- NGHIÊN CỨU MỘT SỐ MẦM BỆNH. - TRÊN NGHÊU (Meretrix lyrata SOWERBY, 1851) Ở TỈNH BẾN TRE Nguyễn Thanh Hà 1. - 1 Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản 2. - Ký sinh trùng, Meretrix lyrata, Nghêu Bến Tre, Perkinsus, Vibrio. - The presence of Perkinsus sp. - Finally, histological analysis indicated necrosis of gill, digestive tubular and foot, some changes in clam muscles, and the presence of Perkinsus sp., rickettsia in the internal organs.. - Nghiên cứu nhằm xác định sự biến đổi của một số yếu tố chất lượng nước và sự hiện diện của một số mầm bệnh trên nghêu Meretrix lyrata ở Bến Tre từ tháng 2 đến tháng 12 năm 2016. - Kết quả quan sát những dấu hiệu bất thường của nghêu trong mùa dịch bệnh cho thấy chúng thường có vỏ bị tổn thương, thịt không đầy vỏ (nghêu gầy), ngậm cát trong xoang cơ thể, màng áo xuất hiện những đốm/mảng trắng và tuyến tiêu hóa chuyển màu vàng. - Mật độ vi khuẩn Vibrio tổng số trong nước dao động từ cfu/mL trong đó 4 loài Vibrio parahaemolyticus, V. - Ngoài ra, nghiên cứu này đã xác định được ký sinh trùng nội ký sinh trên nghêu nuôi tại Bến Tre là Perkinsus sp. - với tỉ lệ nhiễm 35% và cường độ nhiễm bào tử/g. - Biểu hiện mô học đặc trưng của nghêu bệnh là cấu trúc của mô mang, ống gan tụy và chân nghêu biến đổi có hiện diện của ký sinh trùng Perkinsus sp., và sinh vật giống Rickettsia.. - Nghiên cứu một số mầm bệnh trên nghêu (Meretrix lyrata Sowerby, 1851) ở tỉnh Bến Tre. - Bên cạnh đó, các tác nhân gây bệnh như vi khuẩn, ký sinh trùng, virus, rickettsia cũng được các nhà nghiên cứu đề cập đến và được xem là nguyên nhân gây chết cho nhuyễn thể trong một số trường hợp (Sindermann, 1990). - Ký sinh trùng Perkinsus sp. - Vi khuẩn nội bào Ricketsia là tác nhân gây bệnh đã được tìm thấy trên các loài nghêu nuôi khác như nghêu Mercenaria mercenaria (Fries and Grant, 1991) và nghêu Meretrix lusoria (Wen et al., 1994). - Trên thế giới, nghiên cứu về các tác nhân gây bệnh đã được tiến hành trên nhiều đối tượng nhuyễn thể như nghêu Tapes decussatus (Villaba et al.,2004), hàu Crassostrea virginica (Chu et al., 1994). - Ở nước ta, nghiên cứu về bệnh trên các đối tượng thân mềm chưa nhiều. - Tuy nhiên, trong những năm gần đây đã có báo cáo của một số tác giả về tác nhân gây bệnh trên nghêu nuôi như đã phát hiện ký sinh trùng Perkinsus trên nghêu lụa (Paphia undulata) ở Kiên Giang và Bà Rịa - Vũng Tàu (Ngô Thị Thu Thảo, 2008). - (2011) đã tìm thấy Perkinsus olseni trên nghêu Bến Tre nuôi tại Cần Giờ, thành phố Hồ Chí Minh và xác định đây là tác nhân gây chết nghêu trong điều kiện nhiệt độ, độ mặn môi trường cao. - Vì vậy nghiên cứu được thực hiện nhằm xác định một số tác nhân gây bệnh trên nghêu ở tỉnh Bến Tre, từ đó cung cấp thông tin khoa học phục vụ cho việc quy hoạch đối tượng nuôi và những biện pháp quản lý dịch bệnh một cách hiệu quả.. - 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. - 2.1 Phương pháp thu mẫu. - 2.2 Phương pháp phân tích. - Phương pháp phân tích các yếu tố môi trường:. - Phương pháp xác độ mật độ vi khuẩn trong nước: Chỉ tiêu vi sinh của môi trường đó là vibrio tổng số. - Các đĩa được đem ủ trong tủ 28 o C trong 24 giờ, sau đó đem ra đọc kết quả. - Số lượng vi khuẩn được tính theo công thức:. - Phương pháp phân lập và định danh vi khuẩn trên nghêu: Mẫu nghêu sau khi được tách đôi, dùng que cấy tiệt trùng lấy một ít mẫu cấy lên môi trường đặc trưng ChromeAgar (ChromeAgar, Merk) và Thiosulfate citrate bile salt agar (TCBS, Merk). - Các chủng vi khuẩn được tách thuần và giữ ở -80 o C. - Vi khuẩn sau khi được tách ròng tiến hành kiểm tra chỉ tiêu về hình thái, sinh lý và sinh hoá như catalase, oxidase, phản ứng lên men hiếu khí, yếm khí, sinh H 2 S, O/F. - Hình dạng kích thước và tính ròng của vi khuẩn được xác định bằng phương pháp nhuộm Gram (Barrow and Feltham, 1993). - Tính di động của vi khuẩn được quan sát bằng cách nhỏ một giọt nước cất lên lame, trải đều lên lame một ít vi khuẩn, đậy bằng lamella và quan sát bằng kính hiển vi ở vật kính 40X. - Vi khuẩn được định danh theo phương pháp của Barrow và Feltham (1993) kết hợp với sử dụng bộ kit API 20 NE (BioMérieux, Pháp).. - Phương pháp nuôi cấy ký sinh trùng (Perkisus sp. - Bào tử ký sinh trùng được ly tâm, rửa sạch bằng nước cất và đếm bằng buồng đếm Improved Neubauer để xác định mức độ nhiễm. - CĐCN được đánh giá là số lượng bào tử /g mô thịt nghêu hoặc số bào tử nghỉ/cá thể vật chủ.. - 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Yếu tố chất lượng nước. - Kết quả phân tích chất lượng cho thấy c hất lượng nước tại bãi nuôi không có khác biệt giữa mùa mưa và mùa khô (Bảng 1). - Bảng 1: Một số yếu tố thủy lý hóa ở bãi nghêu. - Độ mặn. - 3.2 Vi khuẩn Vibrio tổng cộng trong nước Mật độ vi khuẩn Vibrio tổng trong nước tại khu vực bãi nuôi biến động trong khoảng 0,33 - 4,2x10 3 cfu/mL, mùa khô là 0,33 - 2,2x10 3 cfu/mL và mùa mưa là 0,93 - 4,2x10 3 cfu/mL. - Mật độ vi khuẩn Vibrio có hại ở mùa khô (khuẩn lạc màu xanh) là cfu/mL (chiếm của tổng Vibrio) và ở mùa mưa là 60 - 3900 cfu/mL (chiếm của tổng Vibrio. - Theo Moriarty (1998) mật độ vi khuẩn Vibrio vượt quá 10 3 CFU/mL sẽ gây ảnh hưởng xấu đến các đối tượng thủy sản. - Kết quả thu và phân tích trên 240 mẫu nghêu đã cho thấy nghêu nhiễm Perkinsus thường không thể hiện dấu hiệu bệnh lý điển hình, một số dấu hiệu sau:. - 3.4 Kết quả phân lập vi khuẩn ở nghêu Kết quả nhuộm Gram cho thấy đa số các chủng vi khuẩn bắt màu Gram âm, có dạng hình que ngắn.. - Vi khuẩn cho phản ứng oxidase và catalase dương tính, có khả năng lên men trong cả hai điều kiện hiếu khí và yếm khí trong môi trường O/F và mẫn cảm với O/129. - Dựa vào đặc điểm hình thái, các chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa của chủng vi khuẩn được kiểm tra dựa theo cẩm nang của Cowan and Steels (Barrow and Feltham, 1993) đã xác định được 4 chủng vi khuẩn Vibrio sp., với tần suất và tỉ lệ nhiễm như sau:. - Mặt khác, nghiên cứu của Bùi Ngọc Thanh và ctv, (2014) đã xác định được 13 chủng vi khuẩn khác nhau, trong đó, vi khuẩn Vibrio sp.. - chiếm ưu thế và có khả năng gây bệnh trên nghêu.. - 3.5 Kết quả kiểm tra ký sinh trùng. - Các cá thể nghêu thu trong nghiên cứu này đều có kích cỡ thương phẩm có chiều dài trung bình mm và khối lượng thịt trung bình là g. - Kết quả nghiên cứu của Villaba et al.. - 20 mm thu vào thời điểm nghêu chết (02/2010) và thời điểm không có hiện tượng nghêu chết (07/2010) đều có kết quả âm tính với Perkinsus. - Kết quả khảo sát cho thấy tỉ lệ cảm nhiễm Perkinsus trung bình là 35% và cường độ cảm nhiễm dao động trong khoảng bào tử/g thịt nghêu và trung bình là bào tử/g. - Tỉ lệ nhiễm ký sinh trùng Perkinsus ở mùa khô là 50%, mùa mưa là 30% và cường độ cảm nhiễm dao động từ bào tử/g và bào tử/g. - Nghiên cứu của Chu et al. - Kết quả nghiên cứu của Nguyễn Văn Hảo và ctv. - Cường độ cảm nhiễm dao động từ bào tử/g thịt nghêu, trung bình bào tử/g, cao nhất vào tháng bào tử/g) và thấp nhất vào tháng bào tử/g). - Như vậy, cường độ cảm nhiễm Perkinsus trong nghiên cứu này thấp có thể. - Mẫu mô nghêu sau khi được ngâm trong môi trường FTM khoảng 4 - 5 ngày, ở điều kiện tối, bào tử Perkinsus tồn tại dạng thể nghỉ (hypnospore), có dạng hình tròn và oval bắt màu xanh đen đậm khi nhuộm lugol (Hình 2A). - Các bào tử nghỉ được tách ra khỏi mô nuôi cấy bằng cách sử dụng NaOH có. - Bên trong bào tử nghỉ có nhiều hạt dinh dưỡng hoặc các bào tử động tùy theo từng giai đoạn phát triển của chúng. - Theo nghiên cứu của Ngô Thị Thu Thảo (2008) trên nghêu lụa (R. - undulate) cho thấy kích thước bào tử là 20 – 80 µm (trung bình 35 µm) và Nguyễn Văn Hảo và ctv.. - Hình 2: Bào tử Perkinsus sau khi nuôi cấy trong môi trường FTM. - (B) Bào tử Perkinsus giai đoạn vỏ kép. - 3.6 Biến đổi cấu trúc mô học ở các cơ quan của nghêu. - Sinh vật ký sinh làm tổn thương nghiêm trọng cho cấu trúc mang nghêu và xuất hiện nhiều tế bào máu, từ đó làm suy giảm chức năng hô hấp khi bệnh xảy ra và cấu trúc mang bị phá hủy nghiêm trọng.. - Hình 3: Một số biếu hiện mô học trên mang nghêu M. - (C): Bào tử Perkinsus trên mô liên kết mang. - do khi có tác nhân gây bệnh kí sinh hoặc các yếu tố vật lý, hóa học kích thích gây nên một số hiện tượng như sợi mang dính lại với nhau, trương phình kèm theo hiện tượng tập trung nhiều tế bào máu và hoại tử. - Kết quả ghi nhận sự biến đổi cấu trúc mô học của đề tài khá tương đồng với các kết quả nghiên cứu trước đây trên các loài nhuyễn thể. - Tiêu bản mô học trên mang nghêu có sự hiện diện của ký sinh trùng Perkinsus. - Khi các bào tử Perkinsus ký sinh trên mô liên kết mang, tuyến tiêu hóa và màng áo rất khó phát hiện trên tiêu bản mô học ở những cá thể bị nhiễm bệnh. - Sự hiện diện của Perkinsus có thể phá vỡ cấu trúc bình thường của mô đích, làm chết tế bào vật chủ và làm tăng cường sự hiện diện của tế bào máu khi có sự hiện diện của ký sinh trùng. - Kết quả nghiên cứu này tương tự như kết quả quan sát của nhiều tác giả. - các bào tử Perkinsus thường có liên quan đến việc phá hủy, làm mất cấu trúc bình thường của tế bào và từ đó làm mất chức năng của mô nhiễm (OIE, 2009). - Kết quả nghiên cứu này cũng tương tự với kết quả của Choi et al. - tìm thấy trên nghêu lụa (R. - Kết quả phân tích mô gan tụy nghêu cho thấy bào tử nghỉ của ký sinh trùng Perkinsus xâm nhập vào mô liên kết tuyến tiêu hóa làm thay đổi cấu trúc của cơ quan này. - Kết quả này tương tự với quan sát của các nhà nghiên cứu khác: các tế bào Perkinsus sp. - Hình 4: Một số biểu hiện mô học ở gan tụy nghêu M. - (B): Mô gan tụy ống biến dạng và nhiễm ký sinh trùng Perkinsus sp. - Trên mô chân nghêu bệnh cũng có một số biến đổi như các bó cơ liên kết rời rạc, hoại tử, mất cấu trúc và sự xuất hiện của nhiều không bào (Hình 5B). - Kết quả tương tự cũng được ghi nhận ở trên bào ngư (Haliotis discus hannai) khi tiến hành thí nghiệm với các độ mặn khác nhau (Park et al., 2013). - Hình 5: Một số biếu hiện mô học chân nghêu M. - Nghiên cứu đã xác định được 4 loài vi khuẩn đều thuộc vi khuẩn Vibrio (V. - Tỉ lệ nhiễm ký sinh trùng Perkinsus sp. - là 35% và cường độ nhiễm bào tử/g thịt. - Kết quả kiểm tra mô bệnh học của nghêu cho thấy Perkinsus sp. - Thành phần loài vi khuẩn trên nghêu nuôi (Meretrix lyrata) qua các đợt dịch chết hàng loạt tại các tỉnh ven biển Việt Nam. - histhopathology of Perkinsus sp. - Một số loài động vật nhuyễn thể (Mollusca) có giá trị kinh tế ở biển Việt Nam.. - Một số đặc điểm của ký sinh trùng Perkinsus sp. - Sự hiện diện của Perkinsus sp. - trên nghêu (Meretrix lyrata) tại vùng biển Cần Giờ - thành phố Hồ Chí Minh.. - Perkinsus sp. - Nghiên cứu mức độ cảm nhiễm và đặc điểm mô bệnh học của bệnh ký sinh trùng Perkinsus sp.. - Occurrence of Perkinsus sp