Nghiên cứu thu nhận N-acetylglucosamine (NAG) bằng chitinase từ penicillium oxalicum 20B định hướng ứng dụng trong sản xuất thực phẩm chức năng

- Các nghiên cứu về thu nhận NAG từ chitin bằng chitinase từ vi sinh vật còn khiêm tốn và chưa đầy đủ, đặc biệt là quá trình tinh sạch NAG.
- Do đó chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu thu nhận N-acetylglucosamine (NAG) bằng chitinase từ Penicillium oxalicum 20B định hướng ứng dụng trong sản xuất thực phẩm chức năng” 2.
- Mục tiêu nghiên cứu.
- Thu nhận và xác định đặc tính chế phẩm chitinase kỹ thuật từ Penicillium oxalicum 20B.
- Thu nhận NAG từ chitin phế liệu tôm Việt Nam bằng chế phẩm chitinase kỹ thuật.
- Nội dung nghiên cứu - Nghiên cứu sinh tổng hợp chitinase từ P.
- Thu nhận và xác định đặc tính chế phẩm chitinase kỹ thuật.
- Nghiên cứu thủy phân chitin để thu NAG bằng chế phẩm chitinase kỹ thuật nhận được.
- Nghiên cứu thu nhận chế phẩm NAG tinh sạch hướng tới ứng dụng vào thực phẩm chức năng.
- Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án * Ý nghĩa khoa học: Là công trình nghiên cứu có hệ thống về điều kiện lên men sinh tổng hợp, thu nhận chế phẩm chitinase có hoạt tính endochitinase và NAHase từ chủng Penicillium oxalicum 20B để ứng dụng thủy phân chitin từ phế liệu tôm và thu nhận NAG tinh sạch có tiềm năng ứng dụng làm nguyên liệu sản xuất thực phẩm chức năng.
- Những đóng góp mới của luận án - Là công trình công bố đầu tiên một cách hệ thống về đặc tính enzym và điều kiện lên men sinh tổng hợp chitinase từ P.
- 2 - Đã tạo ra chế phẩm chitinase kỹ thuật từ P.
- oxalicum 20B và xác định các đặc tính của chế phẩm, ứng dụng để thủy phân chitin thu N-acetylglucosamine.
- Đặc biệt ảnh hưởng của từng cấu tử endochitinase và N-acetylhexosaminidase trong hỗn hợp chế phẩm chitinase kỹ thuật đến hiệu suất tạo N-acetylglucosamine đã được xem xét.
- Đã đưa ra qui trình tinh sạch N-acetylglucosamine từ dịch thủy phân chitin và xác định các đặc tính của chế phẩm N-acetylglucosamine phù hợp để sử dụng làm nguyên liệu sản xuất thực phẩm chức năng.
- Một số giải pháp kỹ thuật thủy phân chitin thu nhận NAG 1.3.4.1.
- Điều kiện thủy phân chitin ra NAG bởi chế phẩm chitinase 1.4.
- SINH TỔNG HỢP CHITINASE TỪ VI SINH VẬT 1.4.1.
- Nguồn vi sinh vật sinh tổng hợp chitinase 1.4.2.
- Ảnh hưởng của nguồn cacbon tới sinh tổng hợp chitinase 1.4.3.
- Ảnh hưởng của nguồn và nồng độ nitơ tới sinh tổng hợp chitinase 1.4.4.
- Ảnh hưởng của nguyên tố khoáng tới sinh tổng hợp chitinase 1.4.5.
- Ảnh hưởng của pH tới sinh tổng hợp chitinase 3 1.4.6.
- Ảnh hưởng của nhiệt độ tới sinh tổng hợp chitinase 1.4.7.
- Ảnh hưởng của thời gian tới sinh tổng hợp chitinase 1.4.8.
- Ảnh hưởng của tốc độ lắc và cường độ khuấy tới sinh tổng hợp chitinase 1.5.
- NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1.
- NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 2.1.1.
- Phương pháp xác định hoạt độ enzym 2.2.3.1.
- Hoạt độ chitinase được xác định theo phương pháp Binod cải tiến 2.2.3.2.
- Hoạt độ -N-acetyl-D-hexosaminidase 2.2.3.4.
- Hoạt độ chitobiosidase 2.2.4.
- CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1.
- Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng sinh tổng hợp chitinase 2.3.2.
- Phương pháp nghiên cứu thu nhận chế phẩm chitinase kỹ thuật 2.3.3.
- Khảo sát đặc tính cơ bản của chế phẩm chitinase kỹ thuật 2.3.4.
- Xác định điều kiện bảo quản chế phẩm chitinase kỹ thuật 2.3.5.
- Phương pháp nghiên cứu thủy phân chitin 4 2.3.5.1.
- Phương pháp nghiên cứu điều kiện phản ứng thủy phân 2.3.6.
- Phương pháp nghiên cứu thu nhận N-Acetylglucosamine tinh sạch CHƯƠNG 3.
- NGHIÊN CỨU SINH TỔNG HỢP CHITINASE TỪ P.
- Ảnh hưởng của môi trường lên men 3.1.1.1.
- Ảnh hưởng của dạng chitin tới sinh tổng hợp chitinase Dạng chitin ảnh hưởng không nhiều đến hoạt tính chitinase thể hiện trên kết quả Hình 3.1.
- Ảnh hưởng nồng độ chất cảm ứng chitin tới sinh tổng hợp chitinase Hình 3.1.
- Ảnh hưởng dạng chitin tới sinh tổng hợp chitinase trong quá trình lên men Hoạtđộ chitinase(U/ml)Nồng độ chitin thô (g/l)72 h96 h120 h144 h Hình 3.2.
- Ảnh hưởng nồng độ chitin thô tới sinh tổng hợp chitinase trong quá trình lên men Khảo sát nồng độ chitin thô từ 0 (g/l) đến 6 (g/l) cho thấy khả năng sinh tổng hợp chitinase đạt cực đại 0,064 U/ml ở nồng độ chitin thô 4 (g/l) (Hình 3.2).
- Ảnh hường của nguồn nitơ tới sinh tổng hợp chitinase Nguồn nitơ ảnh hưởng tới khả năng sinh tổng hợp chitinase được thực hiện trên 05 nguồn khác nhau (CNM, NaNO3 và urea, CNM kết hợp với NaNO3 hoặc urea) với cùng lượng 10 g/l.
- Định kỳ thu dịch lên men để xác định hoạt độ chitinase cho kết quả Hình 3.3.
- Nên CNM 10 (g/l) là nguồn nitơ thích hợp nhất cho sinh tổng hợp chitinase từ P.
- Ảnh hưởng của hàm lượng cao nấm men tới sinh tổng hợp chitinase Chọn CNM làm nguồn nitơ bổ sung, kết quả Hình 3.4 cho thấy khi nồng độ CNM từ 5 g/l đến 15 g/l, hoạt tính chitinase đạt cao nhất ở nồng độ 10 g/l là 0,065 U/ml.
- Ảnh hưởng của các nguồn nitơ tới sinh tổng hợp chitinase trong quá trình lên men Hình 3.4.
- Ảnh hưởng nồng độ cao nấm men tới sinh tổng hợp chitinase trong quá trình lên men 3.1.2.
- Ảnh hưởng điều kiện lên men 3.1.2.1.
- Ảnh hưởng của pH môi trường lên men tới sinh tổng hợp chitinase P.oxalicum 20B sinh tổng hợp chitinase cao nhất ở pH 5, hoạt độ enzym nhận được 0,064 U/ml chitinase tại thời gian 120 h lên men được thể hiện trên Hình 3.5.
- Ảnh hưởng của tốc độ lắc tới sinh tổng hợp chitinase Hình 3.5.
- Ảnh hưởng pH môi trường tới sinh tổng hợp chitinase trong quá trình lên men Hình 3.6.
- Ảnh hưởng tốc độ lắc tới sinh tổng hợp chitinase trong quá trình lên men Nghiên cứu ảnh hưởng tốc độ lắc đến khả năng sinh tổng hợp enzym từ P.
- Định kỳ lấy dịch lên men để xác định hoạt độ chitinase cho kết quả Hình 3.6.
- Từ kết quả Hình 3.6 cho thấy hoạt độ chitinase đạt cao nhất 0,074 U/ml khi lắc 160 v/p.
- Do vậy sinh tổng hợp chitinase tốt nhất đạt 0,074 U/ml ở môi trường lên men thích hợp chứa 4 g/l cảm ứng chitin thô, 10 g/l cao nấm men và pH 5, lắc với tốc độ 160 v/p.
- Nghiên cứu động thái sinh trưởng phát triển và sinh tổng hợp chitinase Nghiên cứu được tiến hành với các điều kiện thích hợp đã lựa chọn ở trên.
- Trong quá trình lên men, sinh khối tăng nhanh chóng từ 24 h đến 48 h và đạt cực đại tại 72 h (0,75 g/l), rồi giảm liên tục tới cuối quá trình lên men.
- Hoạt tính chitinase bắt đầu tăng sau lên men 24 h và đạt cực đại 0,074 U/ml tại 120 h, sau đó giảm nhanh và còn 0,051U/ml tại 144 h lên men (Hình 3.7).
- Động thái sinh tổng hợp chitinase Bảng 3.1.
- Diễn biến STH enzym thành phần trong quá trình lên men của P.
- Khả năng thủy phân dịch gel chitin 50% thành đường khử bằng dịch lên men chứa chitinase lấy ở các thời điểm lên men khác nhau (dịch lên men pha loãng 02 lần Hình 3.9.
- Sắc ký TLC của các sản phẩm thủy phân từ gel chitin 50% bởi dịch lên men được pha loãng 2 lần.
- tương ứng thời gian lấy mẫu dịch lên men 72 h.
- 7 Bên cạnh đó, diễn biến sinh tổng hợp các enzym thành phần được thể hiện kết quả Bảng 3.1.
- hoạt độ endochitinase, NAHase tăng trong thời gian lên men từ 24 h đến 120 h và đạt cực đại 5,058 U/ml, 0,683 U/ml tương ứng tại 120 h, nhưng giảm sau 120 h lên men.
- Sự kiểm định hoạt tính tại các thời điểm lấy mẫu dịch lên men được xác định bằng thủy phân gel chitin 50% (ở điều kiện pH 5, nhiệt độ 35oC, tỷ lệ dịch lên men/ dịch gel chitin là 1/1) thành đường khử (Hình 3.8) cũng như thành NAG tăng tương ứng (Hình 3.9).
- Từ cơ sở nghiên cứu trên điều kiện pH 5, lắc với tốc độ 160 v/p, 4 g/l chitin thô, 10 g/l CNM và thời gian lên men 120 h được lựa chọn để sinh tổng hợp enzym từ P.
- oxalicum 20B cho nghiên cứu tiếp theo.
- NGHIÊN CỨU THU NHẬN VÀ XÁC ĐỊNH ĐẶC TÍNH CHẾ PHẨM CHITINASE KỸ THUẬT 3.2.1.
- Nghiên cứu ảnh hưởng mức độ cô đặc tới hiệu suất thu hồi Dịch nổi chứa chitinase nhận được sau lên men trong điều kiện tối ưu được loại tạp chất và cô đặc.
- Nên mức cô đặc 4 lần được chọn để lấy phần trên màng thu chế phẩm enzym kỹ thuật.
- Nghiên cứu ảnh hưởng tỷ lệ NAHase/Endochitinase tới khả năng tạo NAG Ảnh hưởng tỷ lệ H/E tới khả năng thủy phân chitin thành NAG của các phân đoạn enzym trên màng (tương ứng tỷ lệ cô đặc 2.
- Ảnh hưởng cơ cấu NAHase và endochitinase (endo) trong các phân đoạn enzym (cùng chung hoạt độ chitinase 0,037 U/ml) tới NAG tạo thành Tỷ lệ cô đặc càng cao (từ 1 đến 4 lần) làm tỷ lệ H/E càng tăng (từ 0,129 lên 0,170) và giúp lượng NAG tạo thành càng lớn dần (từ 5,16 lên 9,49 mg/ml).
- Như vậy, enzym cô đặc 4 lần trên màng được gọi là chế phẩm enzym kỹ thuật và được lựa chọn dùng trong nghiên cứu thủy phân chitin ra NAG.
- Do đó chế độ NaCl 3% ở 4oC dùng để bảo quản chế phẩm chitinase kỹ thuật là hợp lý hơn cả.
- Xác định đặc tính sinh học của chế phẩm chitinase kỹ thuật Chế phẩm chitinase kỹ thuật có hoạt độ 0,239 U/ml chitinase, 2,152 U/ml HAHase và 12,695 U/ml endochitinase nhận được sau khi cô đặc 4 lần trên màng được đem đi xác định đặc tính.
- Ảnh hưởng của nhiệt độ tới hoạt tính enzym Ảnh hưởng nhiệt độ tới hoạt tính enzym của chế phẩm được xem xét qua hoạt lực xúc tác và độ bền hoạt lực enzym thể hiện Hình 3.10.
- Khoảng nhiệt độ thích hợp cho xúc tác của chitinase là 35C - 40C và tối ưu ở 40oC thể hiện Hình 3.10 A.
- Kết quả Hình 3.10 C và Hình 3.10 E cho thấy cả endo và NAHase đều có khoảng nhiệt độ thích hợp là 35C - 40C.
- Sau đó, xác định hoạt độ enzym và kết quả biểu diễn trên Hình 3.10 B, Hình 3.10 D, Hình 3.10 F.
- Chế phẩm chitinase không bền nhiệt.
- Do vậy để ứng dụng chế phẩm cho thủy phân chitin không nên kéo dài quá 3 ngày.
- Hình 3.10.
- Ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng tới hoạt độ tương đối: chitinase (A), endochitinase (C), NAHase (E) và tới độ hoạt độ tương đối theo thời gian lưu giữ tại 30C.
- Ảnh hưởng của pH tới hoạt tính enzym Ảnh hưởng pH tới hoạt tính enzym của chế phẩm enzym kỹ thuật được xem xét qua hoạt lực xúc tác và độ bền hoạt lực enzym thể hiện trên Hình 3.11.
- Hình 3.11.
- Ảnh hưởng của pH phản ứng tới hoạt độ tương đối: chitinase (A), endochitinase (C), NAHase (E) và tới độ bền chitinase (B), endochitinase (D), NAHase (F) theo thời gian lưu giữ ở pH 3.
- Chitinase có khoảng giá trị pH thích hợp trong vùng axit (pH 5 - pH 6) (Hình 3.11 A).
- Endochitinase thể hiện rõ hơn là một enzym axit (pH 4 - pH 5) (Hình 3.11 C).
- Khác với 02 loại enzym trên NAHase tương đối bền với sự thay đổi của pH (Hình 3.11 B, Hình 3.11 C, Hình 3.11 E).
- ỨNG DỤNG CHẾ PHẨM CHITINASE KỸ THUẬT THỦY PHÂN CHITIN 3.3.1.
- Nên chitin mũ ni được chọn để nghiên cứu tiếp theo 11 3.3.2.
- Nghiên cứu ảnh hưởng mức độ nghiền đến khả năng thủy phân chitin Chitin tôm mũ ni được nghiền máy nghiền bi, và được phân loại theo kích thước các phân tử bằng hệ rây (kích thước lỗ rây từ 63 µm đến 600 µm), sau đó xác định trọng lượng và hàm lượng chitin trong từng phân đoạn.
- Ảnh hưởng của mức độ nghiền tới khả năng thủy phân chitin cho thấy lượng đường khử nhận được tăng tỷ lệ thuận với mức độ nghiền (Hình 3.12).
- Ảnh hưởng xử lý phối hợp nghiền bi và siêu âm tới khả năng thủy phân chitin Các phân đoạn bột chitin tôm mũ ni sau khi nghiền bi được đưa vào siêu âm trong thời gian 60 phút, tiếp theo bổ sung chế phẩm enzym kỹ thuật

Xem thử không khả dụng, vui lòng xem tại trang nguồn
hoặc xem Tóm tắt