- Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên và Công nghệ Sàng l c ch t kháng sinh ch ng ung th t x khu n phân l p v n Qu c gia Cát Bà Nguy n Qu nh Uy n1.
- Lê Ph ơng Chung2, inh Thúy H ng1, Nguy n Hu nh Minh Quyên1 1 Vi n Vi sinh v t và Công ngh Sinh h c, HQGHN, 144 Xuân Th y, Hà N i, Vi t Nam 2 i h c Nha Trang, s 2 Nguy n ình Chi u, Nha Trang, Khánh Hòa, Vi t Nam Nh n ngày 29 tháng 3 n m 2011 Tóm t t.
- Trong 424 ch ng x khu n phân l p t i Cát Bà, 10 ch ng có ho t tính kháng ít nh t 2 loài vi sinh v t ki m nh ã c sàng l c.
- Nghiên c u hình thái và so sánh trình t o n gen 16S rDNA c a 10 ch ng này cho phép x p chúng vào chi Streptomyces.
- Trong s 10 ch ng l a ch n, ba ch ng (A1022, A1018 và A1073) ã th hi n ho t tính kháng khu n cao ( ng kính vòng c ch > 30 mm) và ã c ch n nghiên c u ho t tính kháng t bào ung th ng i.
- C ba ch ng này u có tác d ng d ơng tính v i ba dòng t bào ung th c a ng i s d ng trong nghiên c u, g m ung th gan (Hep-G2), ung th ph i (Lu) và ung th cơ vân tim (RD), !c bi t ch ng A1073 có ho t tính t ơng ơng, th m chí cao hơn i ch ng d ơng.
- K t qu phân tích b ng HPLC cho th y chi t chi t thô t d ch nuôi c a 3 ch ng A1022, A1018 và A1073 là các h"n h p t ơng ng g m 5 ch t, 8 ch t và 6 ch t khác nhau.
- T khóa: Dòng t bào ung th c a ng i, ch t kháng sinh, x khu n, Streptomyces.
- M u∗ h p ung th có th ch%a tr n u c phát hi n và i u tr s m.
- Ung th hi n ang c i u Ung th là m#t nhóm các b nh liên quan tr b ng m#t ho!c k t h p gi%a ba li u pháp: n vi c không ki m soát c quá trình phân ph$u thu t, x tr và hóa tr li u.
- Nhi u ch t hóa chia t bào d$n n hình thành kh i u t i ch" tr li u dùng trong ch%a tr ung th là các s n ho!c di chuy n n nơi xa (di c n).
- M#t trong ph m th sinh có ngu n g c vi sinh v t, th ng nh%ng nguyên nhân chính gây ung th là s sai c g i là ch t kháng sinh ch ng ung th h&ng c a DNA, t o nên #t bi n các gen i u (anti-tumor/cancer antibiotics) [2].
- N u không c ch%a X khu n là nhóm vi sinh v t có ti m n ng tr s m, h'u h t các lo i ung th có th gây t l n trong vi c s n sinh kháng sinh nói chung và vong, và ây là m#t trong nh%ng nguyên nhân kháng sinh ch ng ung th nói riêng [3, 4].
- nhóm kháng sinh c dùng nhi u trong i u M!c dù là c n b nh nan y, trong nhi u tr ng tr ung th g m anthracycline, actinomycin và.
- d ng r#ng rãi trong i u tr các b nh ung th E-mail:
[email protected] 271 272 N.Q.
- Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên và Công nghệ nh ung th máu, ung th b ch huy t, ung th dòng t bào ung th g m ung th gan (Hep- ti n li t tuy n, ung th vú, ung th bàng quang G2), ung th ph i (Lu) và ung th cơ vân tim [5].
- L p kháng sinh anthracycline c sinh (RD).
- Các ch t kháng sinh ch ng ung 2.1.
- Các ch ng x khu n và i u ki n nuôi c y th tác #ng lên t bào ung th theo nhi u cơ 424 ch ng x khu n c phân l p t các ch khác nhau, nh tác #ng lên màng t bào, m$u t và lá m c trong V n Qu c gia Cát Bà lên quá trình sinh t ng h p DNA và RNA, qua và c l u gi% trong trong glycerol -80°C.
- các t bào ung Tr c khi s d ng trong thí nghi m sàng th , màng t bào b bi n i v c u trúc và !c l c, các ch ng c ho t hoá trên môi tr ng tính sinh h c, ch y u mang i n tích âm do YS (glucose 1%, cao n m men 0,2%, th ch hàm l ng phosphatidylserine và O- 1,7%, pH 7) nuôi nhi t # 30°C trong 3-4 glycosylated mucin cao [9-11], do ó là i ngày.
- ây c)ng là i u ki n nuôi c y sơ b# t ng ch n l c c a các ch t kháng sinh ch ng sàng l c ho t tính kháng sinh.
- ung th .
- M#t s ch t kháng sinh ch ng ung th sàng l c ho t tính kháng sinh b ng l i có tác #ng ch n l c i v i các phân t ph ơng pháp khu ch tán, các ch ng x khu n DNA b #t bi n trong t bào ung th , qua ó c nuôi l*c trong môi tr ng u t ơng d ch ng n c n quá trình sinh t ng h p DNA và s th (tinh b#t hòa tan 2%, glucose 1%, b#t u phân chia c a t bào [3, 4].
- ch%a tr ung th nh ng cu#c u tranh v i c n ây c)ng là môi tr ng dùng thu d ch nuôi b nh này v$n không ng ng ti p di n.
- Nhi m v trong các nghiên c u liên quan n ho t tính phát hi n và nghiên c u các lo i thu c m i, !c sinh kháng sinh.
- Vi sinh v t ki m nh và i u ki n nuôi c y th gi i.
- Vi n Vi sinh v t và Công ngh sinh B n ch ng ki m nh dùng cho phép th h c, HQGHN là nơi s u t'm và l u gi% ngu n ho t tính kháng sinh g m Micrococcus luteus vi sinh v t l n c a c n c, trong ó có x (vi khu n Gram d ơng), Escherichia coli (vi khu n, s d ng cho các nghiên c u cơ b n khu n Gram âm), Candida albicans (n m men) và ng d ng.
- Các ch ng d c ch t kháng ung th Vi t Nam, trong này c nuôi trong các môi tr ng thích h p.
- coli c nuôi trong g m 424 ch ng x khu n phân l p t v n môi tr ng Mueller-Hinton (cao th t 0,3%, Qu c gia Cát Bà (H i Phòng) l u gi% t i Vi n casein th y phân 1,75%, tinh b#t 0,15%, pH sàng l c ho t tính kháng vi sinh v t, trên cơ 7,4) 37°C còn C.
- oxysporum s ó các ch ng có ho t tính kháng sinh cao c nuôi trong môi tr ng YM (glucose 1%, c dùng th ho t tính kháng i v i ba N.Q.
- Sàng l c các ch ng sinh kháng sinh min 40%, 19 min 45%, 22 min 85%, 29 min 85%, 32 min 15.
- M$u ch t chi t c hòa tan trong DMSO khu n ã m c t t trên môi tr ng th ch +a YS và a vào c#t (25 µl) v i n ng # t ơng (3-5 ngày) c c*t thành th&i ng kính ơng gi%a các m$u v th tích d ch nuôi.
- kho ng 5 mm (b ng d ng c hình ng) r i !t lên +a sàng l c ã c c y vi sinh v t ki m 2.6.
- Ph ng pháp nghiên c u ho t tính gây c nh tr c ó và ti n hành nuôi trong i u ki n t bào thích h p trong 2 ngày.
- Ho t tính kháng sinh c ánh giá d a trên # l n c a vòng c ch Ph ơng pháp th màu: Khi có m!t vòng t o thành quanh các th&i th ch ( ng kính o anthraqinone trong c u trúc hóa h c, các b ng mm) [13].
- !c tính này c s d ng sơ b# sàng c c trên +a th ch tr c ó ã c c y vi l c các ch ng x khu n sinh anthracyclines sinh v t ki m nh.
- Nh& 25 /l h p t ơng ng v i lo i vi sinh v t ki m nh.
- dung d ch HCl (1N) ho!c NaOH (2N) vào Ho t tính kháng sinh c ánh giá b ng ng gi ng.
- Các thí nghi m c l!p l i hai l'n, d ch Phép th #c tính i v i m#t s dòng t môi tr ng nuôi c y ch a b sung vi sinh v t bào ung th c a ng i: Th nghi m này c c dùng làm i ch ng âm [14].
- Chi t d ch ngo i bào b ng ethyl acetate và Công ngh Vi t Nam theo ph ơng pháp c a Skehan và c#ng s và D ch nuôi x khu n trong môi tr ng u Likhiwitayawuid và c#ng s tóm t ơng d ch th c ly tâm 8000 vòng/phút t*t nh sau: trong 15 phút nhi t # phòng lo i t bào.
- Ba dòng t bào ung th , g m ung th gan B sung dung d ch ethyl acetate sao cho t t, (Hep-G2), ung th ph i (Lu) và ung th cơ vân l 1:1 (v:v) r i l*c h"n h p liên t c trong 1 gi tim (RD) c a vào +a 96 gi ng v i hàm [15].
- Vào ngày th 3 thay môi tr ng nuôi c y.
- Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên và Công nghệ c b ng máy c ELISA (ELISA reader) ki m nh i di n cho các nhóm vi sinh v t l n b c sóng 495 nm.
- Trong b c c a gi ng c x lý v i m$u nghiên c u và sàng l c sơ c p, 102 ch ng ã c l a ch n t ch ng âm (DMSO).
- N ng # c ch 50% b# s u t p 424 ch ng phân l p Cát Bà d a (IC50) c suy ra t ng cong phát tri n t trên tính kháng i v i ít nh t 1 trong 4 vi sinh bào và n ng # ch t th (ph'n tr m s ng sót so v t ki m nh.
- theo v i ph ơng pháp khuy ch tán có # chính xác cao hơn, 10 ch ng ã c ghi nh n là có 2.7.
- Các c i m hình thái ho t tính kháng vi sinh v t ki m nh cao (B ng 1).
- Ho t tính kháng sinh c a 10 ch ng x khu n ã mô t .
- Các !c i m hi n vi nh h s i cơ l a ch n sau b c sàng l c sơ c p và th c p ch t, hình thái s i khí sinh, c u trúc chu"i bào Ký Ho t tính kháng vi sinh v t ki m nh t c quan sát d i kính hi n vi ph n pha hi u ( ng kính vòng c ch , mm) (Carl-Zeiss) có n i máy nh và ph'n m m ch p ch ng E.
- K t qu sàng l c x khu n có ho t tính A kháng sinh A A Quá trình sàng l c tìm ki m các ch ng A x khu n có kh n ng sinh ch t kháng ung th A c ti n hành qua 3 b c, l'n l t g m (i) sàng l c sơ b# tính kháng i v i 4 loài vi sinh 10 ch ng c l a ch n này s.
- là cơ s v t ki m nh s d ng ph ơng pháp th&i th ch, ti n hành b c sàng l c tr c ti p v tính kháng (ii) sàng l c th c p tính kháng v i 4 loài vi i v i các dòng t bào ung th .
- V phân lo i, sinh v t ki m nh nh trên s d ng ph ơng c 10 ch ng u có các !c i m hình thái !c pháp khu ch tán và (iii) sàng l c tr c ti p tính tr ng c a Streptomyces nh khu n l c g m các kháng i v i 3 dòng t bào ung th .
- Nhi u s i khí sinh phát tri n m nh, màu tr*ng ho!c nghiên c u cho th y nhi u ho t ch t kháng ung vàng, cu ng sinh bào t hình xo*n ho!c chu"i.
- th c s n sinh t các ch ng x khu n có K t h p v i so sánh trình t o n gen 16S ho t tính kháng khu n cao [3], do v y trong rDNA (900 bp) c a 10 ch ng v i ngân hàng d% nghiên c u này chúng tôi ã s d ng 4 loài li u cho phép x p chúng vào chi Streptomyces.
- Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên và Công nghệ .
- Th nghi m thay i màu ph thu c pH M#t trong nh%ng nhóm kháng sinh có ngu n g c t Streptomyces hi n ang cs d ng i u tr nhi u lo i ung th là anthracycline.
- V i !c tính i màu khi pH môi tr ng chuy n t acid sang base, anthracycline có th c phát hi n tr c ti p trên môi tr ng nuôi c y b ng phép th màu (ph'n 2.6).
- Ph ơng pháp này ã c áp d ng i v i 10 ch ng x khu n l a ch n trên tìm ki m x Hình 1.
- S thay i màu s*c theo pH môi tr ng khu n sinh anthracycline.
- Trong 10 ch ng ch0 c a các ch ng A1018 và A1073.
- A: gi ng có pH có 2 ch ng A1018 và A1073 là th hi n d ơng acid.
- A16 - ch ng i ch ng sinh anthracyclin.
- i chi u v i ho t tính kháng vi sinh v t (B ng 1), chúng tôi nh n th y hai ch ng A1018 Có th th y r ng m c # i màu c a ch ng và A1073 u th hi n ho t tính kháng khu n A1018 rõ r t hơn so v i ch ng 1073, tuy nhiên cao, !c bi t i v i M.
- luteus ( i di n cho c hai ch ng u kém hơn so v i ch ng i nhóm vi khu n Gram d ơng), v i ng kính ch ng d ơng A16 ã c ch ng minh có ho t vòng c ch l n hơn 30 mm.
- T ơng t , ch ng tính sinh anthracycline (trao i cá nhân v i A1022 c)ng có ho t tính kháng khu n cao.
- v y ba ch ng này (A1018, A1022 và A1073) c l a ch n nghiên c u ho t tính kháng t bào ung th .
- Ho t tính ch ng ung th c a các ch ng có ho t tính kháng khu n cao Thí nghi m gây #c tính t bào v i 3 dòng t bào ung th c a ng i c ti n hành v i d ch chi t b ng ethyl acetate d ch nuôi t bào c a 3 ch ng A1018, A1022 và A1073.
- K t qu cho th y c 3 ch ng u có ho t tính c ch i v i v i c 3 dòng t bào ung th gan (Hep-G2), ung th ph i (Lu) và ung th cơ vân tim (RD) (B ng 2) m c # khác nhau.
- Thí nghi m s d ng i ch ng d ơng là ellipithine, m#t trong nh%ng ch t có kh n ng di t t bào.
- Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên và Công nghệ B ng 2.
- K t qu xác nh ho t tính gây #c t bào c a ba ch ng A1018, A1022 và A1073 TT M u Dòng t bào K t lu n Hep-G2 Lu RD Ph n tr m s ng sót.
- 1 Ch ng âm (DMSO Âm tính 2 Ch ng d ơng D ơng tính 3 A D ơng tính v i c 3 dòng 4 A D ơng tính v i c 3 dòng 5 A D ơng tính v i c 3 dòng Giá tr IC50 (µg/ml) 1 Ch ng d ơng D ơng tính 2 A D ơng tính v i c 3 dòng 3 A D ơng tính v i c 3 dòng 4 A D ơng tính v i c 3 dòng Ho t tính gây #c t bào c th hi n t bào bình th ng khác c'n c th nghi m thông qua ph'n tr m t bào s ng sót và IC50 thêm có th a ra k t lu n chính xác v ho t (trong tr ng h p này c hi u là n ng # tính gây #c t bào ba ch ng x khu n này.
- Trong ba ch ng thí nghi m, ch ng A1073 cho ho t tính c ch cao 3.3.
- K t qu phân tích HPLC hơn h1n so v i hai ch ng còn l i, t ơng ơng th m chí hơn so v i i ch ng d ơng.
- M c # Các ch t c ch t bào ung th 3 ch ng gây #c c a c 3 ch ng bi u hi n cao nh t i A1018, A1022 và A1073 c nghiên c u v i dòng RD – ung th cơ vân tim, sau n b c 'u qua s*c ký l&ng hi u n ng cao dòng Lu – ung th ph i và cu i cùng là dòng (HPLC).
- D ch nuôi t bào chi t b ng ethyl Hep-G2 – ung th gan.
- K t qu thu c cho acetate, lo i dung môi, sau ó hòa tan l i trong th y ba ch ng A1018, A1022 và A1073 có ti m DMSO c dùng phân tích HPLC.
- K t qu n ng cao trong vi c sinh kháng sinh ch ng ung s*c ký ch t chi t thô t d ch nuôi c a ba ch ng th .
- Tuy nhiên, m#t s dòng t bào ung th và A1018, A1022 và A1073 c trình bày b ng 3.
- T ng k t k t qu phân tích HPLC ch t chi t t d ch nuôi c a 3 ch ng có ho t tính di t t bào ung th M u B c sóng phân S l ng nh Th i gian xu t hi n c a % tích (nm) nh chính (phút A A N.Q.
- Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên và Công nghệ A Qua phân tích k t qu có th nh n th y nh sau.
- Hai ch ng A1018 và A1073 có ph n ng - V i m$u A1018: có th g m 8 ch t khác !c tr ng c a các x khu n sinh anthracycline.
- Sau HPLC, ch t chi t t ch ng A và 18.076.
- tách thành 8 0nh, t ch ng A1022 cho 5 0nh - V i m$u A1022: có th g m 5 ch t khác còn ch ng A1073 thì tách thành 6 0nh.
- chân thành c m ơn Vi n Vi sinh v t và Công Li u ó là các ch t gì và ch t nào quy t ngh sinh h c, HQGHN ã t o i u ki n nh ho t tính kháng t bào ung th là các câu trong quá trình th c hi n tài.
- 10 ch ng x khu n có ho t tính kháng vi [2] M.
- Donald, Antitumor activity sinh v t cao i v i ít nh t 2 trong 4 ch ng vi of common antibiotics against superficial bladder cancer.
- sinh v t ki m nh c sàng l c t b# x [3] O.
- Nduka, Modern Industrial Microbiology and khu n g m 424 ch ng phân l p t r ng qu c Biotechnology.
- Jose, Antitumor bp) các ch ng này c x p vào chi compounds from marine actinomycetes.
- Gewirtz, A critical evaluation of the - Ba ch ng A1018, A1022 và A1073 ã mechanism of action proposed for the antitumor c l a ch n nghiên c u tác d ng kháng t effects of the anthracycline antibiotics bào ung th ng i và u có tác d ng d ơng adriamycin and daunorubicin.
- tính v i c ba dòng t bào ung th là ung th [6] R.
- Weiss, The anthracyclines: will we ever gan (Hep-G2), ung th ph i (Lu) và ung th cơ find a better doxorubicin?.
- Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên và Công nghệ J