- Nghiên cứu phát triển hệ thống sắc kí miễn dịch cạnh tranh phát hiện nhanh các độc tố ruột tụ cầu trong sữa. - Tóm tắt: Các độc tố ruột của tụ cầu là một trong những nguyên nhân chủ yếu gây ngộ độc thực phẩm trên thế giới. - Mục tiêu của nghiên cứu này là tạo que thử phát hiện nhanh và đồng thời các độc tố ruột tụ cầu thường gặp, bao gồm SEA, SEB, SEC 1 , SED và SEE trong sữa dựa vào kỹ thuật sắc ký miễn dịch cạnh tranh. - Để đạt mục tiêu này, độc tố ruột tụ cầu SEC 1 được sản xuất và tinh sạch bằng con đường tái tổ hợp và sau đó được cố định lên hạt nano cac bon để tạo cộng hợp phát hiện. - Bên cạnh đó, kháng thể đa dòng IgY kháng các độc tố ruột tụ cầu (SEA, SEB, SEC 1 , SED và SEE) và IgY kháng Bovine serum albumin (BSA) cũng được tạo ra và tinh sạch trước khi được in lên vạch thử nghiệm và vạch kiểm chứng của que thử sắc ký miễn dịch cạnh tranh. - Các kết quả nghiên cứu về việc sản xuất SEC 1 trong tế bào Escherichia coli BL21 đã chỉ ra rằng điều kiện thích hợp để thu nhận độc tố này là nuôi lắc 150 vòng/phút ở 30 o C. - nồng độ chất cảm ứng isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) là 0,5 mM. - Các thông số thích hợp để tạo que thử cũng đã được xác định là: lượng kháng thể IgY kháng các độc tố ruột tụ cầu (SEA, SEB, SEC 1 , SED và SEE) cần cố định tại vạch thử nghiệm là 0,6 µg/que thử có độ rộng 4 mm. - Ngưỡng phát hiện của que thử đối với các độc tố SEA, SEB và SED trong sữa là 30 ng/ml. - Từ khóa: Độc tố ruột tụ cầu, kỹ thuật sắc ký miễn dịch, sữa, que thử.. - Nguyên nhân ngộ độc thực phẩm do tụ cầu là người bị ngộ độc đã tiêu thụ các độc tố ruột tụ cầu (staphylococcal enterotoxin - SE) tồn tại sẵn trong thực phẩm, do các chủng tụ cầu có coagulase dương tính, đặc biệt là tụ cầu vàng (Staphylococcus aureus) tổng hợp nên. - nay, 22 loại độc tố ruột tụ cầu đã được thống kê bao gồm các độc tố có hoạt tính gây nôn và các protein giống độc tố ruột tụ cầu chưa được kiểm tra hoạt tính gây nôn [1]. - Trong số các độc tố ruột tụ cầu trên, 5 loại độc tố ruột tụ cầu bao gồm SEA, SEB, SEC, SED và SEE được biết là nguyên nhân chủ yếu gây ngộ độc thực phẩm.. - Theo thống kê ở Anh từ năm 1969 đến 1990, 79% các ca ngộ độc thực phẩm có nguyên nhân do độc tố ruột tụ cầu: chỉ tính riêng độc tố SEA. - đã gây ra 56,9% các vụ ngộ độc thực phẩm, cả hai độc tố SEA và SED (15,4. - Hiện nay, để phát hiện độc tố ruột tụ cầu, người ta thường sử dụng các sinh phẩm thương mại dựa trên kỹ thuật ELISA như RIDASCREEN SET (R-Biopharm, Darmstadt, Đức) và VIDAS (BioMérieux, Marcy L´Etoile, Pháp) [3]. - Những sinh phẩm này thường sử dụng kháng thể đa dòng và kháng thể đơn dòng từ thỏ, từ chuột [4]. - Tuy nhiên, vùng Fc của kháng thể IgG từ thỏ và chuột phản ứng mạnh và không đặc hiệu với protein A của S. - Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã nghiên cứu chế tạo que thử phát hiện nhanh đồng thời năm loại độc tố ruột tụ cầu thường gặp là SEA, SEB, SEC 1 , SED và SEE trong sữa dựa trên kỹ thuật sắc ký miễn dịch cạnh tranh sử dụng kháng thể đa dòng IgY do chúng tôi tự sản xuất. - Ưu điểm cơ bản của kháng thể IgY so với IgG là có thể sản xuất với liều lượng lớn, giá thành rẻ và đặc biệt là không có phản ứng với protein A [5].. - coli BL21 mang plasmid pGS-21a-sec 1 chứa gen mã hóa độc tố ruột C 1. - của tụ cầu (SEC 1 ) được cung cấp bởi phòng Công nghệ Gen, Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội. - Các độc tố ruột tụ cầu chuẩn SEA, SEB, SEC1, SED và SEE có nguồn gốc từ Toxin Technology, Mỹ. - Chế tạo kháng thể IgY kháng BSA và kháng thể IgY kháng các độc tố ruột tụ cầu. - Gà được gây miễn dịch để sản xuất kháng thể đa dòng IgY kháng BSA và kháng thể đa dòng IgY kháng các độc tố ruột tụ cầu SEA, SEB, SEC1, SED và SEE theo quy trình sản xuất kháng thể IgY của Agro-Bio 2011 [7]:. - Kháng nguyên BSA và kháng nguyên là 5 loại độc tố ruột tụ cầu (SEA+ SEB+ SEC 1 + SED+. - Sau khi đẻ trứng được hai tuần, gà được tiêm 2 tuần một lần với 1mg kháng nguyên là BSA hoặc 100ng kháng nguyên 5 loại độc tố ruột tụ cầu (SEA+ SEB+. - Kháng nguyên là BSA tiêm nhắc lại 2 lần, kháng nguyên là độc tố ruột tụ cầu tiêm nhắc lại 1 lần. - Tinh sạch kháng thể IgY. - Sau đó, kháng thể IgY tiếp tục được tinh sạch bằng sắc ký ái lực với cột “HiTrap IgY. - Cố định IgY kháng các độc tố ruột tụ cầu SE (A+B+C 1 +D+E) và IgY kháng BSA lên màng nitrocelullose. - Kháng thể IgY kháng các độc tố ruột tụ cầu SE (A+B+C 1 +D+E) và kháng thể IgY kháng BSA được phun lên trên màng nitrocellulose lần lượt ở vạch thử nghiệm và vạch kiểm chứng bằng thiết bị Linomat V (CAMAG, Thụy Sĩ). - Lượng kháng thể vạch thử nghiệm được phun lên màng từ 0,2 µg. - 0,6 µg đến 2 µg/que thử, vạch kiểm chứng 1,2 µg/que thử. - Vị trí cố định của vạch thử nghiệm và vạch kiểm chứng lần lượt là 25 mm và 30 mm kể từ đầu que thử. - Sau khi gắn thêm giấy thấm, màng được cắt thành từng que thử có bề rộng là 4 mm bằng máy cắt Cutter 4000 (BioDot, Anh).. - Chuẩn bị cộng hợp phát hiện SEC 1 - nanocarbon. - Sơ đồ que thử phát hiện nhanh các độc tố ruột tụ cầu.. - Kháng nguyên cộng hợp và mẫu được trộn vào trong giếng và que thử được cắm vào giếng. - Nếu có độc tố ruột tụ cầu SEA, SEB, SEC1, SED hoặc SEE thì chỉ xuất hiện một vạch kiểm chứng còn nếu mẫu âm tính. - thì xuất hiện cả hai vạch trên que thử.. - Phân tích mẫu bằng que thử. - Tiếp đó, cắm que thử vào giếng và ủ trong 15 phút. - Kết quả cho thấy nồng độ IPTG tối ưu cho cảm ứng là 0,5 mM (Hình 2A).. - Đây là một đặc điểm thuận lợi cho việc tinh sạch độc tố ruột tụ cầu SEC1 tái tổ hợp bằng phương pháp sắc ký ái lực với đuôi His, sử dụng Kit His Mag Sepharo TM Ni. - tinh sạch. - Để chế tạo ra kháng thể IgY làm nguyên liệu cho que thử sắc ký miễn dịch chúng tôi tách chiết và tinh sạch kháng thể IgY kháng BSA và kháng thể IgY kháng các độc tố ruột tụ cầu (SEA, SEB, SEC 1 , SED, SEE) từ những quả trứng được thu thập của các con gà đã được gây miễn dịch sau 2 lần tiêm. - Kháng thể IgY thu được sau khi tinh sạch bằng phương pháp do PetrHokder tối ưn hóa năm 2013 (giếng 1, Hình 4) tiếp tục được tinh sạch bằng sắc ký ái lực với cột “HiTrap IgY Purification HP” (GE Healthcare), kết quả là thu được kháng thể IgY có độ tinh sạch cao hơn (giếng 4. - Hình 4) để ứng dụng trong xét nghiệm chẩn đoán miễn dịch, phun lên vạch kiểm chứng và vạch thử nghiệm của que thử phát hiện các độc tố ruột tụ cầu.. - Điện di đồ các giai đoạn tinh sạch kháng thể IgY qua cột sắc ký.. - Ứng dụng kháng thể IgY và độc tố ruột tụ cầu SEC 1 tái tổ hợp để phát triển hệ thống sắc ký miễn dịch. - Tối ưu lượng kháng thể cần cố định lên vạch thử nghiệm. - kháng thể cần cố định lên màng phải vừa đủ, đảm bảo mẫu âm tính xuất hiện vạch thử nghiệm nhưng không được quá dư. - Do vậy, kháng thể IgY kháng 5 loại độc tố ruột tụ cầu (SEA, SEB, SEC 1 , SED, SEE) sau khi tinh sạch được khảo sát cố định lên màng với liều lượng khác nhau: 0,2 µg. - 0,6 µg và 2 µg /que thử. - Tiếp đó, sử dụng các que thử này để phân tích mẫu âm tính với liều lượng kháng thể cộng hợp là 2 µl/100 µl đệm chạy. - Kết quả phân tích (Hình 5) chỉ ra rằng nồng độ kháng thể thấp nhất để vạch thử nghiệm xuất hiện rõ là 0,6 µg/. - Trong các thí nghiệm tiếp theo, các que thử với lượng kháng thể cố định là 0,6 µg /que thử đã được sử dụng.. - Lựa chọn lượng kháng thể cố định lên vạch thử nghiệm.. - Nồng độ kháng thể là 2 µg/que thử 2. - Nồng độ kháng thể là 0,6 µg /que thử. - Nồng độ kháng thể là 0,2 µg /que thử Xác định lượng kháng thể cộng hợp cần sử dụng. - Vì sử dụng phương pháp cạnh tranh để phát hiện các độc tố ruột tụ cầu nên lượng kháng nguyên cộng hợp cần dùng phải có liều lượng ít nhất nhưng vẫn phải đảm bảo mẫu âm tính phải xuất hiện vạch. - Để xác định được lượng kháng thể cộng hợp dùng cho mỗi phản ứng, chúng tôi tiến hành sử dụng 1. - Do vậy, trong các thí nghiệm tiếp theo, chúng tôi sử dụng 2µl kháng nguyên cộng hợp cho một que thử.. - Xác định ngưỡng phát hiện của que thử đối với độc tố ruột tụ cầu tinh khiết. - Để xác định ngưỡng phát hiện của que thử với các độc tố ruột SEA, SEB, SEC 1 , SED và SEE, chúng tôi đã chuẩn bị các mẫu độc tố ruột tụ cầu SEA, SEB, SEC 1, SED và SEE tinh khiết với nồng độ từ 1 đến 1000 ng/ml (1. - Kết quả phân tích que thử trong đệm chạy cho thấy:. - Với độc tố ruột SEA các nồng độ (30 - 1000 ng/ml) là dương tính, không xuất hiện vạch thử nghiệm, trong khi các nồng độ (1-10 ng/ml) vẫn còn thấy xuất hiện tín hiệu ở vạch thử nghiệm nhưng mờ hơn so với mẫu kiểm chứng âm tính (Hình 7A). - Kết quả phân tích các độc tố ruột tụ cầu SEB và SED cho thấy ngưỡng phát hiện của que thử tương tự như với độc tố SEA. - Như vậy, nồng độ thấp nhất mà que thử phát hiện dương tính với các độc tố ruột tụ cầu SEA, SEB, SED là 30ng/ml.. - Trong khi đó, với các độc tố SEC 1 các nồng độ (10-1000 ng/ml) cho kết quả dương. - tính còn các nồng độ thấp hơn (1-3 ng/ml) có xuất hiện vạch thử nghiệm mặc dù vạch này mờ hơn ở mẫu kiểm chứng âm tính (Hình 7B).. - Nồng độ độc tố thấp nhất mà que thử nhận ra độc tố SEC 1 (que số 5, Hình 7B) là 10ng/ml.. - Kết quả phân tích với độc tố ruột tụ cầu SEE tương tự như với độc tố ruột SEC1. - Vậy nồng độ thấp nhất mà que thử phát hiện dương tính với các độc tố ruột tụ cầu SEC1 và SEE là 10ng/ml.. - Thử độ nhạy của que thử với độc tố ruột tụ cầu.. - Thử độ nhạy của que thử với SEA. - Thử độ nhạy của que thử với SEC1. - 1 ng/ml và mẫu âm tính không chứa độc tố).. - Xác định ngưỡng phát hiện của que thử đối với độc tố ruột tụ cầu trong sữa. - Khi sử dụng que thử phân tích mẫu sữa, các mẫu sữa được sử dụng trực tiếp, không qua giai đoạn xử lý nào, chỉ cần pha loãng trước khi phân tích với tỷ lệ 1 sữa: 2 đệm chạy (100 mM borat, pH 8,8. - 0,1% Tween 20) để tạo dòng chảy tốt cho mẫu trên màng nitrocellulose của que thử [9]. - Mẫu sữa đã pha loãng được bổ sung các độc tố ruột tụ cầu từ 3 đến 3000 ng/ml để xác định giới hạn phát hiện các độc tố ruột SEA, SEB, SEC 1 , SED và SEE. - của que thử trong mẫu sữa. - Kết quả phân tích que thử trong mẫu sữa cho thấy: Nồng độ độc tố SEA thấp nhất mà que thử dương tính (que 5, hình 8A) là 30ng. - Nồng độ độc tố SEC1 thấp nhất mà que thử dương tính là 9 ng (que 6, hình 8B). - Kết quả phân tích với độc tố ruột tụ cầu SEB và SED cũng cho kết quả tương tự với độc tố SEA. - SEE tương tự như với độc tố ruột SEC1. - Như vậy nồng độ thấp nhất mà que thử phát hiện dương tính trong mẫu sữa với các độc tố ruột tụ cầu SEA, SEB, SED là 30ng/ml, với hai độc tố SEC 1 và SEE là 9 ng/ml.. - Thử độ nhạy của que thử với độc tố ruột tụ cầu trong sữa.. - A.Thử độ nhạy của que thử với SEA trong sữa. - Thử độ nhạy của que thử với SEC 1 trong sữa (1. - mẫu âm tính không chứa độc tố trong sữa. - và mẫu âm tính không chứa độc tố trong đệm).. - Hiện nay các phương pháp ELISA để phát hiện các loại độc tố ruột tụ cầu đang được lưu hành trên thị trường có ngưỡng phát hiện khoảng 0,2 - 2 ng/ml [3]. - Trong các nghiên cứu của Boyle và các cộng sự, que thử phát hiện SEB đã được tạo ra dựa trên phương pháp sắc ký miễn dịch kẹp đôi, nồng độ độc tố SEB thấp nhất phát hiện bằng mắt thường là 500 ng/ml, khi sử dụng máy quét cầm tay là từ 0,25 ng/ml [10]. - Trong nghiên cứu của Keiko Yamada sử dụng kháng thể IgY gà và ứng dụng kỹ thuật sắc ký kẹp đôi tạo que thử phát hiện độc tố ruột tụ cầu SEA với nồng độ thấp 0,2 ng/ ml trên sản phẩm sữa [3]. - Que thử được tạo ra trong nghiên cứu này sử dụng kháng thể IgY gà, ứng dụng kỹ thuật sắc ký miễn dịch cạnh tranh, phát hiện đồng thời được 5 loại độc tố ruột tụ cầu (SEA, SEB, SEC 1 , SED, SEE) trong sữa với nồng độ độc tố thấp nhất phát hiện ở các độc tố ruột tụ cầu SEA, SEB, SED là 30ng/ml, ở hai độc tố SEC 1 và SEE là 9 ng/ml.. - Que thử được tạo ra trong nghiên cứu này phát hiện đồng thời được 5 loại độc tố tụ cầu (SEA, SEB, SEC 1 , SED, SEE) trong sữa với ngưỡng phát hiện khá thấp, gần tương đương với ELISA đối với SEC 1 và SEE