Ảnh hưởng của dung môi và thời gian kết tủa đến hiệu quả tinh sạch sơ bộ enzyme protease trích ly từ thịt đầu tôm

- ẢNH HƯỞNG CỦA DUNG MÔI VÀ THỜI GIAN KẾT TỦA ĐẾN HIỆU QUẢ TINH SẠCH SƠ BỘ ENZYME PROTEASE TRÍCH LY TỪ THỊT ĐẦU TÔM Hà Thị Thụy Vy, Trần Thanh Trúc và Nguyễn Văn Mười.
- Nghiên cứu được thực hiện nhằm xác định ảnh hưởng của các tác nhân kết tủa đến hiệu quả tinh sạch enzyme protease trong dịch trích ly từ 2 loại thịt đầu tôm (sú và thẻ chân trắng).
- Xáx định thời gian kết tủa thích hợp từ tác nhân được lựa chọn cũng được khảo sát.
- Kết quả cho thấy, ethanol đạt hiệu quả kết tủa protease cao cho cả hai dịch trích.
- Đối với dịch trích tôm sú, tỷ lệ mẫu: ethanol là 1: 4 (v/v) và thời gian kết tủa là 45 phút cho hoạt tính riêng, hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch đạt tương ứng 3,49 U/mg protein, 87,46% và 3,78 lần.
- Đối với tôm thẻ, tỷ lệ mẫu với ethanol là 1: 3 (v/v), thời gian kết tủa 30 phút cho giá trị lần lượt là 2,04 U/mg protein, 85,66% và 3,23 lần.
- Ảnh hưởng của dung môi và thời gian kết tủa đến hiệu quả tinh sạch sơ bộ enzyme protease trích ly từ thịt đầu tôm.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của các loại tác nhân kết tủa và tinh sạch protease trên phụ phẩm các loài tôm khác nhau để khảo sát các điều kiện hoạt động thích hợp nhằm xây dựng cơ sở ứng dụng nguồn enzyme protease trong chế biến thực phẩm..
- Hiệu suất thu hồi protease là tỷ lệ giữa tổng hoạt tính enzyme thu được sau quá trình tinh sạch và tổng hoạt tính enzyme trong mẫu trước khi đem tinh sạch.
- Độ tinh sạch là tỷ lệ giữa hoạt tính riêng của enzyme thu được sau quá trình tinh sạch và hoạt tính riêng của mẫu enzyme trước khi đem tinh sạch..
- Xác định khối lượng phân tử: Sử dụng phương pháp điện di trên gel SDS-PAGE để nhận diện protease và kiểm tra độ tinh sạch của protein..
- 2.5.1 Thí nghiệm 1: Đánh giá ảnh hưởng của việc sử dụng dung môi hữu cơ để kết tủa protease thô từ dịch trích thịt đầu tôm.
- Thí nghiệm được thực hiện nhằm tìm ra loại dung môi và tỷ lệ sử dụng thích hợp để đạt hiệu quả kết tủa protease từ dịch trích của thịt đầu tôm mà không làm biến tính enzyme.
- Sau khi kết tủa, hỗn hợp được ly tâm 6.000 rpm trong 20 phút ở 4 °C, thu được phần kết tủa..
- Phần kết tủa được hòa tan bằng dung dịch đệm phosphate pH 7,5.
- Xác định hoạt tính, hàm lượng protein hòa tan và tính toán hiệu quả tinh sạch enzyme protease..
- 2.5.2 Thí nghiệm 2: Hiệu quả kết tủa của (NH 4 ) 2 SO 4 đối với dịch trích protease thô.
- Sau đó, kết tủa thu được ở các phân đoạn muối bão hòa khác nhau sẽ được hòa tan trở lại bằng dung dịch đệm phosphate (pH 7,5) với thể tích vừa đủ.
- Tiếp theo, phần kết tủa được hòa tan sẽ đem đi thẩm tích trong dung dịch đệm phosphate (pH 7,5) bằng màng cellophane trong vòng 2 giờ (duy trì ở 0÷4C).
- Sau cùng, ứng với từng phân đoạn muối bão hòa xác định hoạt tính, hàm lượng protein hòa tan của protease và tính toán hiệu quả tinh sạch của enzyme..
- 2.5.3 Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của thời gian kết tủa đến hiệu quả thu nhận protease từ thịt đầu tôm.
- Thí nghiệm được thực hiện tương tự như thí nghiệm 1 và 2 với tác nhân kết tủa được lựa chọn từ 2 thí nghiệm này.
- Thời gian kết tủa thay đổi ở 5 mức khảo sát khác nhau từ 1575 phút.
- Sau khi kết tủa, mẫu được tiến hành tách lấy kết tủa và hòa tan lại trong đệm phosphate 7,5 trước khi xác định hoạt tính enzyme protease và hàm lượng protein hòa tan..
- Dựa trên kết quả kết tủa protein bằng muối hoặc dung môi hữu cơ khác nhau, tiến hành khảo sát hiệu quả của việc lọc màng.
- 3.1 Ảnh hưởng của dung môi hữu cơ trong kết tủa protease thô từ dịch trích thịt đầu tôm.
- Phương pháp kết tủa bằng dung môi hữu cơ được tiến hành dựa trên độ hòa tan của protein, phụ thuộc vào sự tương tác của các nhóm tích điện trong phân tử protein với các phân tử nước.
- 3.1.1 Khả năng kết tủa protease từ dịch trích thịt đầu tôm bằng ethanol.
- Ethanol là một trong những loại dung môi được sử dụng nhiều không chỉ ở các nghiên cứu kết tủa enzyme trong phòng thí nghiệm mà còn cả trong sản xuất công nghiệp.
- Hiệu quả của ethanol trong việc kết tủa protease từ địch trích được thể hiện ở Bảng 1 và Hình 1..
- Kết quả từ Bảng 1 cho thấy hiệu quả khi sử dụng ethanol trong quá trình tinh sạch protease từ thịt đầu tôm thẻ và thịt đầu tôm sú, hoạt tính riêng của enzyme ở các tỷ lệ ethanol bổ sung đều tăng so với mẫu protease thô ban đầu..
- Bảng 1: Hiệu quả tinh sạch protease từ dịch trích thịt đầu tôm với dung môi ethanol Tỷ lệ dịch enzyme.
- Hình 1: Độ tinh sạch protease ở các tỷ lệ ethanol khác nhau Hoạt tính riêng protease đạt giá trị cao nhất khi.
- Điều này được giải thích là do khi tăng tỷ lệ enzyme thô: ethanol lên thì hằng số điện môi của dung dịch thay đổi, các phân tử dung môi sẽ loại lớp phân tử nước bao lấy xung quanh phân tử protein, làm kết tủa nhanh protein (Polaina and MacCabe, 2007).
- Trong khi đó, khi tỷ lệ dung môi sử dụng tăng vượt quá 1: 3 ở tôm thẻ và 1: 4 ở tôm sú, hằng số điện môi thay đổi quá mức, thúc đẩy sự phá hủy enzyme, gây biến tính không thuận nghịch, dẫn đến hiệu quả tinh sạch giảm.
- thấy, việc sản xuất chế phẩm enzyme protease từ cá tra theo phương pháp kết tủa bằng ethanol với tỷ lệ dung môi: dịch trích enzyme là 3: 1 (v/v) cho hoạt tính protease đạt 49,26 U/g, hoạt độ riêng protease là 1,42 U/mg protein .
- 3.1.2 Khả năng kết tủa protease từ thịt đầu tôm bằng acetone.
- Kết quả khảo sát ảnh hưởng của dung môi acetone đến hiệu suất thu hồi, độ tinh sạch và hoạt tính riêng của protease được trình bày ở Bảng 2 và Hình 2..
- Bảng 2: Hiệu quả tinh sạch protease từ thịt đầu tôm với dung môi acetone Tỷ lệ dịch.
- Kết quả từ Bảng 2 và Hình 2 cho thấy, acetone cũng tương tự như ethanol, tỷ lệ dịch enzyme thô từ thịt đầu tôm: dung môi thay đổi hiệu quả tinh sạch enzyme protease tăng và đạt giá trị cao nhất ở tỷ lệ 1: 2 đối với thịt đầu tôm thẻ và 1: 3 đối với thịt đầu tôm sú.
- Ở các tỷ lệ tiếp theo, hiệu quả tinh sạch giảm dần nhưng vẫn cho thấy hiệu quả tinh.
- Độ tinh sạch (lần).
- Tỷ lệ enzyme thô: ethanol Thịt đầu.
- Thịt đầu.
- Hình 2: Độ tinh sạch protease ở các tỷ lệ acetone khác nhau 3.1.3 Khả năng kết tủa protease từ dịch trích.
- thịt đầu tôm bằng isopropanol.
- isopropanol đến hiệu suất thu hồi, độ tinh sạch và hoạt tính riêng của protease được trình bày ở Bảng 3 và Hình 3..
- Bảng 3: Hiệu quả tinh sạch protease từ thịt đầu tôm với dung môi isopropanol Tỷ lệ dịch.
- Kết quả từ Bảng 3 cho thấy, hiệu quả tinh sạch enzyme protease từ thịt đầu tôm thẻ đạt giá trị cao nhất khi sử dụng tỷ lệ dịch protease thô và isopropanol là 1: 5, hiệu suất thu hồi protease là.
- 67,70% và độ tinh sạch protease tăng 2,12 lần (Hình 3).
- Trong khi đó, đối với dịch protease thô từ thịt đầu tôm sú, hiệu quả tinh sạch đạt giá trị cao nhất ở tỷ lệ isopropanol là 1: 3..
- Hình 3: Độ tinh sạch protease ở các tỷ lệ isopropanol sử dụng.
- Tỷ lệ enzyme thô: acetone Thịt đầu tôm.
- Thịt đầu tôm.
- Tỷ lệ enzyme thô: isopropanol Thịt đầu tôm.
- Thịt đầu tôm sú.
- Khi tiếp tục tăng tỷ lệ enzyme thô: isopropanol lên 1: 6 (đối với thịt đầu tôm thẻ) và 1: 4 (đối với thịt đầu tôm sú), hiệu quả tinh sạch giảm dần so với mẫu đối chứng.
- Nếu tiếp tục tăng tỷ lệ isopropanol trong thể tích hỗn hợp vượt quá 85%, hiệu suất thu hồi enzyme và mức tinh sạch của chế phẩm giảm..
- 3.2 Hiệu quả kết tủa của ammonium sulfate đối với dịch chiết protease thô.
- Kết quả khảo sát hiệu quả kết tủa bằng.
- Đối với mẫu kết tủa ở phân đoạn F35÷45% (NH 4 ) 2 SO 4 , hoạt tính protease cũng như độ tinh sạch protease từ dịch trích thịt đầu tôm (cả tôm sú và tôm thẻ) khá thấp.
- Ngược lại, mẫu kết tủa ở phân đoạn F55÷65% (NH 4 ) 2 SO 4 cho hiệu quả tinh sạch tốt nhất.
- Khi nồng độ (NH 4 ) 2 SO 4 được sử dụng ở các phân đoạn cao hơn F55÷65% hiệu quả tinh sạch giảm dần.
- Tuy nhiên, khi nồng độ hóa chất kết tủa lớn hơn 65%, hoạt tính riêng càng thấp, việc sử dụng nồng độ (NH 4 )2SO4 quá cao cũng làm biến tính không thuận nghịch protease..
- Bảng 4: Hiệu quả tinh sạch protease từ thịt đầu tôm với dung môi (NH 4 ) 2 SO 4.
- Kết quả thí nghiệm cho thấy, hoạt tính riêng cũng như hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch (Hình 4) không quan hệ tuyến tính với nồng độ muối.
- Hình 4: Độ tinh sạch protease ở các phân đoạn muối (NH 4 ) 2 SO 4.
- 3.3 So sánh, chọn lựa chất kết tủa enzyme protease tốt nhất.
- Bên cạnh việc tìm ra tỷ lệ sử dụng thích hợp của từng loại hóa chất trong quá trình kết tủa.
- protease, hiệu quả sử dụng của các loại hóa chất cần được so sánh nhằm kết tủa protease tạo chế phẩm enzyme có độ tinh sạch cao, tỷ lệ thu hồi lớn cũng như gia tăng khả năng ứng dụng enzyme..
- Độ tinh sạch (lần) Phân đoạn (NH 4 ) 2 SO 4.
- Bảng 5: So sánh hiệu quả tinh sạch protease bằng các tác nhân khác nhau Mẫu Tác nhân kết tủa Hoạt tính riêng.
- Độ tinh sạch (lần) Thịt đầu.
- Isopropanol a e a Thịt đầu.
- Kết quả thu nhận ở Bảng 5 cho thấy, trong cả hai trường hợp kết tủa protease từ dịch trích thịt đầu tôm sú và tôm thẻ, khi sử dụng các tác nhân khác nhau đều có sự khác biệt ý nghĩa thống kê trong giá trị của các chỉ tiêu theo dõi.
- Bên cạnh đó, hiệu quả tinh sạch, hoạt tính riêng cũng như hiệu suất thu hồi ở mẫu tôm sú đều cao hơn so với mẫu tôm thẻ khi sử dụng 4 tác nhân kết tủa.
- Tuy nhiên, kết tủa bằng ethanol tỏ ra khá ổn định cho cả hai dịch trích khi hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch không có sự dao động lớn..
- 3.4 Ảnh hưởng của thời gian kết tủa đến hiệu quả thu nhận protease từ thịt đầu tôm.
- dung môi thì thời gian thực hiện kết tủa cũng ảnh hưởng đến hiệu suất, hoạt tính và độ tinh sạch của enzyme sau khi tinh sạch..
- Kết quả thu nhận được từ Bảng 6 cho thấy, hiệu quả tinh sạch enzyme protease đạt giá trị cao nhất khi thời gian kết tủa bằng ethanol là 30 phút đối với tôm thẻ (hoạt tính riêng đạt 2,04 U/mg protein .
- Khi tiếp tục tăng thời gian kết tủa với ethanol, hiệu quả tinh sạch giảm dần..
- Với thời gian kết tủa là 75 phút, hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch giảm.
- Khi tăng thời gian kết tủa, lượng enzyme thu nhận được càng nhiều, tuy nhiên khi thời gian kết tủa kéo dài lại làm tăng khả năng mất lớp nước liên kết với protein, gây biến tính của protein bởi dung môi nên hiệu quả tinh sạch giảm (Polaina and MacCabe, 2007)..
- Bảng 6: Ảnh hưởng của thời gian kết tủa đến hiệu quả kết tủa protease Thời gian.
- kết tủa (phút).
- 3.5 Tinh sạch sơ bộ protease từ thịt đầu tôm bằng phương pháp lọc màng.
- Kết quả thể hiện hiệu quả tinh sạch protease từ thịt đầu tôm bằng phương pháp lọc màng được thể hiện ở Bảng 7..
- Bảng 7: Hiệu quả tinh sạch protease từ thịt đầu tôm sau quá trình lọc màng.
- tôm thẻ Thịt đầu tôm sú Hoạt tính riêng.
- (U/mg protein Độ tinh sạch (lần Hiệu suất.
- Ở mẫu protease từ thịt đầu tôm sú, hoạt tính riêng đạt 4,73 U/mg protein , độ tinh sạch cũng tăng lên đáng kể.
- Hoạt tính riêng cao của mẫu enzyme sau bước kết tủa bằng ethanol.
- là điều kiện thuận lợi cho việc tinh sạch và thu nhận protease.
- Kết quả cũng cho thấy, hiệu quả của việc sử dụng ethanol trong việc kết tủa sơ bộ enzyme, tăng hiệu quả tinh sạch protease ở các bước tiếp theo.
- 2, 4: protease sau quá trình kết tủa ethanol 1: 3 (v/v), lọc màng 50 kDa.
- Kết quả nghiên cứu cho thấy, dung môi ethanol (99,5% thể tích) đạt hiệu quả kết tủa protease tốt nhất đối với cả hai dịch trích enzyme thô được trích ly từ thịt đầu tôm sú và thịt đầu tôm thẻ.
- Tỷ lệ mẫu: ethanol là 1: 4 (v/v) cho trường hợp thịt đầu tôm sú và 1:3 (v/v) cho tôm thẻ với thời gian kết tủa tương ứng là là 45 phút và 30 phút.
- niger-Tinh sạch bằng phương pháp lọc gel và lọc màng.
- Nghiên cứu trích ly enzyme protease từ thịt đầu tôm sú (Penaeus monodon).
- Nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme từ gan và tụy cá Tra (Pangasius hypophthalmus) bằng phương pháp kết tủa