trình lên men hiệu quả hơn. - Phân loại bằng sinh học phân tử kết hợp với các đặc điểm sinh lý sinh hoá của các chủng vi khuẩn sinh axit lactic góp phần quan trọng trong việc lựa chọn ra các chủng có các đặc tính tốt và an toàn về mặt sinh học.. - VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. - Nguồn vi sinh vật. - Các chủng vi khuẩn lactic được phân lập từ 30 mẫu cỏ, ngô, dưa, cà muối chua, nước bún.. - Các vi sinh vật kiểm định: Escherichia coli, Micrococcus luteus, Salmonella typhi, Shigella flexneri được lữu giữ tại Bảo tàng giống Vi sinh vật (VTCC. - Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học- Đại học Quốc gia Hà Nội. - Môi trường nghiên cứu. - Môi trường canh thang nuôi vi sinh vật kiểm định(g/l): Cao thịt - 3,0. - Phƣơng pháp nghiên cứu. - Các phương pháp định tính và định lượng. - Xác định hàm lượng axit lactic bằng sắc ký lỏng cao áp (Bevilacqua và Califano, 1989) 2.2.2. - Phương pháp phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic. - Phân lập: Sử dụng phương pháp pha loãng giới hạn (Nguyễn Lân Dũng và cộng sự, 1972). - Tuyển chọn: Xác định khả năng lên men đồng hình. - Phương pháp phân loại. - Xác định các đặc điểm sinh lý sinh hoá (Kozaki et al., 1992). - Phân loại dựa trên giải trình tự ADNr 16S. - Xác định trình tự ADNr 16S của các chủng vi khuẩn theo phương pháp của Sakiyama và cộng sự (2009). - Sản phẩm PCR được tinh sạch và xác định trình tự trên máy đọc trình tự tự động (ABI PRISM®3100-Avant Genetic Analyzer- Mỹ). - Kết quả đọc trình tự được xử lý trên phần mềm Clustal X của Thompson và cộng sự, 1997. - Các trình tự được so sánh với trình tự ADNr 16S của các loài đã công bố từ dữ liệu của DDBJ, EMBL, GenBank. - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN. - Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic lên men đồng hình. - Phân lập vi khuẩn sinh axit. - Từ 30 nguồn cỏ, ngô, nước dưa cà, nước bún, 134 chủng vi khuẩn đã được phân lập và tinh sạch trên môi trường MRS, sau 2 ngày ở nhiệt độ 30 o C.. - Tuyển chọn các vi khuẩn lactic - Xác định khả năng sinh axit lên men đồng hình của các vi khuẩn phân lập. - Các chủng phân lập được nuôi trên môi trường MRS dịch thể có đặt ống Durham.. - Sau 3 ngày nuôi cấy, trong số 134 chủng phân lập có 131 chủng không sinh khí trong ống Durham là lên men đồng hình.. - Xác định khả năng chịu nhiệt của các vi khuẩn sinh axit. - Các chủng vi khuẩn sử dụng làm giống khởi động phải có khả năng sinh trưởng được ở nhiệt độ cao, vì nhiệt độ thường tăng trong quá trình ủ chua thức ăn, và sinh trưởng được ở nhiệt độ trong dạ cỏ của động vật. - Bảy mươi chủng vi khuẩn sinh axit chịu nhiệt được nuôi trên môi trường MRS dịch thể trong 48 giờ, hàm lượng axit tổng số của dịch nuôi cấy được xác định. - Kết quả cho thấy 18 chủng có khả năng sinh axit cao từ 20-21 mg/ml, 43 chủng sinh axit từ 15-19 mg/ml và 9 chủng còn lại có hàm lượng axit từ 8-14 mg/ml.. - Xác định khả năng sản sinh axit lactic và kháng khuẩn của dịch nuôi vi khuẩn. - Để xác định khả năng sinh axit lactic của 18 chủng có hàm lượng axit cao, dịch nuôi cấy của các chủng này được định lượng axit lactic trên thiết bị sắc ký lỏng cao áp, đồng thời cũng xác định khả năng kháng một số vi khuẩn gây bệnh trên dịch này. - Kết quả thu được cho thấy hàm lượng axit lactic do các chủng sinh ra tương đối đồng đều, trải dài trong khoảng từ 15,3 đến 21 mg/ml dịch nuôi. - Khả năng kháng các vi sinh vật kiểm định của dịch nuôi vi khuẩn cũng rất mạnh.. - Kích thước vòng kháng (D-d) của dịch nuôi các chủng đối với E. - Khả năng sinh bacterioxin của dịch nuôi các chủng nghiên cứu cũng được xác định.. - Dịch nuôi được trung hòa về pH-6 và được kiểm tra khả năng kháng với vi khuẩn kiểm định. - Kết quả chỉ rõ cả 18 chủng đều có khả năng sinh bacterioxin kháng lại các vi khuẩn kiểm định. - Từ các kết quả trên, 8 chủng vi khuẩn (2-9. - 9-17 và L10) có hoạt tính cao và là các chủng đại diện cho các mẫu khác nhau sẽ được kiểm tra một số đặc tính sinh học và tiến hành phân loại.. - Khả năng sinh enzyme được đánh giá qua vòng phân giải cơ chất.. - Khả năng sinh enzyme ngoại bào phân giải cơ chất của dịch nuôi vi khuẩn STT. - Chú thích: D-Đường kính vòng phân giải, d- Đường kính lỗ khoan (5 mm) Kết quả bảng trên cho thấy 7 chủng. - nghiên cứu đều có khả năng sinh các enzym ngoại bào phân giải các cơ chất (trừ chủng L01). - Như vậy, ngoài khả năng sinh axit cao, các chủng nghiên cứu còn có khả năng sinh enzyme ngoại bào phân giải các cơ chất có trong thành phần ủ thức ăn chăn nuôi.. - Xác định khả năng đối kháng giữa các chủng lựa chọn. - Tám chủng nghiên cứu được nuôi trên môi trường MRS bằng phương pháp cấy vạch tiếp xúc giữa các chủng với nhau. - Kết quả này cho thấy 8 chủng không đối kháng nhau và hoàn toàn có thể được sử dụng kết hợp với nhau trong quá trình lên men chế biến thức ăn gia súc.. - Phân loại các chủng đƣợc tuyển chọn 3.2.1. - Xác định trình tự 16S ADNr và xây dựng cây phân loại. - ADN hệ gen của 8 chủng nghiên cứu được tách chiết. - Đoạn gen mã cho ARNr 16S được khuếch đại nhờ phản ứng PCR sử dụng cặp mồi phổ biến 27F và 1525R, sau đó được tinh sạch và dùng làm khuôn trong. - phản ứng đọc trình tự với các mồi xuôi và mồi ngược. - Kết quả đọc trình tự được xử lý bằng phần mềm Clustal X và so sánh với dữ liệu của DDBJ, EMBL, GenBank bằng công cụ Blast Search để xác định đến tên loài.. - Trình tự ADNr 16S của 8 chủng nghiên cứu được xác định. - Cây phả hệ được xây dựng dựa trên trình tự ADNr 16S từ 1400 bp của các chủng nghiên cứu với các loài gần gũi nhất với các loài đó biết thuộc các chi Enterococcus và Lactobacillus. - Pediococcus acidilactici được sử dụng làm nhóm ngoài.. - Quan sát trên cây phả hệ, có 7 chủng nghiên cứu nằm cùng vị trí với các loài của nhóm Lactobacillus plantarum (Lactobacillus pentosus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus paraplantarum);. - So sánh trình tự ADNr 16S của các chủng nghiên cứu với các chủng chuẩn của các loài đã biết cho thấy: 7 chủng 2-9, 2-10, 3-5, 3-10, 4-14, 8-4 và 9-17 có mức tương đồng 99,7-100 % với các loài của nhóm Lactobacillus plantarum;. - Vị trí phân loại của các chủng nghiên cứu với các loài có quan hệ họ hàng gần. - Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hoá của các chủng vi khuẩn. - Qua nghiên cứu các đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hoá của 8 chủng vi khuẩn cho thấy tất cả 08 chủng này đều thuộc nhóm vi khuẩn Gram dương, phản ứng catalaza âm tính, không có khả năng di động, lên men đồng hình, có khả năng đông tụ sữa, sinh trưởng ở pH 4-8,5. - Sáu trong số các chủng nghiên cứu không lên men từ các nguồn glycerol và D-xylose (trừ chủng 2-9 và L01).. - Chưa thể kết luận được 7 chủng nghiên cứu có tế bào hình que thuộc chính xác loài nào nếu chỉ dựa trên trình tự gen 16S rRNA vì chúng có độ tương đồng là 99.7% -100%. - so với các loài thuộc nhóm Lactobacillus plantarum. - Tuy nhiên, theo một số nghiên cứu trước đây, L. - pentosus thường lên men Pediococcus acidilactici_ EF059987. - Lactobacillus plantarum_AJ965482 Lactobacillus pentosus_D79211. - Các chủng 2-10, 3-5, 3-10, 4-14, 8-4, 9-17. - thuộc loài Lactobacillus plantarum. - Các chủng được lựa chọn đều là những chủng vi sinh vật an toàn, không gây bệnh và được sử dụng rất phổ biến trong các chế phẩm probiotic. - Đây là các chủng nằm trong danh sách các loài vi sinh vật được AAFCO (American Feed Control Officials) Mỹ cho phép sử dụng trong chế biến thức ăn.. - Nguyễn Lân Dũng, Đoàn Xuân Mƣợn, Nguyễn Phùng Tiến, Đặng Đức Trạch, Phạm Văn Ty (1976), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, tập 2, Nxb Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội.. - Characterization of lactobacilli by Southern-type hybridization with a Lactobacillus plantarum pyrDFE probe.. - nov., a new species related to Lactobacillus plantarum. - Isolation of a Lactobacillus plantarum strain used for obtaining a product for the preservation of fodders. - strains 2-10, 3-5, 3-10, 4-14, 8-4 and 9-17 belong to Lactobacillus plantarum and strain L01 is considered Enterococcus lactis. - Công trình được sự hỗ trợ kinh phí từ đề tài ”Nghiên cứu sử dụng vi sinh vật trong chế biến, bảo quản để nâng cao tỷ lệ tiêu hóa, hiệu quả sử dụng thức ăn thô xanh, phụ phế phẩm công