Nghiên cứu chiết tách một số hoạt chất trong củ tam thất trồng ở Sapa, Việt Nam và khả năng ứng dụng trong công nghệ thực phẩm

- 1 MỞ ĐẦU Ở nước ta, tam thất được trồng và mọc tự nhiên ở: Hà Giang, Cao Bằng, Lào Cai, Kon Tum, Quảng Nam… Tuy nhiên việc khai thác và sử dụng tam thất trong nước còn hạn chế vì chưa có nhiều nghiên cứu khoa học so sánh về thành phần hoá học các hoạt chất và tác dụng sinh học của chúng với loài tam thất khác, đặc biệt là loài tam thất trồng của Trung quốc.
- Tam thất Việt Nam chủ yếu được khai thác để xuất khẩu tiểu ngạch sang Trung Quốc làm thuốc chữa bệnh.
- Nước ta chủ yếu nhập khẩu Tam thất trồng ở Trung Quốc (tên khoa học Panax notoginseng) về làm thuốc chữa bệnh, pha chế mỹ phẩm và làm thực phẩm bổ dưỡng cơ thể.
- Cho tới ngày nay, việc khai thác hoạt chất saponin và polyacetylen trong củ tam thất đã và đang được nghiên cứu theo các phương pháp chiết tách khác nhau, phương pháp nghiên cứu chiết tách với sự hỗ trợ của thiết bị siêu âm cho lượng chất tổng số lớn với đầy đủ các hoạt chất.
- Phương pháp sắc ký hiện đại tinh sạch được các chất có độ tinh sạch cao, từ đó nghiên cứu được những hoạt tính sinh học của chúng, mở ra khả năng ứng dụng công nghệ để sản xuất sản phẩm tốt hơn, với chất lượng cao hơn.
- Xuất phát từ thực tế và sự cấp thiết trên, đề tài: “Nghiên cứu chiết tách một số hoạt chất trong củ tam thất trồng ở Sapa, Việt Nam và khả năng ứng dụng trong công nghệ thực phẩm” đã được lựa chọn để nghiên cứu với mục tiêu và nội dung sau.
- Mục tiêu nghiên cứu - Thu thập mẫu và định danh qua so sánh hình thái với bộ mẫu chuẩn để xác định tên loài cụ thể cho tam thất trồng tại Sapa.
- Nghiên cứu thu nhận cao chiết từ tam thất, thành phần dinh dưỡng, đồng thời đánh giá các hoạt chất có hoạt tính sinh học của cao chiết từ tam thất trồng ở Sapa, Lào Cai.
- Đánh giá khả năng ứng dụng củ tam thất trong một số sản phẩm công nghệ thực phẩm.
- Nội dung nghiên cứu - Xác định tên khoa học ba loài tam thất trồng tại Sapa, Lào Cai, Việt Nam là: Panax stipuleanatus, Panax bipinnatifidus, Panax notoginseng.
- Nghiên cứu thành phần hoá học của ba loại củ tam thất trồng ở Sapa, Lào Cai, Việt Nam: protein, lipid, carbohydrate, amino axit, axit béo, các nguyên tố đa lượng và vi lượng, phenol tổng, flavonoid tổng và 2 saponin.
- Từ đó đánh giá chất lượng củ tam thất hoang của Việt Nam (Panax stipuleanatus.
- Xác lập qui trình thu nhận cao tam thất từ củ tam thất hoang bằng phương pháp chiết tách với ethanol, xác định cấu trúc các hoạt chất và hoạt tính sinh học các chất trong cao tam thất hoang (Panax stipuleanatus.
- Nghiên cứu ứng dụng tam thất hoang trong ngành công nghệ thực phẩm.
- Tính mới của luận án - Đây là nghiên cứu đầy đủ về thành phần dinh dưỡng của ba loại củ tam thất ở Sapa, Lào Cai (Việt Nam).
- Từ đó đánh giá được chất lượng củ tam thất hoang (Panax stipuleanatus) so với hai loài tam thất khác (Panax bipinnatifidus, Panax notoginseng.
- Tối ưu hóa qui trình chiết tách cao chiết tổng trong củ tam thất hoang, lượng cao thu được là .
- Đồng thời tinh sạch và xác định cấu trúc của 6 hợp chất trong củ tam thất hoang là stigmasterol (T1), axit 5-dodecenoic (T2), stipudiol (T4) 5-hydroxymetylfurfural (T5), panaxytriol (T6) và đặc biệt có một chất mới là Heptadeca-8-en-4,6-diyne-3,10-diol (T3).
- Trong đó, T3, T4 và T6 có hoạt tính gây độc tế bào trên dòng tế bào KB.
- Từ bột, cao chiết tổng chiết tách từ củ tam thất hoang đã tạo ra được một số sản phẩm như: kẹo cứng tam thất, bánh cookie tam thất, nước tam thất mật ong và trà tam thất hoa cúc có tính chất cảm quan hấp dẫn người tiêu dùng.
- ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU - Đối tượng nghiên cứu của luận án là 3 loài tam thất thu hái tại Sapa - Lào Cai.
- Mẫu tam thất được giám định tên khoa học bằng hình thái là Panax notoginseng F.
- Luận án sử dụng các phương pháp và thiết bị nghiên cứu sau.
- thành phần axit béo xác định bằng GC-MS.
- amino axit được xác định bằng HPLC với detector huỳnh quang.
- hàm lượng nguyên tố đa lượng và vi lượng xác định bằng thiết bị quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS).
- Hàm lượng flavonoid, phenol tổng… được xác định bằng phương pháp quang phổ (UV-Vis.
- Cấu trúc của chúng được xác định bằng các phương pháp phổ HR-ESI-MS và 1D, 2D NMR.
- Hoạt tính kháng vi sinh vật xác định theo hai phương pháp là phương pháp khuếch tán lỗ thạch và phương pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật trên môi trường lỏng.
- Hoạt tính gây độc tế bào theo phương pháp môi trường thạch (MTT.
- Nghiên cứu ứng dụng sản phẩm tam thất trong ngành công nghệ thực phẩm bằng phương pháp phân tích cảm quan sản phẩm, phân tích phương sai (ANOVA).
- Số liệu xử lý theo phương pháp thống kê.
- KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1.
- Kết quả nghiên cứu đặc tính của nguyên liệu tam thất 3.1.1.
- Hàm lƣợng protein Bằng phương pháp Kjeldahl, chúng tôi đã xác định được hàm lượng protein có trong mẫu bột khô của tam thất hoang P.
- tam thất Trung Quốc P.
- Hàm lƣợng lipid Bằng phương pháp Soxhlet đã xác định được hàm lượng lipid có trong mẫu bột khô của tam thất tính theo khối lượng khô.
- Hàm lượng lipid có trong tam thất hoang là .
- sâm vũ diệp và tam thất Trung Quốc .
- Hàm lƣợng carbohydrate Từ đồ thị đường chuẩn D-glucose, chúng tôi xác định được hàm lượng carbohydrate có trong mẫu bột khô tam thất hoang là .
- Hàm lƣợng các amino axit Bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) sử dụng HPLC Alliance của hãng Water, Mỹ với quy trình xử lý mẫu phân tích, xác định amino axit thực hiện tại Phòng thí nghiệm của Khoa Hóa Thực phẩm, Viện 4 Dinh dưỡng Quốc gia, đã phân tích được thành phần amino axit trong ba loại củ tam thất như sau: Bảng 3.4: Thành phần các amino axit trong ba loài tam thất (mg/100g mẫu khô).
- Thành phần axit béo Từ kết quả phân tích trên GC-MS (7000B) của hãng Agilent, Mỹ với quy trình xử lý mẫu phân tích tại Phòng thí nghiệm của Khoa Hóa Thực phẩm, Viện Dinh dưỡng Quốc gia, 14 loại axit béo được phát hiện từ củ của ba loài tam thất.
- 5 Bảng 3.5: Thành phần các axit béo có trong ba loài tam thất (mg/100g mẫu khô).
- không xác định được] Từ bảng 3.5 cho thấy, trong thành phần axit béo trong củ của 3 loài P.
- Nghiên cứu về thành phần các nguyên tố đa lƣợng và vi lƣợng Bằng thiết bị Quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS-6300), sử dụng kỹ thuật nguyên tử hóa mẫu không ngọn lửa trên lò Graphit phân tích, xác định một số nguyên tố đa lượng và vi lượng trong 3 loài tam thất.
- 6 Bảng 3.6: Thành phần các nguyên tố đa lượng và vi lượng trong tam thất (mg/kg trọng lượng khô).
- Hàm lƣợng phenol tổng Kết quả nghiên cứu thu được cho thấy hàm lượng phenol tổng trong cao chiết củ tam thất hoang là mg/g cao hơn so với các loài tam thất khác trong sâm vũ diệp mg/g và tam thất Trung Quốc mg/g.
- Hàm lƣợng flavonoid tổng Kết quả nghiên cứu cho thấy hàm lượng flavonoid tổng trong 1gam mẫu cao ethanol của 3 loài tam thất so với chất chuẩn mg Quercetin (QE), tam thất hoang có hàm lượng flavonoid thấp nhất là mg/g.
- Trong đó, flavonoid trong củ tam thất Trung Quốc mg/g và flavonoid trong sâm vũ diệp mg/g.
- Phát hiện saponin bằng các phản ứng định tính đặc trƣng Kết quả tiến hành phân tích định tính bằng phản ứng đặc trưng trong ống nghiệm, phản ứng giọt và sắc kí cho thấy sự có mặt của nhóm chất saponin trong bột củ tam thất.
- Xác định saponin trong tam thất bằng sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) Bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) áp dụng quy trình phân tích dược điển của Trung Quốc, thực hiện tại Phòng thí nghiệm Dược, 7 Viện Kiểm nghiệm, Bộ Y tế, kết quả ở bảng sau: Bảng 3.10: Định lượng saponin trong bột củ ba loài tam thất.
- Bột TTH Bột SVD Bột NOTO R1: Notoginsenosid R1 Rb1: Ginsenosid Rb1 Rg1: Ginsenosid Rg1 Nhận xét: Qua việc nghiên cứu khảo sát đặc tính nguyên liệu của 3 loài tam thất phổ biến ở Sapa, Lào Cai.
- Chúng tôi thấy cây tam thất hoang là loài cây dược liệu quí, vùng phân bố rộng, là cây tam thất đặc thù của Việt Nam.
- Do vậy để làm rõ hơn các hoạt chất có hoạt tính sinh học của loài cây này.
- Chúng tôi tập trung nghiên cứu xác định thành phần hoạt chất trong củ để làm cơ sở khoa học cho việc ứng dụng tam thất vào sản phẩm thực phẩm.
- Xây dựng quy trình chiết tách cao tổng từ củ tam thất hoang 3.2.1.
- Nghiên cứu khảo sát các phƣơng pháp chiết tách thu cao tổng .
- Nghiên cứu chọn ethanol làm dung môi chiết vì ethanol dễ hòa tan hầu hết các hợp chất thiên nhiên, không độc hại đến sản phẩm, có thể cất và thu hồi lại dung môi.
- Các thí nghiệm được tiến hành như sau: cho khoảng 2 gam bột mẫu tam thất và lượng dung môi theo tỉ lệ dung môi/nguyên liệu là 50/1(thể tích/khối lượng.
- Các phương pháp chiết sau: Bảng 3.11: Kết quả khảo sát các phương pháp chiết tách và nồng độ dung môi chiết Phƣơng pháp tách Nồng độ ethanol.
- V) Khối lƣợng mẫu (g) Cao chiết tổng.
- chất khô) (DPPH) IC50 (mg/ml) Chiết Soxhlet Trong 3 giờ Ngâm ở nhiệt độ thường Trong 48 giờ Siêu âm 30 phút Siêu âm 1 giờ Hình 3.1: Khảo sát các phương pháp chiết tách cao chiết tổng Nồng độ ethanol (%V) 9 Kết quả bảng 3.11 cho thấy khi thay đổi các phương pháp chiết và thay đổi nồng độ % ethanol, kiểm tra hoạt tính quét gốc tự do của cao chiết thu được.
- chất khô), kết quả quét DPPH không thay đổi nhiều (ở nồng độ IC50 chất đối chứng axit ascorbic IC50 = 0,030 mg/ml.
- DPPH thấp nhất của cao chiết Soxhlet IC50 = 25,75 và cao nhất ở cao chiết có hỗ trợ siêu âm 1 giờ là IC50 = 26,67 mg/ml).
- Từ kết quả này cho ta cơ sở để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo.
- Kết quả khảo sát điều kiện tối ƣu hoá phƣơng pháp chiết siêu âm Từ nghiên cứu khảo sát ở trên, nhận thấy các phương pháp chiết đều cho cao chiết tổng có hoạt tính chống oxy hóa (IC50) hầu như không thay đổi, đối với phương pháp chiết sử dụng siêu âm sẽ thu được lượng cao chiết tổng lớn.
- Do đó, chỉ tiến hành nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng như: tỉ lệ dung môi/nguyên liệu, nồng độ cồn, thời gian chiết siêu âm và nhiệt độ chiết đến lượng cao chiết tổng thu được.
- Hình 3.2: Khảo sát tỉ lệ dung môi/nguyên liệu (v/m) Hình 3.3: Khảo sát nồng độ dung môi ethanol.
- Tối ƣu hoá quá trình chiết cao tổng thành phần tam thất 3.2.3.1.
- Thiết lập mô hình Tiến hành nghiên cứu thu cao chiết tổng trong tam thất với 3 yếu tố ảnh hưởng chính: nồng độ dung môi chiết.
- Quy hoạch thực nghiệm gồm 15 thí nghiệm với hàm mục tiêu lượng cao chiết tổng lớn nhất.
- Bảng 3.17: Các thí nghiệm tiến hành và kết quả Số thí nghiệm Nồng độ ethanol.
- Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu (v/m) Thời gian siêu âm (Phút) Cao chiết tổng.
- Tối ưu hóa Quá trình chiết tách cao chiết tổng từ củ tam thất được tiến hành sao cho thu được lượng cao chiết tổng là lớn nhất.
- Ta tiến hành giải bài toán tối 11 Dịch EtOH Mẫu tam thất 2,0419g (qui khô.
- Chiết siêu âm 75 phút t0≤ 450C bằngEtOH - Lọc lấy dịch chiết - Cô chân không đến cặn, t0≤ 500C - Pck = 550 mmHg Sấy chân không loại EtOH (Pck =550 mmHg, 500C, 5 giờ) Lượng cao chiết tổng 0,3065g ưu theo thuật toán “hàm mong đợi” được đưa ra bởi Derringer và Suich.
- Kết quả tối ưu hóa bằng phần mền Design-Expert 7.1.
- Kết quả: nồng độ dung môi 65%, tỷ lệ dung môi/nguyên liệu 55/1 (v/m) và thời gian siêu âm 75 phút.
- Với điều kiện tối ưu này thì mục tiêu về lượng cao chiết tổng đạt được cao nhất là .
- Đạt tỷ lệ lượng cao chiết lớn nhất cho mục đích chiết tách cao tam thất.
- Hình 3.9: Qui trình công nghệ chiết tách cao chiết tổng từ tam thất Từ sản phẩm cao chiết tổng thu được chúng tôi đi phân tích xác định hàm lượng saponin thành phần bằng phương pháp phân tích trên (HPLC) của hãng Hitachi (Nhật Bản) thu được kết quả bảng 3.20 dưới đây: 12 Bảng 3.20: Định lượng saponin thu được trong cao chiết ethanol của tam thất hoang Mẫu Khối lượng (g) Thể tích (ml) R1.
- Hoạt tính sinh học của các phân đoạn chiết xuất từ củ tam thất hoang 3.3.1.
- Hoạt tính chống oxy hóa – quét gốc tự do DPPH Bảng 3.21: Hoạt tính chống oxy hóa của các cao phân đoạn từ củ tam thất hoang Mẫu Phần trăm ức chế gốc tự do DPPH ở các nồng độ khác nhau của mẫu.
- 0,1 (mg/ml) 0,5 (mg/ml) 1,0 (mg/ml) 2,0 (mg/ml) n-hexane Ethyl acetat n-butanol Axit ascorbic 0,005 (mg/ml) 0,01 (mg/ml) 0,05 (mg/ml) 0,1 (mg/ml) 0,5 (mg/ml Từ kết quả bảng 3.21 cho thấy hoạt tính chống oxy hóa các phân đoạn của củ tam thất hoang là rất thấp.
- Hoạt tính chống oxy hóa cao nhất ở phân đoạn n-butanol là 11,53% với 2 mg/ml mẫu thử.
- Hoạt tính kháng vi sinh vật Chúng tôi tiến hành đánh giá khả năng kháng vi sinh vật của các cao phân đoạn củ tam thất hoang theo hai phương pháp là phương pháp khuếch tán lỗ thạch và phương pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật trên môi trường lỏng.
- 13 Bảng 3.22: Hoạt tính kháng vi sinh vật của các cao phân đoạn từ củ tam thất hoang trên môi trường thạch.
- không xác định (Giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn, n =3) Bảng 3.23: Hoạt tính kháng một số vi sinh vật của các cao phân đoạn củ tam thất hoang trên môi trường lỏng.
- Hoạt tính ức chế sinh tổng hợp melanin Tyrosinase là enzyme có vai trò quan trọng trong quá trình sinh tổng hợp melanin.
- 14 Bảng 3.25: Nồng độ ức chế 50% hoạt tính tyrosinase (IC50) của các cao phân đoạn từ củ tam thất hoang.
- Mẫu và chất chuẩn IC50 (mg/ml) n- hexane n-butanol Nước Axit kojic Giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn, n =3) Từ kết quả ở hai bảng 3.25 trên, chúng ta thấy hoạt tính ức chế tyrosinase tăng tuyến tính theo dãy nồng độ của các cao phân đoạn.
- Hoạt tính kháng tế bào ung thƣ Bảng 3.26: Hoạt tính kháng các dòng tế bào ung thư của các cao phân đoạn từ củ tam thất hoang (IC50, µg/ml).
- Hoạt tính gây độc tế bào trên dòng ung thư - IC50 (µg/ml) Cao LU HepG2 SK-MEL 2 MCF-7 KB 1 n-hexane n-butanol Đối chứng Ellipticin Theo kết quả từ bảng 3.26, ta thấy các cao phân đoạn n-butanol và n-hexane của củ tam thất hoang đều có hoạt tính gây độc tế bào trên cả năm dòng tế bào thử nghiệm.
- Phân lập, xác định cấu trúc và hoạt tính của một số thành phần hóa học trong cao chiết tam thất hoang 3.4.1.
- Chiết các phân đoạn từ cao chiết tổng củ tam thất hoang 15 * Quy trình chiết xuất các phân đoạn từ cao chiết TTH được trình bày như sau Hình 3.10: Quy trình chiết xuất phân đoạn từ cao chiết tổng củ tam thất hoang 3.4.2.
- Xác định cấu trúc các hợp chất tinh sạch từ cao phân đoạn 3.4.2.1.
- Hợp chất H3C2 (T1) Cấu trúc của T1 được xác định bằng phổ 1H NMR và so sánh với tài liệu, chúng tôi kết luận T1 là stigmasterol (Hình 3.15).
- Hợp chất H5A1 (T2) Hợp chất T2 được xác định bằng phổ 1H NMR và GC-MS.
- Kết quả T2 là axit 5-dodecenoic.
- Phổ ESI-FTICR-MS cho pic ion giả phân tử ở m/z 263,2006 [M+H]+ từ đó xác định công thức phân tử của T3 là C17H26O2

Xem thử không khả dụng, vui lòng xem tại trang nguồn
hoặc xem Tóm tắt