- ứNG DụNG Kỹ THUậT PCR PHụC Vụ KIểM ĐịNH SALMONELLA TRONG NƯớC MặT Ô NHIễM. - Khu hệ vi sinh vật n−ớc ô nhiễm rất đa dạng về chủng loại và gây nhiều khó khăn cho việc đánh giá các chỉ tiêu vi sinh vật. - Với Salmonella, các kỹ thuật vi sinh th−ờng quy cho tỷ lệ d−ơng tính giả. - cao do nhiều vi sinh vật có thể cùng thể hiện những tính nh− Salmonella khi đánh giá.. - Bài báo đề cập và so sánh kết quả kiểm định chỉ tiêu Salmonella theo kỹ thuật th−ờng quy và PCR. - Kết quả cho thấy kỹ thuật PCR có thể đ−ợc ứng dụng hữu hiệu và cho độ. - đặc hiệu cao hơn khi kiểm định chỉ tiêu Salmonella trong khu hệ phức tạp. - Tuy nhiên, sự cẩn trọng là cần thiết khi đánh giá kết quả thu nhận đ−ợc do khả năng d−ơng tính giả vẫn hiện hữu và sự có mặt của khu hệ vi sinh vật đa dạng có thể làm giảm độ nhạy của ph−ơng pháp. - Trong tr−ờng hợp nghi vấn, PCR có thể đ−ợc sử dụng nh− test khẳng. - định Salmonella.. - Từ khóa: N−ớc mặt. - nhiễm, vi sinh vật, Salmonella, PCR. - Ô nhiễm từ n−ớc thải không chỉ ảnh h−ởng tới sức khỏe cộng đồng mà còn ảnh h−ởng trực tiếp đến sản xuất, đặc biệt tại các nhà máy sản xuất và chế biến thực phẩm. - Để đảm bảo môi tr−ờng sản xuất sạch các thông số vệ sinh cần đ−ợc quan tâm, trong đó có các thông số về chất l−ợng n−ớc tr−ớc và sau xử lý. - Một nhóm vi sinh vật đ−ợc quan tâm nhiều là Salmonella do khả năng gây bệnh cho ng−ời và vật nuôi. - Về tính chất sinh lý, Salmonella không lên men đ−ờng lactoza nh−ng lên men đ−ờng glucoza và sinh hơi, sử dụng đ−ợc citrat ở môi tr−ờng Simmons, catalaza. - Dựa trên cấu trúc kháng nguyên, Salmonella. - tìm đ−ợc gần 70 yếu tố kháng nguyên O ở Salmonella. - Kết hợp với kháng nguyên H có mặt ở hầu hết Salmonella, có thể thu đ−ợc trên 1500 typ huyết thanh. - Kháng nguyên K chỉ có ở S.. - Khu hệ vi sinh vật n−ớc mặt ô nhiễm rất đa dạng về chủng loại và gây khó khăn cho việc đánh giá các chỉ tiêu vi sinh vật. - Với Salmonella, các kỹ thuật vi sinh th−ờng quy cho tỷ lệ d−ơng tính giả cao do nhiều vi sinh vật có thể cùng thể hiện những tính nh− Salmonella khi đánh giá. - Bài báo này đề cập tới việc ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử nhằm nâng cao độ chính xác của các xét nghiệm vệ sinh môi tr−ờng và chất l−ợng n−ớc.. - Nguyên vật liệu và ph−ơng pháp. - Mẫu phân tích. - Mẫu n−ớc mặt đ−ợc lấy ở hồ, ao thuộc nhiều địa điểm khác nhau của thành phố Hà Nội (Bảng 1). - cho tới khi phân tích vi sinh (sau 3h).. - Danh sách mẫu n−ớc mặt ô nhiễm trên địa bàn Hà Nội sử dụng trong nghiên cứu. - 10 Hồ Định Công (hồ 2). - 11 Hồ Định Công (hồ 3). - Xác định Salmonella trong n−ớc mặt ô nhiễm bằng ph−ơng pháp th−ờng quy. - Ph−ơng pháp xác định Salmonella th−ờng quy bao gồm các b−ớc tăng sinh, tăng sinh chọn lọc, phân lập và nhận diện. - trộn đều sang 10 ml môi tr−ờng tăng sinh Rappapport-Vassliadis (RV). - Tiếp theo, các khuẩn lạc đơn đ−ợc phân lập bằng que cấy từ môi tr−ờng tăng sinh chọn lọc lên đĩa môi tr−ờng chọn lọc phân biệt. - Tất cả các đĩa môi tr−ờng sau khi cấy đ−ợc ủ ở 37°C trong 22 - 24 giờ. - Trên môi tr−ờng MLCB khuẩn lạc Salmonella có màu đen. - Các khuẩn lạc có đặc điểm nh− trên đ−ợc khẳng định bằng các thử nghiệm sinh hoá trên môi tr−ờng TSI và LIM. - Môi tr−ờng TSI có thể xác định đ−ợc khả năng lên men của các loại đ−ờng glucoza, lactoza, sucroza và khả năng sinh khí H 2 S. - Môi tr−ờng LIM xác. - định khả năng phản ứng lysin, Indol, khả năng dịch chuyển. - Ngoài ra, để so sánh ph−ơng pháp, trong nghiên cứu này, các khuẩn lạc cũng đ−ợc kiểm tra bằng kỹ thuật PCR.. - Xác định Salmonella trong n−ớc mặt ô nhiễm bằng kỹ thuật PCR Trong ph−ơng pháp này, mẫu phẩm đ−ợc làm giàu không chọn lọc, sau đó sinh khối vi sinh vật đ−ợc sử dụng làm khuôn cho PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu cho Salmonella. - T−ơng tự nh− trên, hệ vi sinh vật đ−ợc làm giàu bằng cách chuyển 25ml mẫu sang túi PE vô trùng, bổ sung 225 ml dung dịch BPW, đồng nhất mẫu và ủ ở 37°C trong 18 - 24 giờ. - Vì Salmonella là vi khuẩn Gram âm, có thành tế bào t−ơng đối mỏng do vậy có thể dễ dàng bị phá hủy khi đun sôi ở 100°C trong 15 phút. - Canh tr−ờng đun sôi đ−ợc dùng trực tiếp làm khuôn cho phản ứng PCR. - Tr−ờng hợp không tiến hành phản ứng ngay, ADN khuôn đ−ợc bảo quản trong tủ -20°C. - Các mồi Salm3 (5’- GCTGCGCGCGAACGGCG AAG-3’) và Salm4 (5’-TCCCGGCAGAGTTCCCATT-3’) đ−ợc sử dụng. - đ−ợc các nhà khoa học Italia sử dụng tr−ớc đó để phát hiện Salmonella spp.[5]. - Gel sau đó đ−ợc nhuộm bằng dung dịch ethidium bromide 0,5 mg/l và quan sát d−ới ánh sáng cực tím.. - Kết quả và bàn luận. - So sánh kết quả kiểm định Salmonella th−ờng quy và bằng PCR đối với mẫu phẩm. - Các mẫu n−ớc mặt bị ô nhiễm (Bảng 1) đ−ợc phân tích đồng thời bằng kỹ thuật kiểm định Salmonella th−ờng quy và bằng ph−ơng pháp PCR nh. - Kết quả đ−ợc trình bày trong Bảng 2. - Tất cả 12 mẫu phân tích đều cho kết quả d−ơng tính khi làm giàu bằng RV, tuy nhiên chỉ có 4 mẫu cho kết quả d−ơng tính trên MLCB.. - Điều này phần nào cho thấy sự phức tạp của hệ vi sinh vật n−ớc mặt bị ô nhiễm.. - Thông th−ờng, trong kiểm định thực phẩm, tần suất d−ơng tính với RV t−ơng đối thấp và những mẫu d−ơng tính với RV. - Chỉ những khuẩn lạc cho kết quả d−ơng tính trên MLCB mới đ−ợc phân tích tiếp bằng TSI và LIM nh− kỹ thuật phân tích Salmonella th−ờng quy yêu cầu. - Kết quả kiểm tra bằng TSI và LIM trùng khớp với kết quả mà môi tr−ờng MLCB đem lại. - Nh− vậy, theo phân tích th−ờng quy có thể kết luận có 4 mẫu d−ơng tính với Salmonella, đó là các mẫu 3, 7, 8 và 12.. - Ngoài kỹ thuật th−ờng quy, các mẫu n−ớc cũng đ−ợc phân tích đồng thời bằng kỹ thuật PCR. - Kết quả kiểm định bằng PCR cho thấy có 3 mẫu n−ớc d−ơng tính với Salmonella và trùng với kết quả theo đánh giá th−ờng quy (Hình 1, Bảng 2). - Khác biệt duy nhất là mẫu số 3 cho kết quả âm tính khi xác định bằng PCR nh−ng d−ơng tính với đánh giá th−ờng quy. - Điều này cho thấy độ t−ơng đồng cao giữa hai ph−ơng pháp.. - Thông th−ờng ph−ơng pháp PCR đ−ợc đánh giá là có độ tin cậy cao hơn [4, 5] và nh−. - vậy phân tích bằng PCR sẽ giảm thiểu đ−ợc số l−ợng d−ơng tính giả. - Những mẫu nhiễm Salmonella là những mẫu n−ớc từ Hồ Linh Đàm, Sông Tô Lịch (đoạn Đại Kim), sông Tô Lịch (đoạn Cầu Mới).. - Sản phẩm PCR sử dụng mồi Salm3 và Salm4 đối với các mẫu n−ớc mặt bị ô nhiễm sau khi làm giàu không chọn lọc. - 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 - các mẫu n−ớc ở các vùng khác nhau;. - N - sản phẩm PCR không có ADN khuôn. - Kết quả phân tích Salmonella của các mẫu n−ớc mặt ô nhiễm. - Ph−ơng pháp vi sinh. - Kết luận theo kỹ thuật vi. - không tiến hành kiểm tra. - D−ơng tính. - Khả năng sử dụng ph−ơng pháp PCR trong test khẳng định Salmonella ứ ng dụng PCR trong phân tích n−ớc mặt ô nhiễm cũng không phải hoàn toàn không có sai số. - Một số mẫu phẩm đem lại những băng không đặc hiệu và có thể ảnh h−ởng tới kết quả đánh giá (Hình 1, băng 2, 3, 11). - Sự có mặt của những băng này về lý thuyết có thể làm giảm độ nhạy của ph−ơng pháp (cạnh tranh khuôn trong PCR) và thậm chí là d−ơng tính giả (nếu sản phẩm không đặc hiệu có cùng kích th−ớc với sản phẩm đích). - Trong tr−ờng hợp nghi vấn có thể tiến hành làm giàu chọn lọc và áp dụng kỹ thuật PCR để khẳng định những khuẩn lạc nghi ngờ. - Nhằm kiểm tra khả năng khẳng định của ph−ơng pháp PCR chúng tôi tiến hành thử nghiệm một loạt những khuẩn lạc d−ơng tính trên môi tr−ờng MLCB và sau đó kiểm tra đồng thời bằng TSI, LIM và bằng kỹ thuật PCR. - Để thực hiện điều này, 9 khuẩn lạc mầu đen có hình thái t−ơng đối khác nhau trên môi tr−ờng MLCB của mẫu số 8 đ−ợc kiểm tra. - Kết quả kiểm tra sinh hóa của 9 khuẩn lạc đều đ−a đến kết quả t−ơng đồng với chủng chuẩn và có. - Tuy nhiên chỉ có 5 khuẩn lạc đ−ợc khẳng định là Salmonella bằng PCR. - Kết quả thử nghiệm với khuẩn lạc tỏ ra đặc hiệu hơn nhiều so với khi đánh giá cả khu hệ (Hình 2, Hình 1). - Nh− vậy, trong tr−ờng hợp nghi vấn, kỹ thuật PCR tỏ ra rất hữu hiệu trong test khẳng định Salmonella.. - Kết quả test sinh hóa của các khuẩn lạc nghi ngờ và khẳng định bằng PCR. - Khuẩn lạc số Glucoza Lactoza Sucrosa H 2S Lysine Indol Chuyển động Kết luận theo test sinh hóa. - Sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi Salm3 và Salm4 từ 9 khuẩn lạc nghi ngờ Salmonella d−ơng tính (tạo sắc tố đen trên MLCB). - 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 - các khuẩn lạc nghi ngờ. - Kỹ thuật PCR có thể đ−ợc ứng dụng hữu hiệu và cho độ đặc hiệu cao hơn so với kỹ thuật vi sinh th−ờng quy trong kiểm định chỉ tiêu Salmonella của khu hệ phức tạp nh−. - n−ớc mặt ô nhiễm. - Tuy nhiên, sự cẩn trọng là cần thiết khi đánh giá kết quả thu nhận. - đ−ợc do khả năng d−ơng tính giả vẫn hiện hữu và sự có mặt của khu hệ vi sinh vật đa dạng có thể làm giảm độ nhạy của ph−ơng pháp. - Trong tr−ờng hợp nghi vấn, PCR có thể đ−ợc sử dụng nh− test khẳng định Salmonella.. - Vũ Nguyên Thành (Viện Công nghiệp Thực phẩm) vì những góp ý trong quá trình thực hiện.. - Kiều Hữu ả nh, Ngô Tự Thành, Vi sinh vật học của các nguồn n−ớc, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, 1985, tr.250-259.. - Nguyễn Huy Chính (chủ biên), Vi sinh vật y học, NXB Y học, Hà Nội, 2001, tr.172- 193.. - TCVN 6847:2001 VSV- h−ớng dẫn chung ph−ơng pháp phát hiện Salmonella.