- Chuẩn bị dụng cụ nuôi cấy vi sinh vật. - Một số dụng cụ nuôi cấy vi sinh vật: ống nghiệm, bình tam giác, pipet, hộp petri, chai thủy tinh, phiến kính…. - Rửa dụng cụ. - Thủy tinh không trung tính dễ làm biến đổi pH của môi trường hoặc làm sai lệch kết quả của các phản ứng huyết thanh. - nút bông không được quá chặt để khỏi ngă cản sự cung cấp oxygen cho vi sinh vật không quá lỏng dễ bị vi sinh vật bên ngoài xâm nhập vào môi trường bên trong. - Bước 3: khử trùng dụng cụ thí nghiệm. - Các phương pháp khử trùng. - Khử trùng bằng nhiệt. - Khử trùng bằng phương pháp Pasteur. - Cơ sở của phương pháp này là làm nóng vật liệu ở nhiệt độ dưới 1000C nhằm tiêu diệt tất cả các vi sinh vật trong các loại môi trường dễ bị hư hỏng khi đun sôi (như sữa, nước quả,bia, rượu vang. - Khử trùng bằng nồi hấp áp lực - Phương pháp dựa trên nguyên tắc làm nóng môi trường bằng hơi bão hòa ở áp suất cao hơn 1 atm. - Vỏ trong là thùng khử trùng, nơi để các dụng cụ, môi trường cần khử trùng. - Để khử trùng các loại môi trường thông thường chỉ sử dụng áp lực 1 atm trong 20 phút. - Nếu môi trường đựng trong các bình lớn thì nên giữ áp lực 1 atm trong 30 phút. - Khi khử trùng cần lưu ý các chất không bền nhiệt như sữa, cá môi trường chứa gelatin thì chỉ khử trùng ở 0,5 atm trong thời gian 15 phút. - Môi trường chứa nước quả, nước mạch nha, đường, vitamin chỉ được khử trùng ở 0,5 atm trong 20-30 phút. - Môi trường nước chiết đất khử trùng 1,5 atm trong 30 phút. - Khi chọn chế độ khử trùng phải chú ý đến pH của môi trường. - Nếu môi trường kiềm, khi khử trùng sẽ gây kết tủa sắt, caramel hóa đường. - Do vậy khi khử trùng phải để môi trường có pH trung tính. - Sau khi khử trùng xong cần nhanh chóng lấy môi trường ra khỏi nồi hấp và làm nguội nhanh nhằm giảm thiểu tác dụng của nhiệt lên môi trường. - Môi trường sau khi khử trùng được giữ trong tủ ấm 30 trong khoảng 2-3 ngày để kiểm tra độ vô trùng. - Khử trùng không bằng nhiệt • Dùng nến lọc vi khuẩn - Một số chất hữu cơ như huyết thanh, albumin, một số loại đường… trong môi trường dễ bị biến tính khi khử trùng bằng nhiệt độ cao nên phải khử trùng bằng cách lọc qua các dụng cụ lọc vi khuẩn. - Sau khi lọc cần cấy dịch lọc vào môi trường thạch – nước thịt – pepone để kiểm tra mức độ vô trùng của dịch lọc. - Bài 2: CHẾ TẠO MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VI SINH VẬT I. - Giới thiệu về các loại môi trường nuôi cấy vi sinh vật. - Khái niệm môi trường dinh dưỡng Môi trường dinh dưỡng là hỗn hợp các chất dinh dưỡng và các chất này có nhiệm vụ duy trì thể oxy hóa khử, áp suất thẩm thấu của tế bào và sự ổn định của pH trong môi trường, trong đó các chất dnh dưỡng là những hợp chất tham gia vào quá trình trao đổi chất nội bào. - Các yêu cầu đối với môi trường dinh dưỡng. - Phân loại môi trường dinh dưỡng. - có ba loại môi trường là. - Môi trường tự nhiên: có thành phần là các sản phẩm tự nhiên như sữa, trứng, khoai tây, dịch chiết nấm men, đường, cám. - Thành phần hóa học của loại môi trường này được xác định chính xác do tính chất không ổn định của sản phẩm tự nhiên. - Môi trường tổng hợp: là môi trường gồm các chất hóa học mà thành phần của chúng được xác định và định lượng một cách cụ thể và chính xác. - Môi trường bán tổng hợp: là thành phần gồm cả hóa chất lẫn các chất hữu cơ tự nhiên. - Căn cứ vào tính chất lý học: có thể chia môi trường thành ba loại. - Môi trường lỏng (dịch thể): thành phần môi trường này không chứa thạch và thường được dùng để nghiên cứu quá trình sinh tổng hợp của vi sinh vật. - Môi trường bán lỏng: môi trường này chứa agar Môi trường đặc: trong thành phần môi trường này chứa 1.5-2% agar hoặc 10-20% gelatin và dùng để nghiên cứu các chất đặc điểm hình thái, sinh lí của vi sinh vật. - Môi trường xốp: được ứng dụng trong vi sinh vật học công nghiệp, gồm các loại môi trường như bột cám, bã mía, bột ngô… Căn cứ vào công dụng có thể có các loại môi trường sau đây: môi trường cơ bản, môi trường chọn lọc, môi trường tăng sinh, môi trường chẩn đoán phân biệt… II. - Nguyên liệu, hóa chất: các loại hóa chất cần thiết để chế tạo môi trường nuôi cấy vi sinh vật, hộp giấy pH, vải lọc, bông, dung dịch acid hoặc kiềm để điều chỉnh pH. - Chế tạo môi trường. - Một số môi trường thông dụng. - Môi trường nuôi cấy vi khuẩn - Môi trường nuôi cấy nấm men - Môi trường nuôi cấy nấm mốc - Môi trường nuôi cấy xạ khuẩn. - Môi trường Martin (môi trường nuôi nấm mốc) Glucose 10g Peptone 5g KH2PO4 1g MgSO4.7H2O 0.5g Agar 20g Rose bengal 1/300 10ml Nước 900ml pH 5.5 – 6.0 Sau khi khử trùng, để nguội môi trường xuống khoảng 450C bổ sung 3ml streptomycine 1%. - Môi trường này thường sử dụng để phân lập nấm men và nấm mốc. - Môi trường Hansen (môi trường nuôi cấy nấm men) Glucose 5g Peptone 5g KH2PO4 1.5g MgSO4.7H2O 2g Agar 10g Nước 500ml pH 6.0 - Phân lập nấm men trên môi trường Hansen với nồng độ 10-5 kết quả: 1 góc các tế bào nấm men mọc lan, màu trắng sữa do nồng độ ban đầu quá cao và thao tác trải trên bề mặt không đều 1 phần xuất hiện các khuẩn lạc riêng lẽ. - Môi trường Gause I (môi trường nuôi cấy xạ khuẩn) Tinh bột tan 20g KNO3 1g K2HPO4 0.5g MgSO4.7H2O 0.5g Agar 20g NaCl 0.5 g Nước 500 ml pH 7.2–7.4 FeSO4 0.01g Cân đong chính xác với thành phần môi trường Gause. - Với môi trường lỏng thì cân đong chính xác cho hoàn tan. - Với môi trường đặc thì nấu agar cho đến khi hòa tan hết, sau đó mới đổ các hóa chất đã được hòa tan vào. - Lọc Môi trường nuôi cấy cần phải trong để dễ quan sát và theo dõi sự sinh trưởng phát triern của vi sinh vật. - Những môi trường đục có thể lọc qua vải thưa nhiều lớp, bông, giấy lọc hoặc có thể dùng long trắng trứng gà hoặc chất trợ lắng để làm trong môi trường. - Với những môi trường không đục thì bỏ qua bước này. - Điều chỉnh pH môi trường. - Điều chỉnh pH môi trường bằng cách dùng các dung dịch như HCl, H2SO4, H3PO4, NaOH nồng độ 10% hoặc 0,1N. - Phân phối môi trường vào các dụng cụ. - Khử trùng môi trường Dùng phương pháp khử trùng ướt hoặc phương pháp lọc vô trùng. - Thạch đứng: đặt các ống nghiệm có chứa môi trường đặc vào giá, để yên cho môi trường nguội và đông đặc. - Các thao tác: mở bao giấy, tay trái kẹp nút bông của bình rút nhẹ và mở hé nắp trên của đĩa petri, tay phải cầm bình chắc môi trường, rót nhanh vào đĩa một lượng môi trường thích hợp. - Đậy nắp hộp, để yên cho môi trường nguôi và đông đặc rôi lạt ngưỡng đĩa lại. - Khi đĩa môi trường bay hết hơi nước ngưng tụ, bao gói, ghi nhãn và bảo quản. - Sau khi đổ môi trường 1-2 ngày thì kiểm tra xem môi trường có bị nhiễm hay không rồi mới sử dụng. - Bảo quản và kiểm tra môi trường. - Môi trường thạch nếu chưa sử dụng thì bảo quản lạnh (1-50C), hạn chế tác dụng của anh sáng và không cho môi trường bị khô. - Tiến hành việc phân giống các vi sinh vật một cách nhanh chóng. - Bảo tồn các giống vi sinh vật thuần khiết - Nghiên cứu các đặc tính sinh học và sự phát triển từng loại của vi sinh vật Yêu cầu: Mọi thao tác nuôi cấy đều phải thực hiện trong điều kiện vô trùng để tránh tạp nhiễm các vi sinh vật không mong muốn từ môi trường ngoài. - Môi trường và dụng cụ nuôi cấy đều phải khử trùng triệt để. - Duy trì tốt các điềukiện nuôi cấy để vi sinh vật phát triển thuận lợi I. - Hóa chất: các loại hóa chất để chế tạo môi trường phân lập xạ khuẩn, môi trường đất. - Phân lập vi sinh vật - Nguyên tắc: tách từng nhóm khuẩn lạc riêng biệt trên môi trường đặc. - Phương pháp nuôi vi sinh vật. - Để đảm bảo cho vi sinh vật sinh trưởng phát triển tốt, môi trường sau khi cấy xong phải được ủ trong điều kiện thích hợp. - Đối với sinh vật ưa ấm nhiệt độ tốt thích từ 20-370C + Đối với sinh vật ưa nóng nhiệt độ khoảng 50-600C + Đối với sinh vật ưa lạnh khoảng 10-150C - Độ ẩm: để duy trì độ ẩm trong quá trình nuôi cần + Đảm bảo đủ lượng nước khi làm môi trường + trong điều kiện cẩn thiết có thể phun nước vô khuẩn vào phòng nuôi hoặc để nước bốc hơi trong tủ ấm. - Oxi + Đối với vi sinh vật hiếu khí. - Cung cấp thường xuyên vầ đầy đủ O2 Lớp môi trường nuôi cấy có độ dày vừa phải Các bình chứa môi trường được lắm thường xuyên trong quá trình nuôi để cung cấp thêm oxi cho vi sinh vật. - Nếu nuôi cấy trong môi trường có khối lượng lớn vừa phải tiến hành sục khí thường xuyên hay định kì. - Đối với vi sinh vật kị khí: hạn chế tiếp xúc với Oxi Đổ lên bề mặt môi trường parafin, dầu vazolin Cấy trích sâu vào môi trường đặc Nuôi cấy trong bình hút chân không Nuôi cấy trong môi trường ống nghiệm đặc biệt sâu khi rút hết không khí và hàn kín lại. - Đun sôi môi trường một thời gian để loại hết O2 . - dùng ống hút cấy vi sinh vật vào đáy ống nghiệm. - Trong môi trường lỏng: vi khuẩn phát triển sẽ làm đục môi trường - Trong môi trường đặc ở thạch nghiêng. - Bài 4 LÀM TIÊU BẢN VI SINH VẬT VÀ MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP NHUỘM I. - Làm tiêu bản vi sinh vật. - Đối tượng: nấm men hoặc sự di chuyển của vi sinh vật. - Dùng que cấy lấy một giọt dịch vi sinh vật đặt vào giữa lamen. - Là phương pháp nhuộm phân biệt 2 loại vi sinh vật khác nhau. - màu sắc của môi trường. - các hóa chất cần thiết để chế tạo môi trường nuôi cấy. - Chuẩn bị mẫu xạ khuẩn: thu nhận khuẩn lạc từ môi trường thạch đĩa Gause I - Có dạng khuẩn lạc, kích thước nhỏ hơn nấm mốc, bề mặt rắn chắc, thô, ráp, xù xì, nhiều màu sắc và bám chắc vào môi trường thạch. - Chuẩn bị mẫu nấm mốc: thu nhận khuẩn lạc từ môi trường Martin - Hình thái. - Quan sát hình thái nấm men - Chuẩn bị mẫu nấm men: thu nhận khuẩn lạc từ môi trường Martin. - Hóa chất: môi trường Hansen, K 2Cr2O7 1%, dung dịch H2SO4 10%, KMnO4 5%, dung dịch AgNO3/NH4OH 20%, FeCl3 3%, NaOH 20%, sữa chua, nước cải muối chua, giấm, rượu. - Quan sát vi sinh vật. - Tiêu bản vi sinh vật trong rượu b. - Các loại vi sinh vật tham gia vào quá trình thối rữa. - Điều này chứng tỏ trong môi trường protein đã phân giải hết. - Quan sát vi sinh vật: Lấy dịch nuôi cấy làm tiêu bản nhuộm đơn và quan sát dưới vật kính 100X Vi khuẩn nitrite hóa c. - Quan sát hình thái vi sinh vật: Lấy dịch nuôi cấy làm tiêu bản nhuộm đơn và quan sát dưới vật kính 100X Tiêu bản vi khuẩn nitrate hóa c. - Quan sát hình thái vi sinh vật Lấy dịch nuôi cấy làm tiêu bản nhuộm đơn và quan sát dưới vật kính dầu. - Hóa chất: thuốc thử đỏ methyl, các loại môi trường nuôi cấy nhóm vi khuẩn đường ruột, mẫu nước song, nước cống. - Đây là một thành phần của hệ vi sinh đường ruột người và động vật máu nóng khác và được sử dụng để chỉ thị mức độ vệ sinh trong quá trình chế biến, bảo quản, vận chuyển thực phẩm, nước uống cũng như để chỉ thị sự ô nhiễm phân trong môi trường. - 3-5 mẫu có độ pha loãng thập phân liên tiếp được ủ ấm trong ống nghiệm chứa môi trường thích hợp có ống bẫy khí Durham. - Sau khi ủ xong: giá ủ ở 37 đem ra cấy sang môi trường thạch đĩa sau đó ủ trong 37 trong 24h rồi đọc kết quả