- Đố i t ượ ng nghiên c ứ u - Ch ủ ng vi khu ẩ n đượ c cung c ấ p t ừ đề tài c ấ p nhà n ướ c thu ộ c ch ươ ng trình công ngh ệ sinh h ọ c "T ạ o ch ế ph ẩ m vi sinh có tính kháng vi khu ẩ n gây b ệ nh gan th ậ n m ủ ( Edwardsiella ictaluri ) trên cá tra nuôi ( Pangasianodon hypophthalmus. - đ ang th ự c hi ệ n t ạ i Vi ệ n nghiên c ứ u nuôi tr ồ ng thu ỷ s ả n II trong 3 n ă m . - Danh sách các ch ủ ng vi khu ẩ n sàng l ọ c kh ả n ă ng đố i kháng v ớ i vi khu ẩ n E. - ictaluri STT Ký hi ệ u Loài vi khu ẩ n Ngu ồ n g ố c 01 B20.1 Bacillus subtilis Bùn ao nuôi cá tra 02 B4.2.2 Bacillus subtilis Bùn ao nuôi cá tra 03 LA111 Weisella paramesenteroides H ệ tiêu hoá cá tra gi ố ng 04 LA108 Lactobacillus plantarum H ệ tiêu hoá cá tra gi ố ng 05 B3 B. - circulans Bùn ao nuôi cá tra 06 G4.AG22.3 (14) Pediococcus pentosaceus H ệ tiêu hoá cá tra gi ố ng 07 G4.AG21 (61) Pediococcus acidilactici H ệ tiêu hoá cá tra gi ố ng 08 T.VT1.1 (72) Lactobacillus fermentum H ệ tiêu hoá cá tra th ị t 09 G4.VL21.2 (58) Lactococcus brevis H ệ tiêu hoá cá tra gi ố ng 10 T.DT Pseudomonas aeruginosa H ệ tiêu hoá cá tra th ị t 11 N6.1 Bacillus amyloliquefaciens N ướ c ao nuôi cá tra 12 N10.2 Bacillus cereus N ướ c ao nuôi cá tra 13 N19.2 Bacillus pumilus N ướ c ao nuôi cá tra 14 B4 B. - thuringenesis Bùn ao nuôi cá tra 15 N26.3 Bacillus subtilis N ướ c ao nuôi cá tra . - 21 - Ch ủ ng vi khu ẩ n gây b ệ nh: Ch ủ ng Edwardsiella ictaluri Gly 09M nh ậ n t ừ Trung Tâm Qu ố c Gia Quan Tr ắ c C ả nh Báo Môi Tr ườ ng và Phòng Ng ừ a D ị ch B ệ nh Th ủ y S ả n Khu V ự c Nam B ộ , Vi ệ n nghiên c ứ u nuôi tr ồ ng Th ủ y S ả n II. - Cá tra ( Pagasianodon hypophthalmus) đượ c mua t ừ Trung Tâm Qu ố c Gia Gi ố ng Th ủ y S ả n N ướ c Ng ọ t Nam B ộ . - đồ ng đề u, kh ỏ e m ạ nh, không tr ầ y x ướ c, không d ị hình, tr ọ ng l ượ ng trung bình 5 - 20g/con. - Lame, lamelle, ố ng đ ong, ố ng nh ỏ gi ọ t, pipet, ố ng chích, kh ẩ u trang, các lo ạ i đầ u típ, kim tiêm các lo ạ i, g ă ng tay, chai ch ị u nhi ệ t, đ èn c ồ n, bình x ị t c ồ n, que c ấ y, c ố c th ủ y tinh, b ộ kéo nhíp ti ể u ph ẩ u, đĩ a Petri, ố ng nghi ệ m, khay nh ự a, bút sáp (PAP), l ướ i 100 μ l, kh ă n gi ấ y, l ọ nh ự a, khuôn inox, d ầ u soi kính, kính hi ể n vi, máy ả nh, microplate 96 gi ế ng, microplate 12 gi ế ng. - Hóa ch ấ t, môi tr ườ ng Môi tr ườ ng - Môi tr ườ ng dinh d ưỡ ng thông th ườ ng: Nutrient agar (NA), Brain Heart Infusion agar (BHIA), Brain Heart Infusion Broth (BHIB), Trypton soya agar (TSA), Trypton soya broth (TSB), Lactobacillus MRS Broth, Lactobacillus MRS agar, Skim milk, peptone. - Môi tr ườ ng BA (Blood agar) b ổ sung 5% máu c ừ u. - Hóa ch ấ t Dung d ị ch thu nh ậ n b ạ ch c ầ u T ỷ tr ọ ng HBSS 10X 1 ml 1 ml Percoll 3.7 ml 5.1 ml N ướ c c ấ t 5.3 ml 3.9 ml HBSS 10X (Hanks' Balanced Salt Solution 10X) Ho ạ t độ ng bùng n ổ hô h ấ p (O -2 ) Dung d ị ch Modified Hank’s balanced salt (McHBSS) CaCl 2 : 10 mM MgCl 2 : 3 mM MgSO 4 : 5 mM Dung d ị ch Poly-L-lysine (0.2%) Poly-L-lysine: 100 mg N ướ c c ấ t: 50 ml Dung d ị ch Zymozan (0.1%) Zymosan: 15 mg McHBSS: 15 ml Dung d ị ch Nitroblue tetrazolium (0.3%) Nitroblue tetrazolium : 0.3 g N ướ c c ấ t: 100 ml Methanol (100. - 23 KOH 2M Ho ạ t độ ng th ự c bào Dung d ị ch PBS KCl: 0.2 g KH 2 PO 4 : 0.2 g NaCl: 8 g NaH 2 PO 4 .7 H 2 O: 1.56 g Ho ặ c (NaH 2 PO 4 .12 H 2 O): 2.08 g Dung d ị ch Formaldehyde 10% Propidium iodine (Sigma): 10mg/10ml c ủ a PBS Ho ạ t độ ng lysozyme Pha đệ m PB : Na 2 HPO 4 . - 6H 2 O 0,05M NaH 2 PO 4 0,05M Mirococcus lysodeikticus solution Mirococcus lysodeikticus (Sigma): 0.2 mg Đệ m PB (50 mM, pH 6.2): 1ml Lysozyme lòng tr ắ ng tr ứ ng gà (Sigma): 16 µg/ml . - Ph ươ ng pháp nghiên c ứ u 2.2.1. - Kh ả o sát kh ả n ă ng đố i kháng c ủ a các ch ủ ng vi khu ẩ n phân l ậ p v ớ i Edwardsiella ictaluri trong đ i ề u ki ệ n in vitro Nguyên t ắ c: Khi m ộ t ch ủ ng vi khu ẩ n s ả n xu ấ t ra m ộ t h ợ p ch ấ t ngo ạ i bào, có tính ch ấ t ứ c ch ế m ộ t ch ủ ng vi khu ẩ n khác và ho ạ t tính này s ẽ đượ c th ể hi ệ n thông qua vi ệ c ứ c ch ế s ự t ă ng tr ưở ng c ủ a vi khu ẩ n khác trong môi tr ườ ng nuôi. - Kh ả n ă ng kháng c ủ a các ch ủ ng vi khu ẩ n phân l ậ p v ớ i vi khu ẩ n gây b ệ nh E. - Các ch ủ ng Kh ả o sát kh ả n ă ng đố i kháng E. - ictaluri c ủ a các ch ủ ng vi khunCá tra đượ c cho ă n th ứ c ă n b ổ sung vi khu ẩ n phân l ậ p có m ậ t độ : 2x10 7 cfu/g, th ờ i gian 28 ngày Vi khu ẩ n phân l ậ p t ừ h ệ tiêu hoá, n ướ c và bùn ao nuôi cá tra C ả m nhi ễ m E. - ictaluri LD 50 Vi khu ẩ n tuy ể n ch ọ n LD 50 . - 25 vi khu ẩ n t ạ o vòng kháng khu ẩ n có đườ ng kính d. - 0< d < 7 mm : đố i kháng y ế u. - Ti ế n hành: Ch ủ ng vi khu ẩ n Edwardsiella ictaluri b ả o qu ả n ở -80 0 C, đượ c c ấ y chuy ề n sang đĩ a th ạ ch BA và ủ ở 28 0 C trong 28- 32 gi ờ. - để t ạ o gi ố ng c ấ p m ộ t. - Ch ọ n 1 khu ẩ n l ạ c Edwardsiella ictaluri trên đĩ a BA huy ề n phù trong môi tr ườ ng BHI broth nuôi c ấ y l ắ c qua đ êm ở 28 0 C. - Hút 50 μ l d ị ch vi khu ẩ n E. - ictaluri nh ỏ lên đĩ a BHI agar/ MRS agar đ ã đượ c h ấ p kh ử trùng, tr ả i b ằ ng que th ủ y tinh cho khô và dùng ố ng s ắ t hình tr ụ đ ã đượ c ti ệ t trùng đụ c 3 l ỗ trên m ỗ i đĩ a th ạ ch có đườ ng kính 8 mm. - Vi khu ẩ n đượ c phân l ậ p đượ c ho ạ t hóa ch ủ ng c ấ p 1, ch ọ n 1 khu ẩ n l ạ c nuôi trong môi tr ườ ng BHI broth/ MRS broth nuôi l ắ c qua đ êm ở 30 0 C. - Huy ề n phù vi khu ẩ n phân l ậ p đ ã đượ c nuôi cho vào các l ỗ th ạ ch v ớ i th ể tích 50 μ l và các đĩ a th ạ ch đượ c ủ ở 28 0 C trong 24 gi ờ . - Đườ ng kính vòng kháng khu ẩ n s ẽ đượ c đ o và xác đị nh kh ả n ă ng kháng khu ẩ n c ủ a các ch ủ ng vi khu ẩ n phân l ậ p v ớ i vi khu ẩ n gây b ệ nh Edwardsiella ictaluri. - đồ ki ể m tra ho ạ t tính kháng khu ẩ n b ằ ng ph ươ ng pháp gi ế ng khu ế ch tán [30] Vi khu ẩ n sàng l ọ c (-80 0 C) C ấ y ria lên BHIA/MRSA E. - Ph ươ ng pháp xác đị nh ho ạ t tính lysozyme Nguyên t ắ c: D ự a trên ly gi ả i vi khu ẩ n gram d ươ ng Micrococcus luteus (sigma) nh ạ y c ả m v ớ i lysozyme do vi khu ẩ n ti ế t ra trong quá trình sinh tr ưở ng và phát tri ể n. - Ti ế n hành: Ho ạ t tính lysozyme trong huy ế t thanh đượ c đ o theo ph ươ ng pháp c ủ a Ellis và ctv (1990), đượ c ti ế n hành nh ư sau: d ự ng đườ ng chu ẩ n lysozyme có các n ồ ng độ nh ư sau: 16 μ g/ml pha loãng b ậ c 2 đượ c các n ồ ng độ μ g/ ml t ừ d ị ch lòng tr ắ ng tr ứ ng gà trong dung d ị ch đệ m PB. - Hút 10 μ l d ị ch t ừ các n ồ ng độ pha loãng cho vào micoarray 96 gi ế ng, ti ế p theo cho 200 μ l/gi ế ng vi khu ẩ n Micrococcus luteus d ị ch huy ề n phù là 0,2 mg /ml trong dung d ị ch đệ m PB. - Đố i v ớ i m ẫ u huy ế t thanh cá hút 10 μ l cho vào micoplate 96 gi ế ng thêm 200 μ l/gi ế ng vi khu ẩ n Micrococcus luteus (0,2 mg /ml) h ỗ n h ợ p đượ c ủ ở nhi ệ t độ 27 o C. - Sau đ ó đ o nhanh độ đụ c các gi ế ng ở b ướ c sóng 530 nm trong 1 phút và 6 phút. - M ộ t đơ n v ị B ỏ d ị ch n ổ i, r ử a 2 l ầ n L-15 và 100 µl Zymozan µl dung d ị ch b ạ ch c ầ u cho vào gi ế ng (2x10 6 tb/ml) 120 µl KOH và 140 µl DMSO 96 gi ế ng v ớ i 100 µl poly-L- lysine ủ 30 phút, r ử a 1 l ầ n L-15 B ỏ d ị ch n ổ i, r ử a 3 l ầ n v ớ i McHBSS và 100 µl NBT (0,3%) ủ 30 phút ở 37 0 C Sau 2 phút đọ c Elisa ở 630 nm 100 µl methanol (100%) và r ử a 3 l ầ n 100 µl methanol (70
Xem thử không khả dụng, vui lòng xem tại trang nguồn hoặc xem
Tóm tắt