- 14 1.3.1 Định nghĩa sắc ký. - 15 1.3.3 Cấu tạo cơ bản của hệ thống sắc ký lỏng. - 25 LUẬN VĂN CAO HỌC 2018 Trang 2 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. - 28 2.3.2 Phương pháp phân tích bằng thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao đầu dò DAD. - 6 Sơ đồ 4: Phân loại các phương pháp sắc ký. - 15 Sơ đồ 5: Cấu tạo cơ bản của hệ thống sắc ký lỏng [1. - 33 Bảng 7: Kết quả tối ưu cột sắc ký. - 22 Hình 9: Sắc ký đồ dung môi nước ở các bước sóng nm. - 32 Hình 10: Sắc ký dồ AA 10 ppm ở các bước sóng nm. - 33 Hình 11: Sắc ký đồ của pha động Nước: MeOH = 96: 4. - 34 Hình 12: Sắc ký đồ với pha động nước. - 34 Hình 13: Sắc ký đồ khi phân tích bằng cột C8 InertSustain. - 35 Hình 14: Sắc ký đồ khi phân tích bằng cột Eclipse Plus C18. - 35 Hình 15: Sắc ký đồ với tốc độ dòng 0,6 ml/phút. - 36 Hình 16: Sắc ký đồ với tốc độ dòng 0,8 ml/phút. - 36 Hình 17: Sắc ký đồ với tốc độ dòng 1 ml/phút. - 36 Hình 18: Sắc ký đồ dịch chiết mẫu trắng khi dùng dung môi chiết (1. - 39 Hình 19: Sắc ký đồ dịch chiết mẫu trắng khi dùng dung môi chiết (2. - 40 Hình 20: Sắc ký đồ mẫu trắng. - 42 Hình 21: Sắc ký đồ mẫu trắng thêm chuẩn 0,2 ppm. - 42 Hình 22: Sắc ký đồ mẫu trắng thêm chuẩn 1 ppm. - 43 LUẬN VĂN CAO HỌC 2018 Trang 6 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Sắc ký đồ mẫu N1.01. - 56 Phụ lục 1: Sắc ký đồ mẫu N1.02. - 57 Phụ lục 1: Sắc ký đồ mẫu N1.03. - 58 Phụ lục 1: Sắc ký đồ mẫu N1.04. - 59 Phụ lục 1: Sắc ký đồ mẫu N1.05. - 60 Phụ lục 1: Sắc ký đồ mẫu N1.06. - 61 Phụ lục 1: Sắc ký đồ mẫu N1.07. - 62 Phụ lục 1: Sắc ký đồ mẫu N1.08. - 63 Phụ lục 1: Sắc ký đồ mẫu N1.09. - 64 Phụ lục 1: Sắc ký đồ mẫu N1.010. - 65 Phụ lục 2: Sắc ký đồ mẫu N2.01. - 66 Phụ lục 2: Sắc ký đồ mẫu N2.02. - 67 Phụ lục 2: Sắc ký đồ mẫu N2.03. - 68 Phụ lục 2: Sắc ký đồ mẫu N2.04. - 69 Phụ lục 2: Sắc ký đồ mẫu N2.05. - 70 Phụ lục 2: Sắc ký đồ mẫu N2.06. - 71 Phụ lục 2: Sắc ký đồ mẫu N2.07. - 72 Phụ lục 2: Sắc ký đồ mẫu N2.08. - 73 Phụ lục 2: Sắc ký đồ mẫu N2.09. - 74 Phụ lục 2: Sắc ký đồ mẫu N2.010. - 75 Phụ lục 3: Sắc ký đồ mẫu N3.01. - 76 Phụ lục 3: Sắc ký đồ mẫu N3.02. - 77 Phụ lục 3: Sắc ký đồ mẫu N3.03. - 78 Phụ lục 3: Sắc ký đồ mẫu N3.04. - 79 Phụ lục 3: Sắc ký đồ mẫu N3.05. - 80 Phụ lục 3: Sắc ký đồ mẫu N3.06. - 81 Phụ lục 3: Sắc ký đồ mẫu N3.07. - 82 Phụ lục 3: Sắc ký đồ mẫu N3.08. - 83 Phụ lục 3: Sắc ký đồ mẫu N3.09. - 84 Phụ lục 3: Sắc ký đồ mẫu N3.010. - Tổng quan chung - Xây dựng quy trình định lượng acrylamide bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao. - LUẬN VĂN CAO HỌC 2018 Trang 2 I. - Nguồn gốc Tháng 4 năm 2002 cơ quan quản lý thực phẩm của Thụy Điển đã sử dụng máy sắc ký lỏng ghép 2 lần khối phổ (LC/MS/MS) để khảo sát 100 mẫu thực phẩm và công bố không tìm thấy AA trong các thực phẩm chưa qua chế biến và thực phẩm luộc [18]. - Năm 2002 tại Hồng Kông K.S.Leung và cộng sự đã sử dụng máy sắc ký lỏng LC-MS/MS khảo sát 400 mẫu thực phẩm, chủ yếu là thực phẩm truyền thống Châu Á tại Hồng Kông cho thấy AA được phát hiện chủ yếu trong những nhóm thực phẩm như gạo và sản phẩm của gạo, mỳ, bánh và những sản phẩm bột nhão dùng làm bánh…[25]. - Các phương pháp xác định acrylamide dựa trên các thiết bị sắc ký khí và sắc ký lỏng với các đầu dò khác nhau (ECD. - Sắc ký khí Tác giả Phương pháp/ nền mẫu Xử lý mẫu Điều kiện sắc ký Pittet và cộng sự, 2004 [8] GC-MS Ngũ cốc Chiết với nước được axit hóa với axetic acid băng, loại protein với dung dịch Carrez I và II, tạo dẫn xuất với thuốc thử brom hóa (KBr, HBr, và nước Br2), bổ sung Na2S2O3, LLE với EtAc/ n-hexan 4: 1 (v/v), thổi khô bằng N2, SPE với Na2SO4 trên cột Florisil được kích hoạt. - LUẬN VĂN CAO HỌC 2018 Trang 10 WR: 1–100 ppm. - Sắc ký lỏng Tác giả Phương pháp Xử lý mẫu Điều kiện sắc ký Cù Hoàng Yến và cộng sự 2014 [4] LC/MS/MS Chiết bằng hỗn hợp nước và ACN, loại béo bằng n-hexan, làm sạch bằng PSA+ MgSO4 MP: A (HCOOH 0.01% -ACN: 19‐1), B (ACN) Cột C18 Inertsil ODS 3V, 5 μm, 150 mm, 4.6 mm, cột bảo vệ C18 Paleologos và Kontominas Normal phase HPLC-UV, Khoai tây chiên, Chiết bằng nước, loại béo bằng n-hexan Cột Aminex HPX-87H mm) MP: H2SO4 LOD: 15 μg/L. - Dịch chiết được cô đặc bằng cách hút chân không, hòa tan trong nước khử ion, lọc bằng màng lọc PTFE, sau đó được phân tích HPLC trang bị cột sắc ký C18 (AtlantisTM, 150 mm × 2,1 mm) và detector UV. - Tổng quan về phương pháp HPLC 1.3.1 Định nghĩa sắc ký Sắc ký (chromatography) lần đầu tiên được giới thiệu vào năm 1903 do nhà thực vật Michael C.Txvet người Nga [1]. - Định nghĩa của IUPAC (1993): LUẬN VĂN CAO HỌC 2018 Trang 15 Sắc ký là một phương pháp hóa lý dùng để tách các thành phần của một hỗn hợp. - Sự tách sắc ký được dựa trên sự phân chia khác nhau của các chất khác nhau vào hai pha luôn tiếp xúc và không hòa lẫn vào nhau được gọi là pha tĩnh và pha động. - Hình 2: Quá trình tách các sắc tố thực vật 1.3.2 Phân loại Có nhiều cách phân loại Sơ đồ 4: Phân loại các phương pháp sắc ký LUẬN VĂN CAO HỌC 2018 Trang 16 1.3.3 Cấu tạo cơ bản của hệ thống sắc ký lỏng Hệ thống gồm 7 phần chính [1. - Cột sắc ký (Stationary phase – pha tĩnh. - Hệ thống xử lý số liệu Sơ đồ 5: Cấu tạo cơ bản của hệ thống sắc ký lỏng [1] LUẬN VĂN CAO HỌC 2018 Trang 17 a. - Cột sắc ký Là cột đặc biệt được nhồi đầy các hạt nhồi (pha tĩnh). - Có hai loại cột thường dùng trong sắc ký lỏng là cột pha thuận và cột pha đảo. - Cột sắc ký pha đảo (Reversed Phase Liquid Chromatography-RPLC): Pha tĩnh gồm các phân tử silic dioxyt có gắn các nhóm chức không phân cực và các nhóm silanol. - Hình 6: Cột pha đảo [1] LUẬN VĂN CAO HỌC 2018 Trang 19 - Cột sắc ký pha thuận (Normal Phase Liquid Chromatography-NPLC). - Đầu dò (Detector) Là bộ phận phát hiện các chất khi chúng ra khỏi cột và cho các tín hiệu ghi trên sắc ký đồ để có thể định tính và định lượng. - Đối với các hệ thống sắc ký lỏng hiện đại, phần này được phần mềm trong hệ thống ghi nhận, lưu các thông số, sắc ký đồ, các thông số liên quan đến peak như tính đối xứng, hệ số phân giải,… đồng thời tính toán, xử lý các thông số liên quan đến kết quả phân tích. - Để đánh giá khả năng sử dụng của phương pháp thử cần dựa vào các thông số sau: 1.4.1 Độ thích hợp hệ thống Thông thường các phương pháp phân tích sắc ký cần có sự đánh giá để đảm bảo hệ thống phù hợp để phân tích. - Phép thử đánh giá sự phù hợp của hệ thống của các phương pháp sắc ký được quy định theo nhiều tổ chức (USP, USFDA) như sau. - Độ chụm của thời gian lưu, diện tích píc sắc ký: Tiêm trực tiếp dung dịch chuẩn nhiều lần lặp lại vào hệ thống sắc ký và xác định độ lệch chuẩn tương đối (RSD). - Hệ thống sắc ký: Hệ thống Agilent 1260 Inifity II (USA. - Xây dựng phương pháp định lượng - Khảo sát các điều kiện thiết bị sắc ký lỏng: Pha động, tốc độ dòng, cột sắc ký. - LUẬN VĂN CAO HỌC 2018 Trang 29 Dịch chiết đem cô khô, hòa tan lại bằng nước, lọc qua màng lọc 0,25μm và tiêm vào hệ sắc ký. - 2.3.2 Phương pháp phân tích bằng thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao đầu dò DAD Acrylamide được xác định với hệ sắc ký bao gồm. - Hệ sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC Agilent - Đầu dò DAD - Cột : Eclipse Plus C18 Agilent 5 μm, 250 mm x 4,6 mm - Pha động: Nước - Thể tích tiêm : 20 μl - Tốc độ dòng: 0,6 ml/ phút - Nhiệt độ cột 30 oC 2.3.3 Thẩm địnhphương pháp 2.3.3.1 Độ thích hợp của hệ thống Chuẩn bị dung dịch chuẩn có nồng độ 1 ppm từ dung dịch chuẩn gốc 20 ppm bằng cách pha loãng 20 lần trong dung dịch chiết mẫu trắng. - Tiến hành tiêm lặp lại dung dịch chuẩn nồng độ 1 ppm 6 lần bằng chương trình sắc ký đã tối ưu. - Sau khi chuẩn bị mẫu trắng và phân tích mẫu trắng trên thiết bị sắc ký thu được các peak sắc ký, ta thêm chuẩn vào mẫu trắng và phân tích mẫu này. - So sánh sắc ký đồ của hai mẫu để đánh giá tính đặc hiệu/chọn lọc. - Tiến hành phân tích bằng chương trình sắc ký đã tối ưu. - LUẬN VĂN CAO HỌC 2018 Trang 32 Chương 3: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM 3.1 Kết quả thực nghiệm 3.1.1 Xây dựng phương pháp định lượng 3.1.1.1 Khảo sát điều kiện sắc ký a. - Lựa chọn bước sóng Dựa trên các tài liệu đã được công bố và sắc ký đồ acrylamide nồng độ 10 μg/mL khảo sát các bước sóng dưới đây chúng tôi chọn bước sóng 202 nm do có tín hiệu lớn nhất. - Hình 9: Sắc ký đồ dung môi nước ở các bước sóng nm LUẬN VĂN CAO HỌC 2018 Trang 33 Hình 10: Sắc ký dồ AA 10 ppm ở các bước sóng nm Bảng 6: Kết quả chọn bước sóng Bước sóng (nm) Diện tích peak (mAU*s b. - Lựa chọn pha động Qua tham khảo các tài liệu [5] chúng tôi tiến hành chọn 2 pha động như sau để phân tích: Pha động 1: Nước : MeOH = 96 : 4 LUẬN VĂN CAO HỌC 2018 Trang 34 Hình 11: Sắc ký đồ của pha động Nước: MeOH = 96: 4 Ưu điểm: rửa giải được nhiều thành phần ra khỏi cột. - Pha động 2: Nước cất 2 lần Hình 12: Sắc ký đồ với pha động nước Ưu điểm: Rẻ tiền, sẵn có. - LUẬN VĂN CAO HỌC 2018 Trang 35 c. - Lựa chọn cột sắc ký Dựa vào điều kiện thực tế của phòng thí nghiệm chúng tôi tiến hành khảo sát trên 2 cột: C8 InertSustain và Eclips plus C18 khi cùng phân tích mẫu trắng thêm chuẩn 1 ppm. - Cột 1: C8 InertSustain, 5 μm, 250 mm x 4,6 mm Hình 13: Sắc ký đồ khi phân tích bằng cột C8 InertSustain Cột 2: Eclipse C18 Plus, 5 μm, 250 mm x 4,6 mm Hình 14: Sắc ký đồ khi phân tích bằng cột Eclipse Plus C18 Nhận xét: Cột Eclipse C18 Plus cho peak cân đối hơn, diện tích peak lớn hơn Bảng 7: Kết quả tối ưu cột sắc ký Cột C18 InertSustain Eclipse C18 Plus Diện tích peak (mAU*s Kết luận: chọn cột sắc ký Eclipse C18 Plus và khảo sát tiếp tốc độ dòng. - LUẬN VĂN CAO HỌC 2018 Trang 36 d. - Khảo sát tốc độ dòng Tiến hành phân tích cùng một mẫu acrylamide ở tốc độ 0,6 ml/phút, 0,8 ml/phút và 1 ml/phút cho thời gian lưu như sau: Hình 15: Sắc ký đồ với tốc độ dòng 0,6 ml/phút Hình 16: Sắc ký đồ với tốc độ dòng 0,8 ml/phút Hình 17: Sắc ký đồ với tốc độ dòng 1 ml/phút Từ sắc ký đồ: LUẬN VĂN CAO HỌC 2018 Trang 37 Tốc độ dòng Thời gian lưu Diện tích peak 0,6 ml/ phút ml/ phút ml/ phút Nhận xét: Khi tốc độ dòng tăng, peak acrylamide được rửa giải ra sớm hơn, nhưng có xu hướng bị lẫn vào peak tạp của nền mẫu. - Điều kiện sắc ký lựa chọn Qua khảo sát các điều kiện chúng tôi chọn các thông số đã tối ưu như sau. - Cột sắc ký: Eclipse Plus C18 Agilent. - Tiêm vào hệ sắc ký. - Sơ đồ 9: Quy trình chiết số 1 LUẬN VĂN CAO HỌC 2018 Trang 39 Hình 18: Sắc ký đồ dịch chiết mẫu trắng khi dùng dung môi chiết (1. - 15 ml dịch chiết đem bay hơi tới khô Hòa tan cặn bằng 1ml nước Lọc qua màng lọc Tiêm vào hệ sắc ký LUẬN VĂN CAO HỌC 2018 Trang 40 Sơ đồ 10: Quy trình chiết số 2 Hình 19: Sắc ký đồ dịch chiết mẫu trắng khi dùng dung môi chiết (2) LUẬN VĂN CAO HỌC 2018 Trang 41 Nhận xét: dựa vào sắc ký đồ, phương pháp chiết số 1 ít tạp hơn so với phương pháp chiết số 2. - Tiến hành tiêm lặp lại 6 lần với chương trình sắc ký đã chọn ở trên
Xem thử không khả dụng, vui lòng xem tại trang nguồn hoặc xem
Tóm tắt