- NGUYỄN ĐÌNH TRÁNG PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC VI KHUẨN NITRAT HÓA CÓ KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG TRONG XỬ LÝ NƯỚC THẢI CHĂN NUÔI SAU BIOGAS LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT Chuyên ngành: Công nghệ sinh học NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. - Vai trò của vi sinh vật có khả năng chuyển hóa các hợp chất chứa nitơ và vi khuẩn nitrat hóa trong loại bỏ nitơ sinh học trong nước thải. - Tình hình nghiên cứu vi khuẩn nitrat hóa tại Việt Nam trong thời gian gần đây. - Phương pháp phân lập chủng vi khuẩn có khả năng nitrat. - Nghiên cứu, xác định đặc điểm hình thái khuẩn lạc, hình thái tế bào và một số đặc điểm sinh hóa của chủng vi khuẩn được phân lập. - Khảo sát khả năng ứng dụng chủng vi khuẩn N4 và chủng vi khuẩn N7 trong xử lý nước thải chăn nuôi sau biogas. - Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn có khả năng nitrit và nitrat hóa. - Phân lập chủng vi khuẩn có khả năng nitrit hóa. - Tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng ôxy hóa amoni (nitrit hóa. - Phân lập vi khuẩn có khả năng oxy hóa nitrit thành nitrat. - Tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng oxy hóa nitrit thành nitrat. - Định danh và xác định độ an toàn của chủng vi khuẩn được tuyển chọn. - Đánh giá mức độ an toàn sinh học của chủng vi khuẩn N4 và chủng vi khuẩn N7. - Khảo sát ảnh hưởng một số điều kiện nuôi cấy tới sự sinh trưởng và phát triển của chủng vi khuẩn N4 và chủng vi khuẩn N7. - Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và hình thái tế bào của các chủng vi khuẩn được phân lập. - Đặc điểm khuẩn lạc và hình thái tế bào của 3 chủng vi khuẩn được phân lập. - Mức độ tương đồng và thông tin định danh chủng vi khuẩn N4. - Đặc tính sinh hóa của chủng vi khuẩn N4. - Mức độ tương đồng và định danh chủng vi khuẩn N7. - Một số đặc tính sinh hóa của chủng vi khuẩn N7. - Hiệu suất chuyển hóa amoni của các chủng vi khuẩn N1. - Sự thay đổi hàm lượng nitrit và hàm lượng nitrat trong môi trường nuôi cấy chủng vi khuẩn N5. - Sự thay đổi hàm lượng amoni và nitrit trong nuôi cấy chủng vi khuẩn N7. - Sự phát triển chủng vi khuẩn N4 theo thời gian nuôi cấy. - Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến khả năng sinh trưởng của chủng vi khuẩn N4. - Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến khả năng sinh trưởng của chủng vi khuẩn N7. - 55 chủng vi khuẩn N4. - Ảnh hưởng của pH môi trường đến khả năng sinh trưởng của chủng vi khuẩn N7. - Hiệu suất chuyển hóa amoni của chủng vi khuẩn N4 và chủng vi khuẩn N7 trong nước thải chăn nuôi sau biogas. - Sự thay đổi hàm lượng nitrit và nitrat trong nước thải chăn nuôi biogas với thí nghiệm có bổ sung chủng vi khuẩn N4. - N7 và không bổ sung chủng vi khuẩn N4. - Sự thay đổi hàm lượng amoni trong nước thải khi bổ sung chủng vi khuẩn N4 và chủng vi khuẩn N7. - Sự thay đổi hàm lượng nitrit và hàm lượng nitrat trong mẫu nước thải khi bổ sung chủng vi khuẩn N4 và chủng vi khuẩn N7. - Luận văn thạc sĩ kỹ thuật Công nghệ sinh học Nguyễn Đình Tráng CNSH2014B Page 2 Mục tiêu nghiên cứu: Phân lập, tuyển chọn một số chủng vi khuẩn có khả năng chuyển hóa amoni, chuyển hóa nitrit nhằm ứng dụng trong xử lý nước thải chăn nuôi sau biogas. - Phân lập, tuyển chọn một số chủng vi khuẩn có khả năng chuyển hóa amoni trong nước thải. - Phân lập, tuyển chọn một số chủng vi khuẩn có khả năng chuyển hóa nitrit trong nước thải. - Định danh và xác định độ an toàn sinh học của chủng vi khuẩn được tuyển chọn 4. - Khảo sát khả năng chuyển hóa các hợp chất chứa nitơ trong nước thải của chủng vi khuẩn. - Trên môi Luận văn thạc sĩ kỹ thuật Công nghệ sinh học Nguyễn Đình Tráng CNSH2014B Page 19 trường lỏng, quá trình phát triển của vi khuẩn thuộc chi Nitrosomonas trải qua một số giai đoạn và phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện môi trường [29]. - 1977 Luận văn thạc sĩ kỹ thuật Công nghệ sinh học Nguyễn Đình Tráng CNSH2014B Page 20 Giá trị pH thích hợp cho nhóm vi khuẩn Nitrosomonas là từ 7,8 đến 8, Nitrobacter là từ 7,3 đến 7,5. - Sự Luận văn thạc sĩ kỹ thuật Công nghệ sinh học Nguyễn Đình Tráng CNSH2014B Page 22 duy trì trong thời gian dài của kiểu vi khuẩn nitrat hóa dị dưỡng Pantotrophus GB17, gây ra một sự mất dần dần hoạt động nitrat hóa dị dưỡng của nó [47]. - Thành phần môi trường HNM1 nuôi cấy chủng vi khuẩn bao gồm các thành phần như dưới đây: (g/l) [60]. - Quan sát ở vật kính 100x: Vi khuẩn Gram. - Chuẩn bị thuốc thử: Para-dimethyl-amino-benzaldehyde 8g Luận văn thạc sĩ kỹ thuật Công nghệ sinh học Nguyễn Đình Tráng CNSH2014B Page 32 Etanol 95% 760 ml HCl đặc 160 ml + Cấy vi khuẩn mới hoạt hoá (18-24 giờ), đặt ở nhiệt độ thích hợp và làm phép thử tại các thời điểm ngày. - Luận văn thạc sĩ kỹ thuật Công nghệ sinh học Nguyễn Đình Tráng CNSH2014B Page 33 Cấy vi khuẩn mới hoạt hoá (18-24 giờ). - Khảo sát khả năng ứng dụng chủng vi khuẩn Microbacterium esteraromaticum N4 và chủng vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens HN N7 trong xử lý nước thải chăn nuôi sau biogas. - Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn có khả năng nitrit và nitrat hóa 3.2.1. - Bảng 3.2 cho thấy rằng, bốn chủng vi khuẩn được phân lập N1. - 1mm), chủng N1 là chủng vi khuẩn gram âm, tế bào ngắn, dạng trực khuẩn, hai chủng N3. - Sau Luận văn thạc sĩ kỹ thuật Công nghệ sinh học Nguyễn Đình Tráng CNSH2014B Page 40 quá trình nuôi cấy, khảo sát khả năng nitrit hóa của bốn chủng vi khuẩn bao gồm: N1, N2, N3, N4, kết quả được biểu diễn qua hình 3.2. - Sau 8 ngày nuôi cấy, hàm lượng amoni NH4+_N cuối cùng trong môi trường nuôi cấy từng chủng vi khuẩn N1. - Như vậy, ở ba chủng vi khuẩn N1. - N4 (A – sự thay đổi gây ra bởi chủng vi khuẩn N1. - B – sự thay đổi gây ra bởi chủng vi khuẩn N2. - C – sự thay đổi gây ra bởi chủng vi khuẩn N3. - D – sự thay đổi gây ra bởi chủng vi khuẩn N4) Hình 3.2 biểu thị rằng, sau 8 ngày nuôi cấy thì hàm lượng nitrit có sự gia tăng trong môi trường nuôi cấy. - Chủng vi khuẩn Luận văn thạc sĩ kỹ thuật Công nghệ sinh học Nguyễn Đình Tráng CNSH2014B Page 42 N4 cho thấy khả năng oxy hóa amoni và tạo nitrit nhiều nhất, nhanh nhất trong 4 chủng vi khuẩn được nghiên cứu. - Như vậy, chủng vi khuẩn N4 vừa có khả năng oxy hóa amoni mạnh nhất và vừa chuyển hóa hàm lượng amoni thành dạng nitrit nhiều nhất. - Như vậy chủng vi khuẩn N4 không có khả năng oxi hóa nitrit đến nitrat. - Tóm lại, qua khảo sát khả năng oxy hóa amoni thành nitrit của 4 chủng vi khuẩn được phân lập là: N1. - N4, cho thấy chủng vi khuẩn N4 có khả năng nitrit hóa cao nhất, và chủng này không có khả năng chuyển hóa nitrit thành nitrat. - Đặc điểm khuẩn lạc và hình thái tế bào của 3 chủng vi khuẩn N5. - Luận văn thạc sĩ kỹ thuật Công nghệ sinh học Nguyễn Đình Tráng CNSH2014B Page 44 Bảng 3.3 cung cấp thông tin rằng, bốn chủng vi khuẩn được phân lập đều có khuẩn lạc kích thước nhỏ. - Tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng oxy hóa nitrit thành nitrat Khả năng ôxy hóa nitrit thành nitrat thể hiện qua sự thay đổi hàm lượng nitrit NO2-_N và hàm lượng nitrat NO3-_N trong môi trường nuôi cấy. - Sau quá trình nuôi cấy, khảo sát khả năng ôxy hóa nitrit của ba chủng vi khuẩn N5. - N7 Luận văn thạc sĩ kỹ thuật Công nghệ sinh học Nguyễn Đình Tráng CNSH2014B Page 45 (A – hiệu xuất chuyển hóa nitrit của 3 chủng vi khuẩn N5. - B –sự thay đổi gây ra bởi chủng vi khuẩn N5. - C – sự thay đổi gây ra bởi chủng vi khuẩn N6. - D – sự thay đổi gây ra bởi chủng vi khuẩn N7) Kết quả cho thấy, sau 8 ngày nuôi cấy ba chủng vi khuẩn N5. - Với mục đích nghiên cứu ứng dụng chủng vi khuẩn N7 hiệu quả hơn, đề tài thực hiện khảo sát khả năng chuyển hóa amoni thành nitrit của chủng vi khuẩn N7 trên môi trường HNM1. - Sự thay đổi hàm lượng amoni và nitrit trong nuôi cấy chủng vi khuẩn N7 Luận văn thạc sĩ kỹ thuật Công nghệ sinh học Nguyễn Đình Tráng CNSH2014B Page 46 (hình A- hiệu suất chuyển hóa amoni. - hình B – sự thay đổi hàm lượng amoni và nitrit) Hình 3.4 cho thấy rằng, chủng vi khuẩn N7 có khả năng chuyển hóa amoni thành nitrit. - đồng thời hàm lượng nitrit tạo ra là 81,89 mg/l, các giá trị này đều thấp hơn so với khả năng chuyển hóa amoni và tạo hàm lượng nitrit của chủng vi khuẩn N4. - Tóm lại, qua khảo sát khả năng oxy hóa nitrit thành nitrat của 3 chủng vi khuẩn được phân lập N5. - cho thấy chủngvi khuẩn N7 có khả năng nitrit hóa cao nhất, đồng thời chủng vi khuẩn này cũng có khả năng chuyển hóa amoni thành nitrit. - Với những ưu thế này, chủng vi khuẩn N7 được lựa chọn cho quá trình nghiên cứu tiếp theo. - Mức độ tương đồng và thông tin định danh chủng vi khuẩn N4 Chủng Mức tương đồng. - Trình tự đoạn 16S rRNA của chủng vi khuẩn N7 CTAGTGTGGTGAGGGTAATCGGCCTCCACCCAGGCGACCGATGCGCGTAGGCGACCTGAGAAGGTGATCGGCCACACTTGGACTGGGACACGGCCCAGACTCCTAACGGGAGGGCAGGCAGTAAGGATCCTCGCAATTGACGAAAGTTCTGACCGGAGCAACGCCGCGTGAGGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGTTCAAATAGGGCGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAG Luận văn thạc sĩ kỹ thuật Công nghệ sinh học Nguyễn Đình Tráng CNSH2014B Page 50 GAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGGCAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTTGGAGCCAGCCGCCGAAGTGTACAGATATGGAGCC Kiểm tra độ tương đồng trên ngân hàng gen thế giới bằng chương trình Blast của cơ sở dữ liệu NCBI. - Mức độ tương đồng và định danh chủng vi khuẩn N7 Chủng Mức tương đồng. - Khảo sát ảnh hưởng một số điều kiện nuôi cấy tới sự sinh trưởng và phát triển của chủng vi khuẩn N4 và chủng vi khuẩn N7 3.4.1. - Chủng vi khuẩn N4. - Sự phát triển chủng vi khuẩn N4 theo thời gian nuôi cấy, Hình 3.8. - Sự phát triển của chủng N7 theo thời gian nuôi cấy Luận văn thạc sĩ kỹ thuật Công nghệ sinh học Nguyễn Đình Tráng CNSH2014B Page 54 Kết quả cho thấy sau 36 giờ nuôi cấy, quần thể chủng vi khuẩn N4 kết phúc pha sinh trưởng, bước vào pha cân bằng. - pH nuôi cấy Để xác định pH thích hợp cho nuôi cấy thu sinh khối chủng vi khuẩn N4. - 9, nhiệt độ nuôi cấy chủng vi khuẩn N4. - Ảnh hưởng của pH môi trường đến khả năng sinh trưởng của chủng vi khuẩn N4 Luận văn thạc sĩ kỹ thuật Công nghệ sinh học Nguyễn Đình Tráng CNSH2014B Page 56 Kết quả cho thấy chủng N4 sinh trưởng tốt nhất trong điều kiện pH=7, đồng thời mật độ tế bào đạt ≥109 cfu/ml. - Và điều kiện phù hợp cho chủng vi khuẩn N7 đạt sinh khối lớn nhất là ở nhiệt độ 300C. - Hai chủng vi khuẩn N4 và chủng vi khuẩn N7 được bổ sung vào nước thải chăn nuôi sau biogas và khảo sát sự thay đổi của hàm lượng amoni, nitrit và Luận văn thạc sĩ kỹ thuật Công nghệ sinh học Nguyễn Đình Tráng CNSH2014B Page 57 nitrat. - Sau 8 ngày khảo sát, chủng vi khuẩn N7 cho hiệu quả chuyển hóa amoni là 50,45%, tương ứng với hàm lượng amoni còn lại trong nước thải là 84.23 mg/l. - chủng vi khuẩn N4 cho thấy khả năng thích ứng nhanh với môi trường và hiệu suất chuyển hóa amoni cao hơn, đạt 86.35%, hàm lượng amoni còn lại là 23.2 mg/l. - Như vậy, việc bổ sung các chủng vi khuẩn nitrat hóa đã cải thiện tốt hiệu quả chuyển hóa amoni. - N7 Hình 3.14 cho thấy rằng, sau 8 ngày tiến hành khảo sát, ở mẫu thí nghiệm đối chứng (không được bổ sung chủng vi khuẩn N4. - Như vậy, việc bổ sung chủng vi khuẩn N7 cho thấy hiệu quả trong xử lý nitơ cụ thể là chuyển hóa hàm lượng amoni tới dạng nitrat trong mẫu nước thải sau chăn nuôi. - Hai chủng vi khuẩn N4 và chủng vi khuẩn N7 được bổ sung vào nước thải chăn nuôi sau biogas và đánh giá sự biến động của hàm lượng amoni, nitrit và nitrat. - Hình 3.15 biểu diễn hiệu suất chuyển hóa amoni bởi 2 chủng vi khuẩn N4. - Hàm lượng amoni còn lại này cho thấy giá trị cao hơn với thí nghiệm bổ sung đơn chủng vi khuẩn N4 (N_NH4+ còn lại = 23.2 mg/l). - Từ mẫu nước thải chăn nuôi sau biogas, đã phân lập được 4 chủng vi khuẩn có khả năng nitrit hóa (chủng N1. - 3 chủng vi khuẩn có khả năng oxy hóa nitrit (chủng N5. - chủng vi khuẩn N7 có khả năng oxy hóa nitrit mạnh nhất đạt hiệu suất chuyển hóa nitrit là 88.39. - N1 N2 N3 N Luận văn thạc sĩ kỹ thuật Công nghệ sinh học Nguyễn Đình Tráng CNSH2014B Page 71 Phụ lục 3: Đường chuẩn tương quan giữa hàm lượng nitrit và giá trị OD Đường chuẩn tương quan giữa hàm lượng nitrit và giá trị OD NO2- mg/l OD 520nm Phụ lục 4: Hiệu suất chuyển hóa nitrit của 3 vi khuẩn N5
Xem thử không khả dụng, vui lòng xem tại trang nguồn hoặc xem
Tóm tắt