- BÁO CÁO KẾT QUẢ THỰC HIỆN đỀ TÀI KHCN đẶC BIỆT CẤP đẠI HỌC QUỐC GIA Tên ựề tài: điều tra, nghiên cứu một số hoạt chất có khả năng kháng vi sinh vật và kháng dòng tế bào ung thư từ xạ khuẩn Mã số: QG. - Lịch sử phát triển kháng sinh 16 1.1.3. - Phân loại kháng sinh 18 1.1.4. - Kháng sinh kháng khối u 21 1.1.5. - Nhu cầu phát triển kháng sinh mới 21 1.2 Xạ khuẩn 22 1.2.1. - Phương pháp phân lập xạ khuẩn 25 2.2.2. - Sàng lọc xạ khuẩn sinh kháng sinh 27 2.2.4. - Sàng lọc chủng xạ khuẩn sinh anthracycline 29 2.2.7. - Các phương pháp phân loại xạ khuẩn 30 CHƯƠNG III. - đa dạng sinh học các chủng xạ khuẩn thu thập ựược ở Vườn Quốc gia Cát Bà 32 3.2. - Sàng lọc xạ khuẩn sinh kháng sinh 33 3.3. - Hiệu quả tách chiết dịch nuôi cấy các chủng xạ khuẩn chọn lọc ựược 35 3.4. - Phân tắch sắc ký dịch nuôi các chủng xạ khuẩn chiết trong ethyl acetate 36 3.4.1. - đặc ựiểm nhận dạng của các chủng xạ khuẩn chọn lọc ựược 42 3.5.1. - Giải trình tự rDNA 16S ựối với các chủng xạ khuẩn thuộc chi Nonomuraea 44 3.6. - Sàng lọc khả năng sinh anthracyline của các chủng xạ khuẩn chọn lọc ựược 45 3.7. - Tên ựề tài: điều tra, nghiên cứu một số hoạt chất có khả năng kháng vi sinh vật và kháng dòng tế bào ung thư từ xạ khuẩn 2. - Mục tiêu và nội dung nghiên cứu Nghiên cứu này nhằm tìm hiểu sự ựa dạng sinh học và sàng lọc các chủng xạ khuẩn có hoạt tắnh kháng vi sinh vật trong bộ sưu tập các chủng xạ khuẩn thu thập từ ựảo Cát Bà, một vườn quốc gia có ựa dạng sinh học cao ở Việt Nam. - Phân lập xạ khuẩn từ mẫu ựất và lá mục ở ựảo Cát Bà, Hải Phòng qua ựó ựánh giá mức ựộ ựa dạng của ựối tượng - Sàng lọc các chủng có hoạt tắnh kháng sinh cao - Tách chiết sơ bộ thu các chất có hoạt tắnh kháng sinh từ các chủng chọn lọc ựược - Nghiên cứu tắnh chất của các chất kháng sinh thu ựược bằng sắc ký bản mỏng (TLC) và sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC. - Phân loại, ựịnh danh các chủng xạ khuẩn (bằng mô tả hình thái hoặc bằng giải trình tự gene 16S của rDNA) có hoạt tắnh kháng sinh cao. - Kết quả về mặt khoa học - 424 chủng xạ khuẩn (gồm 353 chủng từ mẫu ựất và 71 chủng từ mẫu lá cây mục) thu thập tại vườn Quốc gia ựã ựược phân loại (bằng quan sát hình thái kết hợp với ựọc trình tự gene rDNA 16S) cho thấy gần 70% thuộc chi Streptomyces, còn lại thuộc nhóm xạ khuẩn hiếm. - 424 chủng xạ khuẩn này ựã ựược sàng lọc hoạt tắnh kháng sinh với 4 vi sinh vật kiểm ựịnh ựại diện cho 3 nhóm vi sinh vật lớn là vi khuẩn (Gram âm: Escherichia coli, Gram dương: Micrococcus luteus), nấm men (Candida albicans) và nấm sợi (Fusarium oxysporium. - Các chất tan trong ethyl acetate của dịch nuôi 17 chủng xạ khuẩn ựã ựược phân tắch sắc ký bản mỏng (TLC) ựể so sánh với ba kháng sinh là chloramphenicol, kitasamycin, erythromycin và với dịch nuôi của chủng ựối chứng sinh anthracycline (A16). - đây là phép thử ựặc hiệu ựối với các chủng sinh kháng sinh thuộc nhóm anthracycline. - Ớ Bước ựầu nghiên cứu sàng lọc kháng sinh chống ung thư từ xạ khuẩn thu thập ở vườn Quốc gia Cát Bà, Tạp chắ Khoa học và Công nghệ, đại học Quốc gia Hà Nội (ựã nhận ựăng). - Lê Hồng Anh 13 DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ HÌNH Danh mục bảng Bảng 1.1 Các nhóm kháng sinh theo cấu trúc hóa học Bảng 2.1 điều kiện phân tắch HPLC của các chất chuẩn Bảng 3.1 Sơ bộ phân loại các chủng xạ khuẩn phân lập ựược Bảng 3.2. - Hoạt tắnh kháng vi sinh vật của 17 chủng xạ khuẩn chọn lọc ựược Bảng 3.3. - Hiệu quả tách chiết dịch nuôi các chủng xạ khuẩn chọn lọc ựược Bảng 3.4. - Tổng kết kết quả phân tắch HPLC chất chiết từ các chủng xạ khuẩn chọn lọc ựược Bảng 3.5. - đánh giá hoạt tắnh kháng vi sinh vật của các chủng xạ khuẩn Hình 3.2. - Phổ TLC chất chiết từ dịch ngoại bào của các chủng xạ khuẩn chọn lọc ựược Hình 3.3. - Cây chủng loại phát sinh trình tự rDNA 16S cho thấy vị trắ của 7 chủng xạ khuẩn hiếm trong chi Nonomuraea Hình 3.7. - 1 Kháng sinh 1.1.1. - Hình 1.1 Kháng sinh ựược phát hiện qua các năm (Hopwood, 2007). - Một số trường hợp kháng sinh ựược phân loại dựa trên vi sinh vật sản sinh ra kháng sinh ựó. - Ngược lại một kháng sinh cũng có thể do nhiều vi sinh vật sinh ra. - Sau ựây là một số nhóm kháng sinh thông dụng: a. - Nhu cầu phát triển kháng sinh mới Hình 1.3. - 1.2 Xạ khuẩn 1.2.1 Các ựặc ựiểm chung Xạ khuẩn là một nhóm vi sinh vật rất ựa dạng trong ựó ựa số sinh trưởng hiếu khắ và tạo khuẩn ty phân nhánh tương tự như nấm. - Xạ khuẩn là vi khuẩn Gram dương có tỷ lệ G+C cao (>55%) trong DNA. - Xạ khuẩn thường ựược chia thành hai loại: Streptomyces và không phải Streptomyces (non-Streptomyces). - Hai phần ba kháng sinh ựã biết ựược sinh ra bởi xạ khuẩn chủ yếu từ các loài Streptomyces (Miyadoh, 1997). - Các hợp chất kháng sinh khác nhau của xạ khuẩn ựã ựược nghiên cứu ựặc ựiểm gồm aminoglycoside, anthracyclin, glycopeptide, β-lactam, macrolides, nucleoside, peptide, polyene, polyeste, polyketide, actinomycin và tetracycline (Goodfellow et al., 1988). - Cho ựến nay chưa thấy công trình nào ựề cập ựến kháng sinh kháng ung thư có nguồn gốc từ xạ khuẩn ở Việt Nam. - Nội dung và mục ựắch của nghiên cứu Nghiên cứu này nhằm tìm hiểu sự ựa dạng sinh học và sàng lọc các chủng xạ khuẩn có hoạt tắnh kháng vi sinh vật trong bộ sưu tập các chủng xạ khuẩn thu thập từ ựảo Cát Bà, một vườn quốc gia có ựa dạng sinh học cao ở Việt Nam. - đối tượng nghiên cứu Các chủng xạ khuẩn phân lập từ các mẫu ựất và rác thu thập từ Cát Bà năm 2008 là ựối tượng nghiên cứu của ựề tài này. - Phương pháp phân lập xạ khuẩn Hai phương pháp phân lập ựã ựược sử dụng trong ựề tài là phương pháp sấy khô (Nonomura et al, 1969) và phương pháp ly tâm-hoàn ẩm (rehydrationỜcentrifugation) (Hayakawa et al, 2000). - Phương pháp ly tâm-hoàn ẩm (RC) là một phương pháp phân lập ựặc hiệu với xạ khuẩn ựộng. - Tất cả các chủng xạ khuẩn phân lập bằng hai phương pháp nói trên ựều ựược lưu giữ ở -80ồC trong dung dịch glycerol 20% tại Bảo tàng giống chuẩn vi sinh vật (Vietnam Type Culture Collection-VTCC), Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học, đại học Quốc gia Hà Nội. - 26 2.2.3 Sàng lọc xạ khuẩn sinh kháng sinh Trước tiên, tất cả các chủng xạ khuẩn ựược hoạt hóa trong ựĩa môi trường YS ở 30ồC trong 3Ờ4 ngày. - Phương pháp thỏi thạch Các mảnh thạch có ựường kắnh 5 mm ựược cắt từ ựĩa môi trường YS có chủng xạ khuẩn mọc rất tốt ựược ựặt lên bề mặt các ựĩa thạch trước ựó ựã ựược cấy vi sinh vật kiểm ựịnh và nuôi trong ựiều kiện thắch hợp trong 2 ngày. - 2.2.4 Chiết bằng ethyl acetate Dịch nuôi cấy của các chủng xạ khuẩn trong môi trường ựậu tương lỏng sau ly tâm (ở 8000 vòng/phút trong 15 phút ở nhiệt ựộ phòng) loại bỏ tế bào ựược tách chiết theo mô tả của Guoliang Yin và cộng sự với một số thay ựổi cho phù hợp (Guoliang Yin và cs, 2010). - 2.2.6 Sàng lọc chủng xạ khuẩn sinh anthracycline Khả năng sinh anthracycline của các chủng xạ khuẩn ựược sàng lọc bằng phép thử màu. - đặc tắnh này ựược dùng ựể sơ bộ sàng lọc 29 các chủng sinh anthracycline trong số các chủng xạ khuẩn phân lập ựược (Trease G. - Cách tiến hành như sau: ựục 2 giếng nhỏ trên ựĩa thạch trước ựó ựã ựược nuôi xạ khuẩn (khoảng 4 Ờ 5 ngày tuổi). - Phép thử ựộc tế bào Khả năng gây ựộc tế bào của các chất chiết ựược từ dịch nuôi xạ khuẩn ựược xác ựịnh theo phương pháp của Skehan và cộng sự (1990) và Likhiwitayawuid và cộng sự (1993) hiện ựang ựược áp dụng tại Viện Nghiên cứu ung thư quốc gia (Hoa Kỳ) và trường Dược, đại học Illinois, Chicago (Hoa Kỳ). - Các dòng tế bào này ựược cho vào ựĩa 96 giếng (mỗi giếng chứa 2x103 tế bào) rồi cho chất cần thử (ở ựây là chất chiết từ dịch nuôi xạ khuẩn như ựã mô tả ở 2.2.4. - Các phương pháp phân loại xạ khuẩn a. - Atlas hình thái xạ khuẩn (Gernot, 1997) và Sổ tay nhận dạng xạ khuẩn (Identification Manual of Actinomycetes) (Miyadoh et al, 2001) ựược dùng ựể 30 tham khảo về ựặc ựiểm phân loại. - Bằng sinh học phân tử Tách chiết DNA DNA genome của các chủng xạ khuẩn ựược tách chiết theo phương pháp ựã ựược Marmur (1961) và Saito (1963) mô tả với một số cải tiến. - Nhằm góp phần nghiên cứu về nhóm xạ khuẩn có ở ựảo Cát Bà, ựề tài ựã tiến hành phân lập xạ khuẩn theo hai phương pháp khác nhau như ựã mô ở chương II. - Qua ựó ựã phân lập ựược 424 chủng xạ khuẩn từ các mẫu ựất và lá cây mục thu tại Cát Bà. - Tiếp theo, các chủng xạ khuẩn phân lập ựược ựã ựược phân loại theo hình thái ựể phân thành 2 nhóm Streptomyces và non-Streptomyces (xạ khuẩn hiếm) (Bảng 3.1). - Ngược lại, các chủng xạ khuẩn hiếm (non-Streptomyces) mọc chậm, khuẩn lạc nhỏ, khó phân lập và nuôi cấy. - 3.2 Sàng lọc xạ khuẩn sinh kháng sinh để sàng lọc các chủng sinh kháng sinh, 4 chủng vi sinh vật ựại diện cho vi khuẩn Gram âm và dương. - Qua ựó cho thấy trong 424 chủng xạ khuẩn nghiên cứu chỉ có 115 chủng 33 (chiếm khoảng 27,12%) cho hoạt tắnh ựáng kể kháng ắt nhất một trong bốn vi sinh vật kiểm ựịnh. - đánh giá hoạt tắnh kháng vi sinh vật của các chủng xạ khuẩn Một số hình ảnh tiêu biểu minh họa cho phương pháp khuếch tán dịch nuôi cấy. - Hoạt tắnh kháng vi sinh vật của 17 chủng xạ khuẩn chọn lọc ựược Chủng Hiệu quả ức chế vi sinh vật kiểm ựịnh (ựường kắnh vòng kìm hãm, mm) E. - Hiệu quả tách chiết dịch nuôi cấy các chủng xạ khuẩn chọn lọc ựược 17 chủng chọn lọc ựược ựã ựược tiến hành nuôi cấy lỏng và sơ bộ tách chiết dịch ngoại bào ựể tiến hành các phân tắch tiếp theo. - So với chất khô thì lượng chất tan này chiếm từ 0,5% ựến gần 15% tùy theo từng chủng xạ khuẩn. - Hiệu quả tách chiết dịch nuôi các chủng xạ khuẩn chọn lọc ựược (từ 1 lắt dịch nuôi ựã loại tế bào) TT Chủng Chất khô (gam) Chất tan trong Phần trăm so với ethyl acetate (mg) chất khô. - Phân tắch sắc ký dịch nuôi các chủng xạ khuẩn chiết trong ethyl acetate 3.4.1. - Phổ TLC chất chiết từ dịch ngoại bào của các chủng xạ khuẩn chọn lọc ựược. - đặc ựiểm nhận dạng của các chủng xạ khuẩn chọn lọc ựược đối với nghiên cứu về vi sinh vật, việc ựịnh loại là hết sức quan trọng. - 3.5.1 đặc ựiểm hình thái của các chủng thuộc Streptomyces Như ựã trình bày, các chủng xạ khuẩn phổ biến (Streptomyces) có ựặc ựiểm hình thái ựiển hình có thể dùng ựể nhận dạng [11], [29]. - phương pháp sinh học phân tử (giải trình tự và so sánh 16S rDNA ựã ựược dùng ựể phân biệt các chủng thuộc nhóm xạ khuẩn hiếm. - điều thú vị là cả 7 chủng thuộc nhóm xạ khuẩn hiếm chọn lọc ựược lại cùng thuộc chi Nonomuraea. - Tóm lại, mặc dù bộ sưu tập xạ khuẩn từ Cát Bà có mức ựộ ựa dạng về phân loại nhưng các chủng có hoạt tắnh kháng vi sinh vật cao chỉ thuộc về hai chi Streptomyces và Nonomuraea. - Sàng lọc khả năng sinh anthracycline của các chủng xạ khuẩn chọn lọc ựược Một trong những nhóm kháng sinh có nguồn gốc từ xạ khuẩn hiện ựang ựược sử dụng ựể ựiều trị nhiều loại ung thư là anthracycline. - Sau khoảng 20 phút quan sát màu sắc quanh các giếng ựể có kết luận bước ựầu về kháng sinh mà chủng xạ khuẩn ựó sinh ra. - Như vậy, rất có thể hợp chất do hai chủng xạ khuẩn này sinh ra thuộc nhóm kháng sinh anthracycline. - Hoạt tắnh gây ựộc tế bào Như vậy, qua các nghiên cứu ở trên có ba chủng xạ khuẩn ựược thấy là có tiềm năng sinh chất kháng sinh kháng ung thư là A1018, A1022 và A1073. - 424 chủng xạ khuẩn ựã ựược phân lập tại Vườn Quốc gia Cát Bà với 353 chủng (83.25%) từ ựất và 71 chủng (16.75%) từ mẫu lá cây mục. - Tách chiết chất kháng sinh từ chủng xạ khuẩn Streptomyces hygroscopicus TC-54 có hoạt tắnh cao chống nấm gây bệnh, Tạp chắ Sinh học, tập 25-số 2A, trang 85-91 2. - Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy xạ khuẩn Streptomyces sp. - Phân lập và tuyển chọn xạ khuẩn sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh thực vật, Tạp chắ Khoa học, T. - Nghiên cứu khả năng sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh thực vật ở 2 chủng xạ khuẩn T41, D42, Tạp chắ Di truyền và Ứng dụng, tr 50-55, T-4 6. - đặc ựiểm phân loại và khả năng sử dụng dầu mỏ của một số chủng xạ khuẩn phân lập từ nhiên liệu JET-A1 ở Việt Nam, Tạp chắ Khoa học và Công nghệ, XXXVI, 6B, tr.64-69 8. - Tuyển chọn và ựịnh loại một số chủng xạ khuẩn có khả năng ựối kháng vi sinh vật gây nhiễm trùng bệnh viện. - Tắnh ựối kháng của xạ khuẩn phân lập từ ựất Việt Nam ựối với bệnh ựạo ôn. - Nghiên cứu khả năng sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh ựạo ôn của một số chủng xạ khuẩn (Streptomyces) phân lập ở Việt Nam. - Ảnh hưởng của môi trường lên men lên khả năng sinh tổng hợp kháng sinh chống nấm gây bệnh thực vật của chủng xạ khuẩn 5820. - Ứng dụng công nghệ sinh học trong nghiên cứu sản xuất kháng sinh nhóm b-lactam. - Khảo sát xạ khuẩn sinh kháng sinh thuộc chi Micromonospora từ ựất bùn Thừa Thiên Huế. - Khảo sát xạ khuẩn sinh kháng sinh thuộc chi Micromonospora từ ựất bùn ở Bình Trị Thiên. - Phân lập chủng xạ khuẩn sinh kháng sinh từ một số mẫu ựất bùn ở Thừa Thiên Huế. - Kết quả phân tắch HPLC chất chiết từ dịch nuôi các chủng chọn lọc ựược với các ựiều kiện tương ứng với các kháng sinh chuẩn 67 Phụ lục 4. - 424 chủng xạ khuẩn (gồm 353 chủng từ mẫu ựất và 71 chủng từ mẫu lá cây mục) thu thập tại vườn Quốc gia ựã ựược phân loại. - 71 - 424 chủng xạ khuẩn ựã ựược sàng lọc hoạt tắnh kháng sinh với 4 vi sinh vật kiểm ựịnh cho thấy trong ựó có 115 chủng biểu hiện hoạt tắnh kháng ắt nhất một trong bốn vi sinh vật kiểm ựịnh. - Các chất tan trong ethyl acetate của dịch nuôi 17 chủng xạ khuẩn ựã ựược phân tắch sắc ký bản mỏng (TCL) ựể so sánh với ba kháng sinh là chloramphenicol, kitasamycin, erythromycin và với dịch nuôi của chủng ựối chứng sinh anthracycline (A16)