- Hoạt tính ức chế Pepsin và Protease HIV-1 của các cao chiết và hoạt chất Acid maslinic từ dược liệu. - Trong liệu pháp này chất ức chế protease của HIV-1 (Protease HIV-1: enzyme thuộc nhóm protease aspartic) là một trong 3 hợp phần không thể thiếu. - Trong nghiên cứu này, 136 dịch chiết cồn từ nhiều loại thực vật khác nhau đã được sàng lọc về khả năng ức chế pepsin (cùng thuộc nhóm protease aspartic) bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch có chứa cơ chất hemoglobin. - Kết quả cho thấy cao chiết hạt Bơ, lá Gối hạc, toàn thân Ma hoàng, lá Ổi và lá Thạch châu ức chế mạnh hoạt tính của pepsin. - Từ dịch cao chiết cồn lá cây Gối hạc (Leea rubra L. - hợp chất acid maslinic (2α,3β-dihydroxy-olean-12-en-28-oic acid. - công thức phân tử C 30 H 48 O 4 ) được phân lập và có tác dụng ức chế mạnh pepsin và protease HIV-1 với giá trị IC 50 tương ứng là 3,2 mM và 4,5 µmol. - Kết quả nghiên cứu này phù hợp với dẫn liệu đã công bố trước đây về tác dụng ức chế protease HIV-1 của acid maslinic tách được phân lập từ một vài loài thực vật khác.. - Từ khóa: Pepsin, Protease HIV-1, chất ức chế protease aspartic, acid maslinic, Gối hạc Leea rubra L.. - Một trong các hướng nghiên cứu được quan tâm là phát hiện các hợp chất ức chế sự nhân lên của HIV có nguồn gốc tự nhiên, đặc biệt từ thực vật [3].. - Do đó, protease HIV-1 được xem như một trong các đích quan trọng trong phát triển thuốc chống HIV thông qua khả năng ức chế enzyme [4]. - Protease HIV-1 thuộc họ protease aspartic, có dạng dimer và mang những đặc điểm tương đồng với pepsin về cấu trúc cũng như cơ chế xúc tác. - Cả protease HIV- 1 và pepsin đều có trình tự nhận biết là Asp- Thr-Gly, nhìn chung, chúng có cấu trúc bậc nhất tương tự nhau, đều bị ức chế bởi pepstatin A và bị bất hoạt khi đột biến xảy ra ở vùng hoạt tính chứa Asp [5]. - Do đó pepsin có thể được dùng như một enzyme đích để sàng lọc các chất ức chế protease HIV-1 [6, 7].. - Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tiến hành sàng lọc khả năng ức chế pepsin của các dịch chiết thảo dược thu thập tại Việt Nam, sau đó lựa chọn mẫu có tác dụng tốt để phân lập các hợp chất có hoạt tính ức chế mạnh pepsin và protease HIV-1. - Nghiên cứu nhằm hướng đến việc phát hiện các chất ức chế protease HIV-1 từ các nguồn thảo dược Việt Nam, làm cơ sở cho việc phát triển các thuốc điều trị bệnh AIDS.. - pepstatin A, cơ chất peptide L6525 (Lys-Ala-Arg-Val-Leu*Nph-Glu-Ala-Met) cho xác định hoạt tính của protease HIV-1 được mua từ Sigma-Aldrich. - Protease HIV-1 là sản phẩm của đề tài ĐT-PTNTĐ.2012-G/02.. - Các dược liệu dùng cho sàng lọc hoạt tính do Viện Dược liệu cung cấp. - Các mẫu được xác định tên khoa học bằng khóa phân loại thực vật và so sánh với các tiêu bản lưu giữ tại Viện Dược liệu.. - Phương pháp. - Xác định hoạt tính ức chế enzyme bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch có chứa cơ chất hemoglobin: Các đĩa agar (2,5%) được chuẩn bị trong đệm acetate 50 mM pH 3.5, chứa hemoglobin (0,3%) và được đục các lỗ (đường kính 4 mm) để cho mẫu phân tích. - 10 µl dịch chiết thực vật hoặc các phân đoạn tinh sạch pha trong DMSO được cho vào giếng, ủ 37 o C trong 15 phút cho đến khi dịch chiết khuếch tán một phần vào đĩa thạch, sau đó bổ sung 10 µl pepsin (1 mg/ml) pha trong HCl. - Mẫu kiểm tra âm là mẫu thay đồng thời dịch chiết bằng DMSO, thay pepsin bằng dung dịch pha pepsin (HCl 0,01 N), mẫu kiểm tra dương là mẫu chỉ thay dịch chiết bằng DMSO. - Hoạt tính ức chế pepsin được đánh giá trên cơ sở đo vòng phân giải cơ chất, so sánh giữa mẫu thí nghiệm và các mẫu kiểm tra.. - Xác định hoạt độ protease HIV-1 bằng quang phổ kế theo phương pháp được mô tả bởi Richards và tập thể [8] sử dụng cơ chất peptide tổng hợp có liên kết đặc hiệu của protease HIV- 1 và hấp thụ cực đại tại bước sóng 300 nm.. - Hoạt tính ức chế pepsin hay protease HIV-1 được xác định bằng cách ủ dịch mẫu chứa chất thử (cao chiết thực vật hay chất quan tâm) với pepsin hay protease HIV-1 trong 5 phút, trước khi bổ sung cơ chất trong cùng điều kiện phân tích. - Mẫu kiểm tra hay đối chứng là thay dung dịch chứa chất ức chế bằng đệm chiết hay dung môi hòa tan chất ức chế.. - Chuẩn bị dịch chiết thảo dược cho sàng lọc: Dịch chiết từ dược liệu được chuẩn bị bằng phương pháp ngâm lạnh. - Cụ thể, dược liệu được ngâm với cồn (ethanol 96%) ở nhiệt độ phòng với tỷ lệ 1:10 (1 g dược liệu được ngâm với 10 ml ethanol) trong 3-4 ngày, lọc lấy dịch chiết. - Lặp lại việc ngâm chiết 2 lần rồi gộp các dịch chiết đã được lọc lại, cất thu hồi dung môi đến khối lượng không đổi thu được cao dược liệu dùng cho thử hoạt tính (được xác định độ ẩm trước khi thử hoạt tính).. - Phân đoạn và phân lập các hợp chất. - Các cao chiết có tác dụng được phân đoạn bằng các dung môi có độ phân cực tăng dần từ n-hexan (Hx), đến ethyl acetate (EtOAc) và n-butanol (BuOH). - Phân lập các chất bằng sắc ký cột silica gel pha thường hoặc pha đảo, sử dụng sắc ký lớp mỏng để phân đoạn dịch rửa giải. - Phân lập acid maslinic từ lá cây Gối hạc [9]: Dược liệu 3 kg lá cây gối hạc (Leea rubra Blume) độ ẩm 10% được cắt nhỏ, ngâm chiết với cồn (ethanol 96%) ở nhiệt độ phòng (chiết 3 lần, mỗi lần 4 ngày). - Gộp và lọc lấy dịch chiết và cất loại cồn dưới áp suất giảm thu được cao chiết cồn đã cô khô (103 g). - Các dịch chiết Hx, EtOAc và BuOH được tách riêng, cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được các phần cao tương ứng: phân đoạn Hx (20 g), phân đoạn EtOAc (35 g) và phân đoạn BuOH (34 g). - Cao cô phân đoạn Hx (20 g). - Dịch rửa chiết được chia thành 6 phân đoạn chính: PĐ1 (1,3 g). - Phân đoạn PĐ5 (2,6 g) tiếp tục được phân tách bằng cột silica gel với hệ dung môi rửa chiết n-hexan/ethyl acetate (2/1. - Điều tra hoạt tính ức chế pepsin của các dịch chiết thực vật. - Chúng tôi tiến hành sàng lọc khả năng ức chế pepsin của 136 cao chiết thực vật thuộc 72 loài khác nhau bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch có chứa cơ chất hemoglobin.. - Trong số này có 31 loại dịch chiết cả cây, 29 loại dịch chiết cành lá, 2 loại dịch chiết cành, 13 loại dịch chiết lá, 22 loại dịch chiết thân, 5 loại dịch chiết vỏ thân, 8 loại dịch chiết rễ, 1 loại dịch chiết vỏ rễ, 2 loại dịch chiết củ, 10 loại dịch chiết phần thân trên mặt đất, 1 loại dịch chiết hoa, 4 loại dịch chiết quả, 3 loại dịch chiết. - vỏ quả, 1 loại dịch chiết ruột quả và 4 loại dịch chiết hạt. - Hoạt tính phân giải cơ chất hemoglobin bởi pepsin thể hiện bằng sự xuất hiện vòng phân giải màu sáng, và hoạt tính ức chế pepsin được thể hiện ở đường kính vòng phân giải bị giảm đi (hình 1). - Kết quả tổng hợp ở bảng 1 cho thấy, 40 mẫu dịch chiết thực vật có hoạt tính ức chế pepsin. - Trong đó, 5 mẫu dịch chiết thực vật bao gồm: Bơ (hạt), lá Gối hạc (lá), Ma hoàng (cả cây), Ổi (lá) và Thạch châu (lá) có hoạt tính ức chế pepsin mạnh nhất. - Ngoài ra, 14 loại dịch chiết khác (Côm láng, Đơn mặt trời, Đơn tướng quân, Long não, Mùi chó, Súng đỏ, Tầm gửi khế, Thạch hộc, Thồm lồm, Thông tre, Trà hoa Đà Lạt, Trang mẫu đơn, Vảy tê tê cuống dài và Viễn chí lá nhỏ) có hoạt tính ức chế pepsin ở mức độ thấp hơn so với 5 cao chiết vừa nêu trên.. - Khả năng ức chế pepsin của các cao chiết thực vật. - Giếng 1: dung dịch pha pepsin (HCl 0,01 N), giếng 2: DMSO, giếng 3: pepsin (không có chất ức chế), giếng 4: pepsin + dung môi DMSO, giếng 5: pepsin. - các giếng 6-22: dịch chiết các mẫu thực vật.. - Hoạt tính ức chế pepsin của dịch chiết 40 loài thực vật. - Gối hạc (L. - Tác dụng thể hiện mức độ ức chế pepsin. - không ức chế. - có ức chế yếu. - ức chế trung bình. - ức chế mạnh.. - Khả năng ức chế pesin và protease HIV-1 của các phân đoạn dịch chiết lá cây Gối hạc. - Chúng tôi đã chọn Gối hạc để phân lập chất ức chế enzyme đích. - Cao dịch chiết lá Gối hạc được chiết trong các dung môi có độ phân cực. - tăng dần để thu riêng các phân đoạn: Hx, EtOAc, và BuOH. - Trong đó, cao phân đoạn Hx có hoạt tính ức chế pepsin cao nhất (hình 2, giếng 7) được lựa chọn.. - Khả năng ức chế pepsin của các phân đoạn dung môi lá cây Gối hạc. - Giếng 1: HCl 0,01 N, giếng 2: DMSO, giếng 3: pepsin, giếng 4: pepsin + DMSO, giếng 5: pepsin + Pepstatin, giếng 6: cao cồn, giếng 7 - 10: các phân đoạn. - Khả năng ức chế pepsin của các phân đoạn tinh sạch từ cao Hx của cây Gối hạc. - Giếng 1: HCl 0,01 N, giếng 2: DMSO, giếng 3: pepsin, giếng 4: pepsin + DMSO, giếng 5: pepsin + Pepstatin, giếng 6: phân đoạn cao Hx, giếng 7-12: phân đoạn PĐ 1– 6.. - Cao phân đoạn Hx được chạy qua sắc ký silica gel, rửa giải thu được 6 phân đoạn (1-6), trong đó phân đoạn 5 (PĐ5) có hoạt tính ức chế pepsin cao nhất (hình 3, giếng 11).. - Kết quả khảo sát phân đoạn PĐ5 bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (silica gel pha thường, hệ dung môi n-hexan/ethyl acetate. - Phân đoạn PĐ5 tiếp tục được phân tách bằng cột silica gel với hệ dung môi rửa giải n-hexan/ethyl acetate (2/1. - Kết quả thử khả năng ức chế của GH cho thấy: GH có hoạt tính ức chế pepsin rõ rệt ở các nồng độ từ 5-50 mg/ml (hình 4B) cũng như ức chế hơn 80% hoạt tính protease HIV-1 tại nồng độ 10 µg/ml (hình 4C).. - A) Sắc ký đồ SKLM phân đoạn PĐ5. - B) Khả năng ức chế pepsin các phân đoạn tinh sạch từ dịch chiết lá cây gối hạc: Giếng 1: HCl 0,01 N, giếng 2: DMSO, giếng 3: pepsin, giếng 4: pepsin + DMSO, giếng 5: pepsin + Pepstatin A, giếng 6: cao cồn, giếng 7: phân đoạn cao Hx, giếng 8: phân đoạn PĐ5 và giếng 9-12: GH với các. - C) Hoạt tính phân cắt cơ chất của protease HIV-1 khi có và không có GH.. - Phân tích cấu trúc và ảnh hưởng của GH đến hoạt tính của pepsin và protease HIV-1. - 11] khẳng định chất GH1 là acid maslinic C 30 H 48 O 4 (2α,3β-dihydroxy-olean-12- en-28-oic acid).. - Công thức cấu tạo chất acid maslinic.. - Tiến hành đánh giá ảnh hưởng của acid maslinic lên hoạt động của pepsin trong ống nghiệm theo phương pháp Anson cải tiến. - Kết quả cho thấy, acid maslinic ức chế pepsin với nồng độ cơ chất tại đó 50% pepsin còn hoạt động (IC 50 ) là 3,2 mM (hình 6A).. - Khi sử dụng cơ chất tổng hợp đặc hiệu để phân tích ảnh hưởng của acid này lên hoạt độ của protease HIV-1 cũng cho thấy acid maslinic ức chế mạnh protease HIV-1 với nồng độ IC 50. - Như vậy, acid maslinic đã ức chế protease HIV-1 mạnh hơn gần một ngàn lần so với ức chế pepsin, chứng tỏ chất ức chế này đặc hiệu cao hơn với protease HIV-1. - Như vậy, các chất này có mức độ ức chế protease HIV-1 yếu hơn đáng kể so với acid maslinic.. - Acid maslinic còn được gọi là acid crategolic được phân lập lần đầu tiên năm 1927 từ lá cây Táo gai (Crataegus oxyacantha), họ Hoa hồng (Rosaceae) và đến nay đã biết có trong hơn 30 loại thực vật khác nhau như trong quả và dầu cây Ô liu, rau chân vịt, đậu Lăng, quả Lựu. - Gần đây, acid maslinic được biết đến với nhiều tác dụng sinh học và có nhiều tiềm năng trong điều trị bệnh như chống lại quá trình tăng sinh của tế bào ung thư, ức chế enzyme glycogen phosphorylase (GP) xúc tác cho phản ứng đầu tiên phá vỡ glycogen giúp điều trị tiểu đường, chống oxi hoá, kháng viêm, ngăn chặn các bệnh tim mạch, bảo vệ hệ thần kinh và kháng virus. - Khả năng ức chế protease HIV-1 của acid maslinic cùng với một. - số acid triterpen khác tinh sạch từ dịch chiết loài thực vật Geum japonicum, họ Hoa hồng (Rosaceae) đã được phát hiện từ khá sớm [14].. - Trong công trình này, chúng tôi cho biết sự có mặt của acid maslinic từ lá cây Gối hạc với hoạt tính ức chế rất mạnh protease HIV-1. - Trong số các acid triterpen đã biết đến, acid maslinic có khả năng ức chế protease HIV-1 mạnh nhất [15]. - Điều đáng quan tâm là acid maslinic là thành phần chính của lá gối hạc, một loại cây mọc phổ biến ở Việt Nam [9]. - Các kết quả trong nghiên cứu này gợi ý về khả năng phát triển và sử dụng cây thuốc dân gian Gối hạc và hoạt chất acid maslinic trong điều trị bệnh HIV.. - Hoạt tính ức chế của acid maslinic đối với pepsin (A) và protease HIV-1 (B).. - Qua nghiên cứu sàng lọc hoạt tính ức chế pepsin của các cao chiết cồn từ 136 loài thực vật cho thấy có 5 cao chiết hạt gồm Bơ (Persea americana Mill. - lá Gối hạc (Leea rubra L. - lá Ổi (Psidium guajava L.) và lá Thạch châu (Pyrenaria jonqueriana Pierre) ức chế mạnh enzyme này. - Từ cao chiết cồn của lá Gối hạc, chúng tôi đã tinh sạch được acid maslinic. - (2α,3β- dihydroxy-olean-12-en-28-oic acid) có tác dụng ức chế mạnh pepsin và protease HIV-1 với nồng độ IC 50 tương ứng là 3,2 mM và 4,5 µM.