- Trình tự mồi cho phản ứng PCR. - Vị trí sai khác trong trình tự nucleotide của chỉ thị COI của 4 mẫu nghiên cứu và 3 mẫu đã được công bố trên NCBI. - Hệ số tương đồng khi phân tích trình tự gen COI của 4 mẫu dê nghiên cứu với 3 trình tự đã được công bố trên NCBI. - Vị trí sai khác trong trình tự nucleotide của chỉ thị COI của mẫu nghiên cứu và 6 mẫu đã được công bố trên NCBI. - Hệ số tương đồng khi phân tích trình tự gen COI của mẫu nghiên cứu với 6 trình tự đã được công bố trên NCBI. - Vị trí sai khác trong trình tự nucleotide của chỉ thị COI của mẫu B nghiên cứu và 3 mẫu đã được công bố trên NCBI. - Hệ số tương đồng khi phân tích trình tự gen COI của mẫu nghiên cứu với 3 trình tự đã được công bố trên NCBI. - Kết quả PCR chỉ thị COI của các mẫu DH1, DH2,DN1, DN2. - Kết quả PCR chỉ thị COI của các mẫu B, L. - Hình 4.3: Kết quả giải trình tự chỉ thị COI các mẫu nghiên cứu theo giái trị QV. - So sánh vị trí sai khác trong trình tự nucleotide chỉ thị COI của 4 mẫu nghiên cứu với 3 chỉ thị COI đã công bố trên NCBI. - So sánh vị trí sai khác trong trình tự nucleotide chỉ thị COI của mẫu L nghiên cứu với 6 chỉ thị COI đã công bố trên NCBI. - So sánh vị trí sai khác trong trình tự nucleotide chỉ thị COI của mẫu B nghiên cứu với 3 chỉ thị COI đã công bố trên NCBI. - Hình 4.12: Kết quả so sánh trình tự khác loài. - Phương pháp xác định các trình tự nucleotide. - Thiết bị nghiên cứu. - Nội dung nghiên cứu. - Phương pháp nghiên cứu. - Phương pháp xác định trình tự các nucleotide. - 4.2 Kết quả PCR khuếch đại chỉ thị COI. - Kết quả phân tích chất lượng giải trình tự. - Kết quả so sánh, phân tích chỉ thị COI các mẫu nghiên cứu. - Chỉ thị COI của mẫu dê. - Chỉ thị COI của mẫu lợn. - Chỉ thị COI của mẫu bò. - Về nguyên tắc mã vạch DNA sử dụng một trình tự DNA ngắn nằm trong genome của sinh vật như là một chuỗi ký tự duy nhất giúp phân biệt hai loài sinh vật với nhau. - Gen COI có thể đóng vai trò là trình tự dùng để phân biệt các loài vật nuôi có quan hệ gần và đây cũng là trình tự bảo thủ giữa các thành viên của loài. - Nhân gen COI của một số vật nuôi: Bò, lợn, dê - Giải trình tự gen COI. - Tương tự, mã vạch DNA sử dụng trình tự nucleotide ngắn lấy từ một phần thích hợp trong hệ gen của sinh vật như một chuỗi ký tự duy nhất giúp nhận diện và phân biệt các loài sinh vật với nhau [22]. - Ông đề xuất sử dụng một trình tự ngắn của gen Cytochrome c oxidase 1 (COI) có chiều dài khoảng 650 bp, đây là trình tự DNA có trong tất cả các loài động vật. - Tuy nhiên trình tự các nucleotide của đoạn DNA này khác nhau giữa các loài. - (2) Trình tự có tính đặc hiệu cao và có hiệu suất tái bản cao.. - Có năm bước chính liên quan đến xác định loài bằng trình tự mã vạch DNA. - Một mẫu mô được lấy từ cơ thể vật nuôi và tiến hành tách chiết thu DNA tổng số, sau đó trình tự DNA đích được khuếch đại bằng phản ứng PCR. - (Polymerase chain reaction) và được giải trình tự để tạo ra một “mã vạch”.. - Trên cở sở trình tự của đoạn DNA khuôn, đoạn mồi, các nucleotide tự do và enzyme DNA polymerase có thể tổng hợp được đoạn DNA đích mong muốn. - Giải trình tự là phương pháp xác định thứ tự sắp xếp của 4 nucleotide (adenine, guanine, cytosine và thymine) trên một phân tử DNA. - Với việc phát triển phương pháp giải tình tự tự động việc xác định trình tự DNA của hệ gen sinh vật đã trở nên không thể thiếu cho các quá trình nghiên cứu sinh học cơ bản, cũng như trong các lĩnh vự chuẩn đoán hoặc pháp y.. - Mức độ tương đồng của các trình tự từ các mẫu nghiên cứu Gấu ngựa, Gấu chó và Báo hoa mai so với dữ liệu công bố trên GenBank lần lượt là và 99,85%. - Nghiên cứu này nhằm kiểm tra giả thuyết trên dựa vào sự so sánh trình tự 3 gen mã vạch trong ty thể (gen Cytochrom C oxidase subunit 1- COI và Cytochorome. - Kết quả tìm thấy 3 dạng trình tự của gen COI (trong 15 mẫu), 3 dạng của gen Cyt b (21 mẫu) và 1 dạng gen Rho (7 mẫu) trong các mẫu nghiên cứu. - So sánh trình tự gen COI và Cyt b của cá rô trong nghiên cứu này tương đồng trên 99% với cá rô Anabas testudineus có sẵn ở cơ sở dữ liệu của GenBank và hệ thống BOLD [5].. - Đề tài so sánh đặc điểm hình thái và trình tự gen cytochrome C oxidase subutnit I (COI) của hai “loài” cá bống trân Butis butis và Butis humeralis đã được công bố trong các nghiên cứu trước để kiểm chứng việc định danh hai loài. - Về trình tự gen COI, các mẫu của hai loài giống nhau ở mức 99-100%. - butis ở Genbank (giống trình tự gen COI ở mức 86. - hành phản ứng PCR, tinh sạch sản phẩm PCR và giải trình tự vùng gen Barcode (COI) với kích thước khoảng 650bp cho mỗi mẫu. - Kết quả giải trình tự cho thấy mước độ tương đồng di truyền cao . - Bốn trình tự trên đã được đăng ký trên GenBank với mã số là:. - Stt Mồi Mẫu Trình tự mồi (5’->3’) T a. - Giải trình tự gen COI.. - Phương pháp nghiên cứu 3.5.1. - Các sản phẩm PCR sau khi được khuếch đại sẽ được giải trình tự ở công ty VNDAT tại Malaysia.. - Trình tự chỉ thị COI của các mẫu nghiên cứu sau khi giải trình tự được so sánh với trình tự các chỉ thị COI đã được công bố trên thư viện mã vạch BOLD và NCBI thông qua phần mềm vecter NTI phiên bản 11.5, phần mềm MEGA 7.0, DNAstar 5.0 và BioEdit.. - Như vậy, sản phẩm PCR đủ điều kiện để có thể giải trình tự.. - Các sản phẩm PCR đủ tiêu chuẩn được gửi tới công ty VNDAT tại Malaysia, tại đây các sản phẩm PCR được tinh sạch trước khi giải trình tự.. - Trình tự được xác định trên máy đọc trình tự tự động theo nguyên lý của Sanger.. - Chất lượng của kết quả giải trình tự được xác định bằng chỉ số QV (Quality Value) dựa trên phần mềm Seqscanner v1.0 và được chia theo ba cấp độ: Chất lượng thấp, QV nằm trong khoảng từ 0 – 19 (biểu thị màu đỏ). - Giá trị của QV phụ thuộc vào cường độ tín hiệu giải trình tự. - Chất lượng các mẫu giải trình tự như sau:. - Qua kết quả kiểm tra chất lượng tín hiệu giải trình tự thể hiện trên hình 4.3 cho thấy đoạn 20 -25 bp đầu tiên và 20 -25 bp cuối (màu đỏ, vàng) của chỉ thị chất lượng thấp, phần màu xanh cho chất lượng tín hiệu giải trình tự cao.. - Kết quả so sánh, phân tích chỉ thị COI các mẫu nghiên cứu 4.4.1. - Chúng tôi tiến hành BLAST trình tự COI của 4 mẫu dê nghiên cứu trên (NCBI). - Từ kết quả trên cho thấy, 4 chỉ thị COI đã được khuếch đại và giải trình tự là chỉ thị của loài Capra hircus. - So sánh trình tự DNA chỉ thị COI của 4 mẫu nghiên cứu với 3 chỉ thị COI của loài Capra hircus đã được công bố trên NCBI có mã số lần lượt là LS992610.1, LS992606.1 và LS992662.1 bằng phần mềm Bioedit.. - Từ hình 4.5 ta thu được vị trí sai khác trong trình tự nucleotide chỉ thị COI của 4 mẫu nghiên cứu và 3 mâu đã được công bố trên NCBI được thể hiện qua bảng 4.2.. - Từ kết quả thể hiện trên bảng 4.2 và hình 4.5 cho ta thấy chiều dài vùng gen COI của 4 mẫu nghiên cứu và 3 mẫu trên ngân hàng gen khoảng 559 đến 663 bp, tỷ lệ GC nằm trong vùng này khoảng 42,69% đến 43,29% và có 5 điểm sai khác giữa các trình tự so sánh chiếm 0,75%. - Như vậy có thể thấy vùng gen COI có sự sai khác về trình tự nucleotide. - Chúng tôi tiến hành BLAST trình tự COI của 4 mẫu dê nghiên cứu với trình tự của một số loài khác như Gallus gallus, Sus scrofa , Bos taurus, Canis familiaris trên (NCBI). - Từ kết quả trên cho thấy, 4 chỉ thị COI đã được khuếch đại và giải trình tự chỉ có ở loài Capra hircus mà không có ở bất kỳ một loài nào khác. - Kết quả trên cho thấy, trình tự COI đã được khuếch đại và giải trình tự là chỉ thị của loài Sus scrofa. - Phân tích sự sai khác di truyền chỉ thị COI của mẫu nghiên cứu:. - So sánh trình tự DNA chỉ thị COI của mẫu nghiên cứu với 6 chỉ thị COI của loài Sus scrofa đã được công bố trên NCBI có mã số lần lượt là MG250542.1, KC493612.1, EF545573.1, MH319786.1, MG837549.1 và GU135762.1 bằng phần mềm Bioedit (Hình 4.8). - Các vị trí sai khác trong trình tự nucleotide chỉ thị COI của mẫu nghiên cứu và 6 mẫu đã được công bố trên NCBI được thể hiện qua (bảng 4.4).. - So sánh vị trí sai khác trong trình tự nucleotide chỉ thị COI của mẫu nghiên cứu với 6 chỉ thị COI đã công bố trên NCBI. - tỷ lệ GC nằm trong vùng này khoảng 48,02% đến 48,66% và có 1 điểm sai khác giữa các trình tự so sánh chiếm 0,45%. - Chúng tôi tiến hành so sánh trình tự COI của mẫu lợn nghiên cứu. - với trình tự của một số loài khác như Gallus gallus, Bos taurus, Canis familiaris đã công bố trên NCBI.. - Kết quả cho thấy không có trình tự khác loài có mức độ tương đồng đáng kể được tìm thấy trong cơ sở dữ liệu. - Điều này có thể do hai lý do: Trình tự quá ngắn hoặc trình tự có mức độ phức tạp thấp (đa số là các nucleotide cùng loại trong trình tự). - Tuy nhiên, chiều dài trình tự tra cứu gồm 227 nucleotide vẫn cho kết quả tốt khi so sánh với trình tự cùng loài và các nucleotide không đơn thuần cùng một loại. - Vì vậy có thể kết luận trình tự đoạn gen COI của mẫu giải trình tự chỉ có ở loài Sus scrofa mà không có ở bất kỳ một loài nào khác. - đặc hiệu với đoạn gen COI của loài Sus scrofa mà không đặc hiệu cho bất kỳ một trình tự khác loài nào.. - Từ kết quả trong hình 4.9 cho thấy chỉ thị COI của mẫu nghiên cứu có độ tương đồng cao lên tới 99% so với trình tự đã được công bố trên NCBI. - Kết quả trên cho thấy chỉ thị COI đã được khuếch đại và giải trình tự là chỉ thị của loài Bos taurus. - So sánh trình tự DNA chỉ thị COI của mẫu nghiên cứu với 3 chỉ thị COI của loài Sus scrofa đã được công bố trên NCBI có mã số lần lượt là MG847595.1, KT151961.1 và KT260195.1 bằng phần mềm Bioedit (hình 4.11, bảng 4.5). - Kết quả cho thấy chiều dài vùng gen COI của mẫu nghiên cứu và 6 mẫu trên ngân hàng gen dài khoảng 240bp, tỷ lệ GC nằm trong vùng này khoảng 39,09% đến 40,42% và có 2 điểm sai khác giữa các trình tự so sánh chiếm 0,83. - Chúng tôi tiến hành so sánh trình tự COI của mẫu bò nghiên cứu với trình tự của một số loài khác như Gallus gallus, Sus scrofa, Canis familiaris đã công bố trên NCBI. - Biết rằng chiều dài trình tự tra cứu gồm 253 nucleotide, cho kết quả BLAST tốt khi so sánh với trình tự cùng loài và các nucleotide có thành phần không đồng nhất. - Vì vậy có thể kết luận trình tự đoạn gen COI của mẫu giải trình tự chỉ có ở loài Bos taurus mà không có ở bất kỳ một loài nào khác. - Đã giải trình tự thành công gen COI của 03 loài vật nuôi phổ biến ở Việt Nam là bò, lợn, dê.. - Đã có cơ sở khẳng đị`được trình tự gen COI nghiên cứu có tình đặc hiệu loài, là DNA barcode cho các loài vật nuôi bò, lợn, dê của Việt Nam.. - Đã so sánh, đánh giá được tính tương đồng rất cao của trình tự DNA barcode đang nghiên cứu với trình tự cùng loài trên cơ sở dữ liệu.. - Khẳng định được DNA barcode của bò và lợn không có sự tương đồng đáng kể với các trình tự khác loài. - DNA barcode của dê có mức tương đồng thấp với trình tự gen của các loài khác trên cơ sở dữ liệu.. - Hình 1: Kết quả giải trình tự chỉ thị COI mẫu DH1. - Hình 2: Kết quả giải trình tự chỉ thị COI mẫu DH2. - Hình 3: Kết quả giải trình tự chỉ thị COI mẫu DN1. - Hình 4: Kết quả giải trình tự chỉ thị COI mẫu DN2. - Hình 5: Kết quả giải trình tự chỉ thị COI mẫu B. - Hình 6: Kết quả giải trình tự chỉ thị COI mẫu L
Xem thử không khả dụng, vui lòng xem tại trang nguồn hoặc xem
Tóm tắt