Nghiên cứu thu nhận peptide có hoạt tính chống tăng huyết áp và kháng khuẩn bằng phương pháp thủy phân protease từ bã nấm men bia

- LÂM THỊ HẢI YẾN NGHIÊN CỨU THU NHẬN PEPTIDE CÓ HOẠT TÍNH CHỐNG TĂNG HUYẾT ÁP VÀ KHÁNG KHUẨN BẰNG PHƯƠNG PHÁP THỦY PHÂN PROTEASE TỪ BÃ NẤM MEN BIA Chuyên ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC GS.TS ĐẶNG THỊ THU Hà Nội – Năm 2015 Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học Lâm Thị Hải Yến - 2013B i LỜI CẢM ƠN Trƣớc hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS.TS.
- Đặng Thị Thu, Viện Công nghệ Sinh học – Công nghệ Thực phẩm, trƣờng Đại học Bách Khoa Hà Nội đã tận tình trực tiếp hƣớng dẫn tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn.
- Trƣơng Quốc Phong - Trƣởng phòng Proteomics, Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, trƣờng Đại học Bách Khoa Hà Nội đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực tập và nghiên cứu.
- Xin chân thành cảm ơn Nghiên cứu sinh Phạm Thị Thu Hiền- Nghiên cứu viên Trung tâm Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm Hà Nội đã hỗ trợ, tạo điều kiện cho tôi thực hiện luận văn này.
- Nhân dịp này tôi cũng xin chân thành cảm ơn các Thầy, Cô trong Viện đã nhiệt tình giảng dạy và giúp đỡ trong quá trình học tập và nghiên cứu.
- Qua đây, tôi cũng xin chân thành cảm ơn các cán bộ phòng thí nghiệm viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, các bạn sinh viên, học viên, nghiên cứu sinh trƣờng Đại học Bách Khoa Hà Nội đã giúp đỡ tôi trong quá trình thí nghiệm.
- Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, ngƣời thân, bạn bè đã động viên giúp đỡ, tạo điều kiện để tôi hoàn thành luận văn.
- Tôi xin chân thành cảm ơn! Học Viên Lâm Thị Hải Yến Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học Lâm Thị Hải Yến - 2013B ii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: luận văn tốt nghiệp: “Nghiên cứu thu nhận peptide có hoạt tính chống tăng huyết áp và kháng khuẩn bằng phương pháp thủy phân protease từ bã nấm men bia” là kết quả nghiên cứu nhánh thuộc nhóm nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu công nghệ thủy phân protein từ bã nấm men bia thu một số peptide thấp phân tử có hoạt tính sinh học để ứng dụng làm thực phẩm chức năng”, đƣợc thực hiện dƣới sự hƣớng dẫn khoa học của GS.
- Đặng Thị Thu trƣờng Đại học Bách Khoa Hà Nội và Nghiên cứu sinh Nguyễn Thị Thu Hiền cùng sự giúp đỡ của tập thể các cán bộ nghiên cứu, nghiên cứu sinh, học viên, sinh viên đang học tập và làm việc tại Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển CNSH, Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, trƣờng Đại học Bách Khoa Hà Nội.
- Nội dung luận văn có tham khảo và sử dụng các tài liệu, thông tin đƣợc đăng tải trên các tác phẩm, tạp chí và trang web theo danh mục tài liệu kham khảo của luận văn.
- Hà Nội, ngày 20 tháng 10 năm 2015 Tác giả Lâm Thị Hải Yến Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học Lâm Thị Hải Yến - 2013B iii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ACE Angiotensin I Converting Enzyme ACEI Angiotensin-converting enzyme (ACE) inhibitors DPPH 1,1-diphenl-2-picrylhydrazyl ĐC Đối chứng FAPGG N-[3-(2-Furyl)acryloyl]- L -phenylalanyl-glycyl-glycine HHL Hippuryl-Histidyl-Leucine IC50 Inhibitory concentration 50% LB Lysogeny broth LC-MS/MS Liquid chromatography-mass spectrometry / mass spectrometry OPA O-Phthaladehyde RASS The renin-angiotensin-aldosterone system RT-HPLC Reversed-phase High-performance liquid chromatography SDS –PAGE Sodium dodecyl sulfate - polyacrylamide gel electrophoresis Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học Lâm Thị Hải Yến - 2013B iv DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH Hình Trang Hình 1.1.
- Biều đồ các hoạt tính sinh học của peptide được quan tâm nghiên cứu 8 Hình 1.3.
- Hệ thống Renin – angiotensin - aldosterone 10 Hình 1.4 : Minh họa cơ chế kháng nấm của peptide có hoạt tính sinh học 13 Hình 1.5.
- Sơ đồ thu nhận và tinh sạch ACEIPs từ dịch thủy phân casein 20 Hình 1.6.
- Đồ thị thể hiện số lượng các peptide được đưa vào nghiên cứu trung bình mỗi thập kỉ 22 Hình 1.7.
- Hình dạng tế bào nấm men saccharomyces cerevisiae 28 Hình 3.1.
- (A) Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến khả năng tạo peptide sinh học.
- (B) Điện di đồ sản phẩm thủy phân ở các nồng độ E/S khác nhau 46 Hình 3.2.
- (A) Ảnh hưởng của pH đến khả năng tạo peptide.(B) Điện di đồ của sản phẩm thủy phân ở các điểm pH khác nhau 48 Hình 3.4.
- (A) Ảnh hưởng của thời gian khả năng tạo peptide và Điện di đồ sản phẩm peptide ở thời điểm thủy phân khác nhau 50 Hình 3.6.
- Hàm kỳ vọng và điều kiện tối ưu để thủy phân bã men bia 55 Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học Lâm Thị Hải Yến - 2013B v Hình 3.7.
- Sơ đồ mô tả qui trình thu nhận peptide sinh học từ bã nấm men bia 56 Hình 3.8.
- Biểu đồ thể hiện hoạt tính kìm hãm ACE của peptide với các nồng độ khác nhau 58 Hình 3.9.
- Hình ảnh khuẩn lạc Salmolena Typhi sau 24h nuôi cấy so với mẫu đối chứng không bổ sung dịch peptide 61 Hình 3.10.
- 62 Hình 3.11 Phản ứng của dịch peptide làm giảm màu của thuốc thử DPPH 63 Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học Lâm Thị Hải Yến - 2013B vi DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Trang Bảng 1.1.
- Thành phần chất khô của men bia.
- Thành phần các amino acid thiết yếu trong nấm men bia 29 Bảng 3.1.
- Kết quả lựa chọn enzym thủy phân 45 Bảng 3.2.
- Ma trận thực nghiệm Box-Benken ba yếu tố và hàm lượng peptide thu được trong các điều kiện thủy phân khác nhau 51 Bảng 3.3.
- Kết quả đếm số lượng khuẩn lạc 60 Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học Lâm Thị Hải Yến - 2013B 1 MỤC LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT.
- Tổng quan về peptide có hoạt tính sinh học.
- Khái niệm peptide có hoạt tính sinh học.
- Hoạt tính sinh học của peptid.
- Hoạt tính kìm hãm ACE (Angiotensin Converting Enzyme Inhibitory.
- Hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm và virut.
- Peptide có hoạt tính chống oxy hóa.
- Peptide có hoạt tính chống ung thƣ.
- Các hoạt tính sinh học khác.
- Các nghiên cứu về peptide sinh học từ bã nấm men bia.
- Xu hƣớng nghiên cứu, sản xuất và sử dụng peptide có hoạt tính sinh học.
- Các phƣơng pháp tách, tinh sạch peptide có hoạt tính sinh học.
- Tổng quan về bã nấm men bia.
- Giới thiệu về nấm men Saccharomyces.
- Thành phần hóa học bã nấm men bia.
- Sản lƣợng bã nấm men bia và hiện trạng sử dụng tại Việt Nam.
- Một số ứng dụng của bã nấm men bia trên thế giới và ở Việt Nam.
- Vật liệu nghiên cứu.
- Bã nấm men Saccharomyces cerevisiae.
- Phƣơng pháp nghiên cứu.
- 33 Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học Lâm Thị Hải Yến - 2013B 2 2.2.1.
- Thủy phân bã nấm men bia và tinh sạch peptide.
- Phƣơng pháp xác định hoạt tính kìm hãm ACE.
- Phƣơng pháp xác định hoạt tính chống oxi hóa DPPH.
- Xác định hoạt tính kháng khuẩn bằng phƣơng pháp đếm khuẩn lạc.
- Tối ƣu hóa quá trình thủy phân bã nấm men bia theo phƣơng pháp quy hoạch thực nghiệm bậc hai Box-Benken sử dụng phần mềm Design Expert 7.1.5 (State-Ease, Inc., Minneapolis, Mỹ.
- Kết quả nghiên cứu lựa chọn enzyme thủy phân.
- Khảo sát ảnh hƣởng của pH đến quá trình thủy phân.
- Khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ tới quá trình thủy phân.
- Ảnh hƣởng của thời gian tới quá trình thủy phân bã nấm men bia.
- Tối ƣu hóa các điều kiện thủy phân bã nấm men bia theo phƣơng pháp quy hoạch bậc 2 Box-Behnken sử dụng phần mềm Design Expert 7.1.5.
- Xây dựng quy trình thủy phân giới hạn bã nấm men bia bằng protease thu peptide có hoạt tính sinh học.
- Nghiên cứu hoạt tính kìm hãm ACE ( chống tăng huyết áp.
- Khảo sát hoạt tính ức chế với vi khuẩn Salmolena Typhi và Listeria monocytogenes.
- Khảo sát hoạt tính chống oxi hóa của dịch peptide.
- 59 Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học Lâm Thị Hải Yến - 2013B 3 MỞ ĐẦU Peptide có hoạt tính sinh học (Bioactive peptide) là những peptide ngoài giá trị dinh dƣỡng còn có khả năng tác động tới chức năng sinh lý của cơ thể, giúp tăng cƣờng và nâng cao sức khỏe của con ngƣời nhƣ khả năng chống oxi hóa, kháng vi sinh vật, tác dụng kìm hãm enzyme chuyển hóa Angiotensin (ACE) chống tăng huyết áp [26], ngoài ra còn có khả năng điều hòa miễn dịch, chống đông máu [31] Peptide có hoạt tính sinh học có thể tách chiết từ các nguồn tự nhiên (động vật, thực vật), hoặc lên men bởi vi sinh vật, hoặc thủy phân giới hạn protein từ các nguồn khác nhau bởi protease.
- Các nghiên cứu về peptide có hoạt tính sinh học ở nƣớc ta mới chỉ dừng lại ở quy mô phòng thí nghiệm và khai thác chủ yếu trên đối tƣợng nguyên liệu từ sữa, đậu tƣơng.
- Trong khi nguồn bã men bia ở nƣớc ta rất rồi dào, chứa hàm lƣợng protein cao, giàu vitamin, đặc biệt là vitamin nhóm B và các khoáng chất, sẽ trở thành nguồn nguyên liệu tốt cho quá trình sản xuất peptide.
- Thủy phân giới hạn bã nấm men bia tạo peptide có hoạt tính sinh học bổ sung vào thực phẩm chức năng không những tận dụng đƣợc nguồn nguyên liệu bã thải, tạo sản phẩm có chất lƣợng cao mà còn giải quyết đƣợc vấn đề ô nhiễm môi trƣờng gây ra do lƣợng lớn bã men bia thải ra hàng năm.
- Chính vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu thu nhận peptide có hoạt tính chống tăng huyết áp và kháng khuẩn bằng phương pháp thủy phân protease từ bã nấm men bia”.
- Nghiên cứu xác định điều kiện thủy phân thích hợp (nhiệt độ, pH, thời gian, nồng độ enzym, nồng độ cơ chất) để thu peptide thấp phân tử.
- Tối ƣu hóa các điều kiện thủy phân - Xây dựng quy trình thu peptide có hoạt tính sinh học từ bã nấm men bia - Khảo sát một số hoạt tính sinh học: chống tăng huyết áp, kháng khuẩn và chống oxi hóa của peptide sinh học từ bã nấm men bia.
- Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học Lâm Thị Hải Yến - 2013B 4 PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1.
- Tổng quan về peptide có hoạt tính sinh học 1.1.1.
- Khái niệm peptide có hoạt tính sinh học Năm 1950, Mellander là ngƣời đầu tiên đƣa ra thuật ngữ peptide có hoạt tính sinh học khi ông nhận thấy các peptide bị phosphoryl hóa có nguồn gốc từ casein (protein sữa) hoạt động nhƣ chất mang các chất khoáng.
- Những nghiên cứu về peptide đã có những bƣớc tiến đáng kể trong vài thập niên gần đây.
- Cho đến nay đã có gần 2000 peptide có hoạt tính sinh học đƣợc tìm thấy từ các nguồn khác nhau.
- Những hoạt tính sinh học của peptide đƣợc các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu trong hai thập niên gần đây chủ yếu là có hoạt tính ức chế ACE, khả năng kháng khuẩn, kháng nấm, kháng virut, chống oxy hóa và chống ung thƣ.
- Mức độ nghiên cứu và sản xuất các peptide sinh học đƣợc thể hiện ở hình 1.2 sau.
- Biều đồ các hoạt tính sinh học của peptide được quan tâm nghiên cứu Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học Lâm Thị Hải Yến - 2013B 5 Peptide có hoạt tính sinh học (Bioactive peptide) là những peptide ngoài giá trị dinh dƣỡng còn có khả năng tác động tới chức năng sinh lý của cơ thể, giúp tăng cƣờng và nâng cao sức khỏe của con ngƣời [27] nhƣ khả năng chống oxi hóa, kháng vi sinh vật, chống tăng huyết áp, chống đông máu, khả năng điều hòa miễn dịch… 1.1.2.
- Hoạt tính sinh học của peptid .
- Hoạt tính kìm hãm ACE (Angiotensin Converting Enzyme Inhibitory) Bệnh cao huyết áp hiện nay là nguyên nhân hàng đầu dẫn đến tử vong, nhất là ở những ngƣời lớn tuổi.
- Sự ức chế ACE đƣợc coi là một liệu pháp hữu hiệu trong điều trị cao huyết áp.
- Rất nhiều chất ức chế ACE đƣợc tổng hợp bằng con đƣờng hóa học để giảm cao huyết áp nhƣ captopril, enalapril, alacepril và lisinopril.
- Vì vậy, trong khoảng hai thập kỷ gần đây, các nhà khoa học đã quan tâm nghiên cứu và sản xuất nhiều loại peptide ức chế ACE có nguồn gốc từ tự nhiên (thực vật, động vật và vi sinh vật) giúp giảm huyết áp mà ít gây các tác dụng phụ nhƣ trên.
- Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng miền C là quan trọng hơn cho việc điều chỉnh huyết áp và hoàn toàn chiếm vai trò quan trọng cho quá trình giảm huyết áp của sACE.
- Miền C có hằng số xúc Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học Lâm Thị Hải Yến - 2013B 6 tác cao hơn cho angiotensin I và các cơ chất không có hoạt tính sinh học, hippuryl histidyl-leucine (HHL) [3].
- Cơ chế tăng huyết áp: Những peptide có khả năng kìm hãm enzym chuyển hóa angiotensin có trong hệ thống điều hòa huyết áp của cơ thể ngƣời và cơ chế điều hòa đƣợc thông qua hệ thống renin – angiotensin nhƣ sau: Khi thể tích máu trong cơ thể ngƣời hạ thấp khiến huyết áp giảm, thận sẽ bài tiết enzym có tên là renin.
- Tiếp đến Angiotensin gây co mạch máu dẫn đến việc tăng huyết áp.
- Angiotensin II là chất có tác dụng sinh học cao của hệ renin-angiotensin, sẽ gắn lên các thụ thể nằm trên màng tế bào nội mô mao mạch, làm cho các tế bào này co thắt và mạch máu quanh chúng dẫn đến sự giải phóng aldosterone từ vùng cung ở thƣợng thận vỏ.
- Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học Lâm Thị Hải Yến - 2013B 7 Hình 1.3.
- Trong nọc rắn có các peptide ức chế ACE có từ 5-13 gốc amino acid trong phân tử, trong số đó có peptide Glu-Trp-Pro-Arg-Pro-Gln-Ile-pro-pro là có hoạt tính cao nhất in vivo.
- Do đó, ngƣời ta đã thay thế gốc Trp trong phân tử bằng gốc Phe để có đƣợc phân tử peptide bền hơn nhƣng vẫn có hoạt tính ức chế ACE mạnh.
- Những enzyme dùng để thủy phân từ những nguồn thực vật này thƣờng là các protease nhƣ alcalase, trypsin, chymotrypsin .
- Hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm và virut [34,36] Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học Lâm Thị Hải Yến - 2013B 8  Kháng khuẩn Cơ chế : Chúng thực hiện bằng cách kích thích sự tăng trƣởng của vi sinh vật có lợi trong đƣờng ruột có khả năng sinh tổng hợp các axit mạch ngắn (axit lactic, axit acetic) làm ức chế vi khuẩn gây hại, mặt khác hỗ trợ ức chế sự hoạt động của vi khuẩn gây bệnh bằng cách tấn công màng cytoplasmic của vi khuẩn làm phá vỡ liên kết màng hoặc ngăn cản quá trình hấp thu dinh dƣỡng nhƣ: Lactoferrin, Haptocorrin, Immunoglobulins.
- Loại thuốc này thể hiện hoạt tính kháng khuẩn tốt trong việc chống lại cả các vi khuẩn Gram âm và dƣơng.
- Cấu trúc của nó đƣợc làm sáng tỏ bởi Kopple vào năm 1971 và cấu trúc tinh thể cũng nhƣ các nghiên cứu khác cũng đã có trong các báo cáo của Drake vào năm 1991.
- Peptide này thể hiện hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm tốt.
- Các nghiên cứu chính để xác định cấu trúc và tổng hợp toàn bộ hợp Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học Lâm Thị Hải Yến - 2013B 9 chất này đã đƣợc W.
- Actinomycin D hay Dactinomycin thể hiện hoạt tính mạnh chống lại các vi khuẩn Gram dƣơng.
- Tuy nhiên, hàng loạt các nghiên cứu trong thập kỷ qua đã đƣa ra những cơ chế tác động mới bao gồm: Quá trình phân giải tế bào, liên kết ergosterol/cholesterol trong màng tế bào, sự tấn công của ty thể hoặc cơ quan nội bào khác và biến dạng của cấu trúc màng tế bào [26] Theo De Lucca và Walsh (1999), peptide kháng nấm có thể đƣợc phân thành 2 loại dựa vào cơ chế hoạt động của chúng gồm: peptide tấn công qua thành tế bào

Xem thử không khả dụng, vui lòng xem tại trang nguồn
hoặc xem Tóm tắt