- Ch ươ ng 5 PH ƯƠ NG PHÁP PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION). - Nguyên t c c a ph ắ ủ ươ ng pháp PCR:. - DNA polymerase th c hi n t ng h p m ch m i t DNA m ch khuôn ự ệ ổ ợ ạ ớ ừ ạ c n s hi n di n c a m i chuyên bi t. - M i: ồ đo n DNA ng n, có kh năng b t c p b sung v i m t đ u c a ạ ắ ả ắ ặ ổ ớ ộ ầ ủ m ch khuôn. - sung v i 2 đ u c a m t trình t DNA, DNA polymerase s xúc tác ớ ầ ủ ộ ự ẽ t ng h p đo n DNA n m gi a 2 m i. - Ph n ng PCR: ả ứ. - Thành ph n ph n ng: ầ ả ứ - DNA b n m u ả ẫ. - M i xuôi và m i ng ồ ồ ượ c. - Enzyme polymerase (Taq polymerase, Pfu. - Các b ướ ủ c c a ph n ng: ả ứ. - Là m t chu i nhi u chu kỳ, m i chu kỳ g m 3 b ộ ỗ ề ỗ ồ ướ c:. - B ướ c 1: Bi n tính ế (denaturation). - DNA đ ượ c bi n tính nhi t đ cao, ế ở ệ ộ th ườ ng là 94 – 95 0C, trong th i gian 30s – 1 phút. - Nhi t đ c n cho s b t c p m i v i DNA m ch khuôn là ệ ộ ầ ự ắ ặ ồ ớ ạ Ta (Ta th p h n Tm kho ng 5 ấ ơ ả 0C).. - B ướ c 3: Kéo dài (elongation). - Nhi t đ đ ệ ộ ượ c tăng lên đ n 72 ế 0C, đ DNA polymerase ho t ể ạ đ ng kéo dài m ch. - Các y u t nh h ế ố ả ưở ng đ n ph n ng PCR ế ả ứ. - DNA s ch, l ạ ượ ng DNA s d ng cho PCR có khuynh h ử ụ ướ ng gi m ả (kho ng 100 ng) ả. - Gi m l ả ượ ng m u ẫ h n ch s n ph m “kí sinh”. - PCR có th th c hi n trên các m u không đ ể ự ệ ẫ ượ c b o qu n t t. - Enzyme polymerase đ u tiên ch u nhi t đ ầ ị ệ ượ c tách chi t t ế ừ Thermus aquaticus là Taq polymerase.. - Enzyme Pfu DNA polymerase thu nh n t vi khu n ậ ừ ẩ Pyroccus furiosus có kh năng ch u nhi t cao h n, có ho t tính 3’-5’ ả ị ệ ơ ạ exonuclease.. - Tth polymerase, tách chi t t ế ừ Thermus thermophilus, có kh năng ả phiên mã ng ượ c khi có RNA và Mn2+, khi có DNA và Mg2+ thì enzyme này th c hi n khu ch đ i DNA. - M i là ch tiêu quan tr ng nh t, quy t đ nh tính đ c hi u c a ph n ồ ỉ ọ ấ ế ị ặ ệ ủ ả ứ ng.. - Khi thi t k m i c n chú ý: thành ph n GC, kh năng b t c p b ế ế ồ ầ ầ ả ắ ặ ổ sung gi a “m i xuôi” và “m i ng ữ ồ ồ ượ c”, kh năng t o c u trúc “k p ả ạ ấ ẹ tóc”.. - M i đ c tr ng cho trình t DNA c n khu ch đ i và không b t c p ồ ặ ư ự ầ ế ạ ắ ặ v i trình t khác trên gen. - Các thành ph n khác c a ph n ng: ầ ủ ả ứ. - dNTP: th ườ ng s d ng n ng đ là 20 -200 µM đ i v i m i lo i. - quá nhi u ề t o s n ph m không đ c hi u ạ ả ẩ ặ ệ. - S l ố ượ ng chu kỳ: không v ượ t quá 40. - ng d ng c a ph Ứ ụ ủ ươ ng pháp PCR. - T o s l ạ ố ượ ng l n b n sao DNA ớ ả dòng hóa gene, gi i trình t , ả ự l p b n đ di truy n, s n xu t m u dò… ậ ả ồ ề ả ấ ẫ. - Bi n đ i m t trình t DNA ế ổ ộ ự : thêm v trí c a enzyme c t h n ch , ị ủ ắ ạ ế gây t o đ t bi n trên DNA, thêm trình t promoter, trình t g n ạ ộ ế ự ự ắ c a ribosome… ủ. - H n ch c a ph ạ ế ủ ươ ng pháp PCR - Ngo i nhi m: ạ ễ. - Vi c thi t l p ph n ng PCR và phân tích s n ph m đ ệ ế ậ ả ứ ả ẩ ượ c ti n hành các khu v c khác nhau. - Nhân b n không đ c hi u: ả ặ ệ - Các sai sót do Taq polymerase. - RT –PCR (reverse transcriptase –PCR): RNA cDNA DNA.. - RT – PCR (Realtime PCR – PCR đ nh l ị ượ ng): xác đ nh hàm l ị ượ ng s n ph m PCR t o ra t ng th i đi m. - Nguyên t c: ắ xác đ nh hàm l ị ượ ng s n ph m d a trên tín hi u ả ẩ ự ệ huỳnh quang.. - PCR nested: s d ng nhi u h n m t c p m i ử ụ ề ơ ộ ặ ồ thu nh n s n ậ ả ph m đ c hi u h n
Xem thử không khả dụng, vui lòng xem tại trang nguồn hoặc xem
Tóm tắt