- PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG GÂY BỆNH XUẤT HUYẾT TRÊN LƯƠN ĐỒNG (MONOPTERUS ALBUS) CỦA. - VI KHUẨN AEROMONAS HYDROPHILA. - Sáu chủng vi khuẩn phân lập từ lươn đồng (Monopterus albus) bệnh xuất huyết được định danh là Aeromonas hydrophila. - Các chủng vi khuẩn mọc trên môi trường tryptone soya agar sau 24 giờ ở 28 o C tạo khuẩn lạc tròn, lồi, màu kem, kích thước từ 2-3 mm và gây tan huyết. - Chúng là vi khuẩn Gram âm, hình que ngắn, di động, oxidase và catalase dương tính, có khả năng lên men hiếu khí và kị khí. - Kết quả cảm nhiễm bằng phương pháp tiêm (mật độ 10 7 CFU/lươn) cho thấy vi khuẩn có khả năng gây bệnh xuất huyết ở lươn thí nghiệm như lươn nhiễm bệnh tự nhiên.. - Các công trình nghiên cứu về bệnh ở lươn đồng ở nước ngoài cho thấy phần lớn tác nhân gây bệnh nguy hiểm ở lươn đồng là vi khuẩn và ký sinh trùng thuộc nhóm giun sán. - (2001) phân lập và xác định được chủng vi khuẩn từ lươn đồng bị bệnh ở Tỉnh Zhejiang, Trung Quốc là Aeromonas hydrophila. - Dấu hiệu bệnh lý ở lươn bệnh là lươn bỏ ăn, lồi mắt, da bị đỏ do xuất huyết và bơi lội lờ đờ trên mặt nước. - Bên trong xoang cơ thể, các nội quan có biểu hiện nhiễm trùng xuất huyết và dịch màu đỏ nhạt. - hydrophila là tác nhân chính gây nên bệnh xuất huyết ở lươn đồng nuôi ở tỉnh Sichuan, Trung Quốc. - Nhóm tác giả đã định danh mầm bệnh dựa trên đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa và giải trình tự gen 16S rDNA của vi khuẩn phân lập được từ gan thận và tỳ tạng của lươn đồng có dấu hiệu bệnh lý là nhiễm trùng xuất huyết. - Huaiqing (2011), đã phân lập và định danh vi khuẩn A. - hydrophila từ lươn bị bệnh xuất huyết ở 10/13 vùng nuôi lươn được thu mẫu. - Vi khuẩn cũng được gây cảm nhiễm và chứng minh có khả năng gây bệnh ở chuột. - hydrophila, vi khuẩn Gram dương Micrococcus luteus cũng được phân lập từ lươn bị xuất huyết. - Tuy nhiên, kết quả cảm nhiễm cho thấy chủng vi khuẩn này không có khả năng gây bệnh ở lươn. - Trong bài báo này, chúng tôi trình bày kết quả phân lập và xác định khả năng gây bệnh xuất huyết của vi khuẩn A. - hydrophila phân lập từ mẫu lươn đồng mua ở chợ thuộc địa bàn thành phố Cần Thơ và thu ở các bể nuôi ở Vĩnh Thạnh, An Giang.. - 2.1 Phương pháp thu và phân lập vi khuẩn từ mẫu bệnh phẩm. - Chỉ những mẫu bệnh phẩm còn sống mới được sử dụng để phân lập vi khuẩn.. - Trước khi phân lập vi khuẩn, khử trùng mặt ngoài cơ thể lươn bằng cồn 70 o C và lau sạch. - Các chủng vi khuẩn phân lập, sau khi tách ròng được trữ ở. - Nguồn gốc các chủng vi khuẩn được chọn nghiên cứu được trình bày ở bảng 1.. - Bảng 1: Nguồn gốc các chủng vi khuẩn phân lập từ lươn. - STT Mã PTN Nơi thu mẫu Cơ quan phân lập Năm thu mẫu. - 2.2 Phương pháp định danh vi khuẩn. - Hình dạng, kích thước và tính ròng của vi khuẩn được xác định bằng phương pháp nhuộm Gram (Barrow và Feltham 1993). - Tính di động của vi khuẩn được quan sát bằng cách nhỏ một giọt nước cất lên lam, trải đều lên lam một ít vi khuẩn, đậy bằng lammela và quan sát bằng kính hiển vi ở vật kính 100X. - 2.3 Gây cảm nhiễm. - Thí nghiệm được thực hiện tại phòng thí nghiệm cảm nhiễm Khoa Thuỷ sản, Đại học Cần Thơ trên hệ thống bể nhựa (35L). - Sau đó cho nước vào bể (4L), lắp hệ thống sục khí liên tục vài ngày để loại hết chlorine rồi đặt dây nilon làm giá thể Lươn được chọn cảm nhiễm có trọng lượng 18-25g/con, bên ngoài không trầy xước, màu sắc tươi sáng, phản ứng linh hoạt. - Vi khuẩn gây cảm nhiễm được nuôi tăng sinh trong môi trường TSB 24 giờ ở 28C. - Xác định mật độ vi khuẩn bằng máy so màu quang phổ ở bước sóng 590nm, kết hợp với phương pháp đếm số khuẩn lạc phát triển trên môi trường TSA (CFU/ml). - Lươn được gây cảm nhiễm mật độ là 10 7 CFU/lươn, mỗi con lươn được tiêm 0,1 ml dung dịch vi khuẩn ở phần cơ lưng gần đầu, theo dõi liên tục biểu hiện của lươn trong 7 ngày. - Những con lươn có dấu hiệu lờ đờ, bơi lội kém linh hoạt được thu để quan sát dấu hiệu bệnh lý, làm tiêu bản kính phết thận và tái phân lập vi khuẩn từ thận và tái định danh.. - 3 KẾT QUẢ. - 3.1 Dấu hiệu bệnh lý. - Lươn bệnh hoạt động chậm chạp, kém linh hoạt, trên thân có những vết loét và đốm xuất huyết. - Xét nghiệm kính phết mẫu máu và thận của lươn bệnh bằng cách soi tươi và nhuộm Giêm sa đều thấy rất nhiều vi khuẩn dạng hình que nằm rải rác trên vùng mô phết kính hoặc tập trung thành từng cụm. - Ở số mẫu thận của lươn bệnh, vi khuẩn xâm nhập vào và phá hủy tế bào làm tế bào bị vỡ. - Các mẫu ở thận cũng cho thấy đại thực bào vi khuẩn (Hình 2).. - 3.2 Phân lập vi khuẩn. - Kết quả phân lập được 6 chủng vi khuẩn (LT2T2(2), LT2T(3), LT4T(4), LT5T(4), LT6T(4) và LG2T(4)) từ thận và máu lươn bệnh. - Trên môi trường TSA sau 24 giờ ở 28 o C vi khuẩn phát triển thành các khuẩn lạc có hình tròn, lồi, màu kem, kích thước từ 2-3 mm (Hình 3). - Hình 1: Lươn bị xuất huyết và lở loét (phải). - 3.3 Đặc tính hình thái, sinh lý, sinh hoá của vi khuẩn phân lập từ lươn bệnh Sáu chủng vi khuẩn phân lập được từ lươn đồng bệnh xuất huyết. - Kết quả quan sát và phân tích các đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hóa của các chủng vi khuẩn phân lập từ lươn bệnh được trình bày ở bảng 2. - Chúng là vi khuẩn Gram âm, hình que, có khả năng gây tan huyết (Hình 4), di động, phản ứng dương tính với oxidase, catalase, có khả năng lên men trong cả hai điều kiện hiếu khí và kị khí.. - Đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hoá của các chủng vi khuẩn trong nghiên cứu này giống với chủng chuẩn A. - 3.4 Khả năng gây bệnh xuất huyết của của vi khuẩn A. - Khả năng gây bệnh xuất huyết của các chủng vi khuẩn A. - hydrophila phân lập từ lươn bệnh được xác định qua thí nghiệm cảm nhiễm bằng phương pháp tiêm dung dịch vi khuẩn ở mật độ 10 7 CFU/lươn. - Sau 24-48h cảm nhiễm, lươn ở các nghiệm thức tiêm vi khuẩn có dấu hiệu bệnh lý giống nhau là hoạt động kém linh hoạt, xuất hiện vết loét và bị xuất huyết khắp cơ thể (Hình 5A). - Dấu hiệu bệnh lý của. - lươn ở thí nghiệm cảm nhiễm giồng như dấu hiệu bệnh lý của các mẫu được mua ở chợ và thu ở bể nuôi. - Nhuộm Giemsa mẫu kính phết 10 mẫu thận của lươn bệnh thu từ thí nghiệm và quan sát dưới kính hiển vi 40X thì thấy được có nhiều đại thực bào, sự hiện diện vi khuẩn bên trong tế bào hồng cầu, tế bào hồng cầu bị trương to và vỡ ra (Hình 5B, 5C và 5D), tỷ lệ mẫu nhiễm khuẩn là 100%.. - Hình 2: Vi khuẩn trong các cơ quan của lươn đồng (Giemsa). - Cụm vi khuẩn ở thận (mũi tên). - (C) Vi khuẩn tấn công vào tế. - Những con lươn gần chết sau khi gây cảm nhiễm được giải phẫu và tái phân lập vi khuẩn ở thận. - Kết quả tái phân lập trên 10 mẫu lươn cảm nhiễm môi trường TSA sau 24 giờ ở nhiệt độ 28 0 C thì được 10 đĩa có khuẩn lạc phát triển. - giống với khuẩn lạc của vi khuẩn phân lập từ mẫu lươn bệnh xuất huyết lúc thu mẫu. - Chọn 6 chủng vi khuẩn tái phân lập được từ những lươn bệnh trong khoảng 24 -48 giờ sau khi cảm nhiễm để xác định các chỉ tiêu hình thái, sinh lý và sinh hóa thì được kết quả như ở bảng 3. - Các chủng vi khuẩn tái phân lập được có các chỉ tiêu về hình thái, sinh lý và sinh hóa giống như chủng gây cảm nhiễm ngoại trừ khả năng sử dụng citrate (chủng LT4T(4)-C1. - Kết quả trên cho thấy các chủng vi khuẩn tái phân lập được từ lươn bệnh do cảm nhiễm là A. - Hình 3: Khuẩn lạc trên môi trường TSA (phải) và trên môi trường Aeromonas (trái). - Hình 4: Vi khuẩn phân lập từ lươn bệnh có hình que, Gram âm (100X) (phải). - Vi khuẩn mọc trên môi trường thạch máu và gây tan huyết (trái). - Kết quả quan sát lươn chết của các bể lươn gây cảm nhiễm và bể đối chứng, dấu hiệu bệnh lý bên ngoài, kính phết thận và kết quả tái phân lập và tái định danh cho thấy mẫu lươn gây cảm nhiễm bị bệnh xuất huyết là do vi khuẩn A. - Kết quả này cũng tương tự như nghiên cứu trước đây khả năng gây bệnh xuất huyết của vi khuẩn A. - Bảng 2: Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hoá của vi khuẩn phân lập từ lươn đồng bệnh. - Chỉ tiêu Chủng vi khuẩn Popoff, 1984 và. - Mọc trên môi trường máu. - Hình 5: Dấu hiệu bệnh lý của lươn 48 giờ sau tiêm vi khuẩn. - A: Vùng lở loét và xuất huyết.. - C: Nhiều vi khuẩn tấn công vào tế bào hồng cầu (mũi tên). - Sáu chủng vi khuẩn phân lập từ lươn đồng bệnh có những đặc tính chung của nhóm vi khuẩn Aeromonas là Gram âm, có hình que ngắn có thể di động trong môi trường lỏng (TSB), cho phản ứng oxidase và catalase dương tính, có khả năng lên men glucose trong cả hai điều kiện hiếu khí và kị khí, mọc trên môi trường thạch máu và gây tan huyết và kháng với hợp chất 2,4-diamino-6,7-diisopropyl pteridine (O/129, 150 g) là hợp chất giúp phân biệt vi khuẩn Vibrio và Aeromonas (Popoff, 1984 và West et al. - Những chỉ tiêu điển hình giúp phân biệt vi khuẩn A. - hydrophila và vi khuẩn A. - (2001) phân lập và xác định được chủng vi khuẩn Aeromonas hydrophila từ lươn đồng bị bệnh xuất huyết ở Tỉnh Zhejiang, Trung Quốc cũng có những đặc điểm phân loại giống như những chủng vi khuẩn A. - (2010) phân lập, định danh và xác định Aeromonas hydrophila là tác nhân chính gây nên bệnh xuất huyết ở lươn đồng nuôi ở Sichuan, Trung Quốc.. - Các chủng vi khuẩn cũng được cảm nhiễm và xác định là có khả năng gây bệnh ở Misgurnus anguillicaudatus, Amiurus nebulosus và chuột. - Huaiqing (2011), phân lập và định danh vi khuẩn A. - hydrophila từ lươn bị bệnh xuất huyết ở 10/13 vùng. - Vi khuẩn cũng được gây cảm nhiễm và chứng minh có khả năng gây bệnh ở M. - Bảng 3: So sánh các chỉ tiêu sinh hóa 6 chủng vi khuẩn tái phân lập từ lươn thu ở thí nghiệm cảm nhiễm với chủng vi khuẩn cảm nhiễm. - Chủng vi khuẩn LT4T(2)-. - (TPL): tái phân lập. - (CN): cảm nhiễm. - Các chủng vi khuẩn phân lập từ các mẫu lươn đồng có dấu hiệu xuất huyết là A.. - Kết quả thí nghiệm cảm nhiễm xác định các chủng vi khuẩn này có khả năng gây xuất huyết lươn khỏe trong điều kiện cảm nhiễm trong phòng thí nghiệm giống như dấu hiệu bệnh ở lươn thu từ bể nuôi.