- Nghiên cứu ảnh hưởng của hỗn hợp vi khuẩn Bacillus sp chọn lọc lên tăng trưởng của luân trùng nước lợ Brachinonus plicatilis được nghiên cứu. - Thí nghiệm II, sau khi kết thúc thí nghiệm I luân trùng ở từng nghiệm thức sẽ được gây cảm nhiễm với vi khuẩn Vibrio harveyi, xác định tỷ lệ sống của luân trùng sau khi gây cảm nhiễm. - Kết quả cho thấy mật độ luân trùng và cá thể luân trùng mang trứng ở các nghiệm thức bổ sung vi khuẩn cao hơn có ý nghĩa thống kê so với đối chứng và đạt giá trị cao nhất ở nghiệm thức bổ sung hỗn hợp vi khuẩn B7 + B41 (Bacillus amyloliquefaciens), vi khuẩn Bacillus có khả năng lấn át Vibrio.. - Năng suất luân trùng đã được cải thiện khi bổ sung vi khuẩn Bacillus cũng như chế phẩm vi sinh vào hệ thống nuôi. - Luân trùng ở nghiệm thức bổ sung Bacillus có thể duy trì tỷ lệ sống cao hơn khi gây cảm nhiễm với vi khuẩn Vibrio harveyi, tuy nhiên khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p>0,05).. - Luân trùng nước lợ (Brachionus plicatilis) được nuôi và sử dụng trong sản xuất giống của hơn 60 loài cá biển và 18 loài giáp xác (Nagata, 1989).. - Nhờ có kích thước nhỏ, bơi lội chậm chạp, sống lơ lửng trong nước làm cho luân trùng trở thành con mồi thích hợp cho ấu trùng các loài cá và giáp xác biển có kích thước miệng nhỏ (Snell và Carrillo, 1984). - Hơn nữa, do đặc điểm ăn lọc không chọn lọc nên luân trùng có thể được giàu hoá bằng các chất dinh dưỡng cần thiết hay kháng sinh để đưa vào cơ thể ấu trùng nuôi (Lubzens et al., 1989). - Vì vậy, luân trùng đã trở thành nguồn thức ăn tươi sống không thể thiếu trong sản xuất giống của nhiều loài giáp xác và cá biển.. - Nhật Bản là nơi đầu tiên thực hiện nghiên cứu nuôi sinh khối luân trùng vào năm 1964 (Hirata, 1979. - Ở Trung Quốc, năm 1980, các nghiên cứu về luân trùng làm thức ăn cho ấu trùng cá biển được tiến hành (Chen, 1991. - Tuy nhiên, đến nay thì luân trùng vẫn được nuôi ở qui mô thí nghiệm, chủ yếu phục vụ cho ương nuôi các loài Mullet, cá măng, Pacific threatfin và mahimah, Red drum, cá chẽm trắng và California halibut. - Hino (1991) cho rằng sự thay đổi của quần thể vi khuẩn hay sự nhiễm tạp của các loài khác sẽ ảnh hưởng đến quá trình nuôi luân trùng. - Các loại vi khuẩn trong bể nuôi luân trùng phát triển sẽ có những ảnh hưởng có lợi hay có hại tùy thuộc vào loại vi khuẩn. - Do vậy, mục tiêu của nghiên cứu này nhằm đánh giá ảnh hưởng của các loài vi khuẩn hữu ích lên quần thể luân trùng thông qua chỉ tiêu tăng trưởng và tỉ lệ mang trứng của luân trùng trong phòng thí nghiệm và kiểm tra khả năng chịu đựng của luân trùng khi cảm nhiễm với vi khuẩn gây bệnh Vibrio, để làm cơ sở ứng dụng vào sản xuất, nâng cao năng suất và chất lượng luân trùng.. - Nước dùng cho nuôi luân trùng (25‰) được pha từ 2 nguồn nước trên. - Luân trùng có nguồn gốc từ trường Đại học Gent, Bỉ được nuôi giữ giống tại Phòng thí nghiệm nuôi thức ăn tự nhiên thuộc Bộ môn Thủy sinh học Ứng dụng. - Luân trùng được nhân giống 1 tháng trước khi tiến hành thí nghiệm. - Tảo Chlorella được sử dụng cho luân trùng ăn với lượng 100.000 tế bào/luân trùng/ngày đêm (Trần Sương Ngọc và Nguyễn Hồng Lộc, 2006).. - 2.2.1 Phương pháp sát trùng luân trùng để tạo con non vô trùng. - Để có được mật số luân trùng mong muốn và tỷ lệ luân trùng mang trứng cao, trước khi bố trí thí nghiệm luân trùng đã được nhân giống bằng cách nuôi trong các keo nhựa 10 L, với mật độ nuôi ban. - Luân trùng được cho ăn bằng tảo Chlorella. - Sau khi luân trùng đã mang trứng tiến hành sát trùng luân trùng để được ấu trùng vô trùng theo qui trình đã được ứng dụng tại Trung tâm Khảo cứu Artemia, Khoa Nông nghiệp, Trường Đại học Gent, Bỉ (Nguyễn Thị Ngọc Tinh et al., 2010).. - Qui trình thực hiện như sau: Trứng amictic từ luân trùng mang trứng đã được đếm và tính toán để có được mật độ luân trùng mong muốn ban đầu theo nhu cầu của thí nghiệm. - Sau đó luân trùng mang trứng được rửa sạch với nước biển 25‰, lọc qua lưới có kích thước mắt lưới 300 µm sau đó rửa sạch lại nhiều lần qua lưới 60 µm. - Cô đặc luân trùng trước khi tiến hành cho dung dịch glutaraldehyde 200 ppm vào. - Sau 1 giờ, luân trùng trong mỗi ống sẽ được lọc qua lưới 60 µm nhằm loại bỏ xác luân trùng đã chết sau đó lọc và rửa lại nhiều lần qua lưới 30 µm để giữ lại tất cả các trứng amictic, trứng được ấp trong chai chứa 250 mL nước 25‰. - Sau 3 giờ các trứng amictic đã được nở ra, để yên trong khoảng 1 phút để cho luân trùng đã chết lắng hết xuống dưới đáy.. - Tiến hành thu phần trên đổ vào chai mới, xác định số lượng luân trùng mới nở và tiến hành bố trí thí nghiệm.. - Thí nghiệm 1: Đánh giá ảnh hưởng của vi khuẩn Bacillus lên sự tăng trưởng của quần thể luân trùng.. - Luân trùng vô trùng đã được bố trí trong các ống falcon 50 mL với mật độ ban đầu là 30 cá thể/mL và được đặt trên mày lắc. - Nghiệm thức 1: Không bổ sung vi khuẩn (đối chứng: ĐC).. - Nghiệm thức 2: Bổ sung vi khuẩn B7+ B41 (B. - Sau mỗi chu kỳ nuôi thu lại luân trùng trong cùng một nghiệm thức và nuôi mới hoàn toàn. - Thí nghiệm 2: Gây cảm nhiễm luân trùng với Vibrio sau khi bổ sung Bacillus.. - Quần thể luân trùng ở chu kỳ 4 được thu vào cuối thí nghiệm 1, giữ riêng luân trùng theo 4 nghiệm thức riêng biệt. - Luân trùng đã được đếm mỗi ngày để xác định tỷ lệ sống. - Mật độ luân trùng được xác định hằng ngày bằng cách sử dụng micropipet 100 µL, cố định và nhuộm màu bằng Lugol. - (N c /N o ) x 100 (N c : Số luân trùng lúc kết thúc thí nghiệm. - N o : Số luân trùng lúc bắt đầu thí nghiệm). - 3.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của vi khuẩn Bacillus lên sự tăng trưởng của quần thể luân trùng. - Theo Fulks (1991) nhiệt độ dao động thích hợp cho luân trùng là 20 – 30 0 C vì vậy nhiệt độ trong thí nghiệm nằm trong khoảng thích hợp cho sự phát triển của luân trùng.. - Do mật độ nuôi luân trùng ở cuối chu kỳ càng nhiều thì số lượng cho ăn càng cao khi đó sẽ có sự tích tụ và phân hủy thức ăn dư thừa cũng như chất thải của luân trùng sẽ làm tăng hàm lượng TAN trong thí nghiệm.. - Theo Hirata và Nagata (1982) chất thải và chất bài tiết của luân trùng phần lớn là ammonia dưới dạng hòa tan chủ yếu là ammonia và ure nên khi mật độ luân trùng tăng cao thì TAN cao. - Trong mỗi chu kỳ nuôi hoàn toàn không thay nước và thức ăn cho luân trùng là tảo nên một phần ion NH 4 + (một dạng phân đạm ưa chuộng của thực vật) đã được tảo hấp thu, nên TAN luôn ở mức cao và tăng dần về cuối thí nghiệm.. - Do các thức ăn dư thừa và chất thải của luân trùng nên hàm lượng các chất dinh dưỡng gốc đạm có khuynh hướng gia tăng vào cuối thí nghiệm. - Hàm lượng nitrite trung bình của tất cả các nghiệm thức là 0,14 mg/L hoàn toàn không gây hại đối với luân trùng. - Theo Groeneweg và Schluter (1981), thì hảm lượng NO 2 - từ 10 – 20 mg/L thì không gây độc cho luân trùng.. - Hình 2: Hàm lượng NO 2 - trung bình ở các chu kỳ nuôi trong thí nghiệm 3.1.2 Biến động mật độ vi khuẩn. - Qua Hình 3 cho thấy mật độ vi khuẩn ở các nghiệm thức khác biệt không có ý. - Mật độ vi khuẩn tổng có sự biến động khác nhau giữa các chu kỳ thu mẫu cũng như ở từng nghiệm thức. - bởi Rombaut, 2001, một số vi khuẩn trong hệ thống nuôi luân trùng sử dụng làm nguồn thức ăn, cho nên mật độ vi khuẩn có sự biến động giữa các chu kỳ thu mẫu.. - Hình 3: Mật độ vi khuẩn tổng cộng trung bình ở các chu kỳ nuôi trong thí nghiệm b. - Biến động mật độ vi khuẩn Bacillus. - Mật độ vi. - Hình 4: Mật độ vi khuẩn Bacillus trung bình ở các chu kỳ nuôi trong thí nghiệm c. - Biến động mật độ vi khuẩn Vibrio. - Ở Hình 5 cho thấy ở các nghiệm thức có bổ sung vi khuẩn cũng như chế phẩm vi sinh thì thấy mật độ Vibrio giảm dần. - về cuối thí nghiệm, khác biệt có ý nghĩa thống kê với nghiệm thức ĐC và các nghiệm thức còn lại ở các chu kỳ cuối (p<0,05), điều này chứng tỏ nếu bổ sung vi khuẩn Bacillus định kỳ sẽ làm kìm hãm sự phát triển của Vibrio, ở nghiệm thức ĐC mật độ Vibrio luôn dao động và không ổn định, do sự tích lũy thức ăn dư thừa và chất thải của luân trùng làm. - Theo Moriaty (1999), mật độ vi khuẩn Vibrio vượt quá 10 3 CFU/mL sẽ gây hại đến đối tượng nuôi, vì vậy trong suốt thí nghiệm mật độ Vibrio nằm trong giới hạn cho phép và không ảnh hưởng đến quần thể luân trùng.. - Hình 5: Mật độ vi khuẩn Vibrio trung bình ở các chu kỳ nuôi trong thí nghiệm 3.1.3 Sự phát triển của luân trùng. - Biến động mật độ luân trùng. - Tốc độ tăng trưởng của luân trùng trong 4 chu kỳ nuôi phát triển ổn định và tăng rất nhanh. - Điều này chứng tỏ luân trùng bắt đầu mang trứng và sinh sản nhanh từ ngày thứ 2. - Mật độ luân trùng trong 2 ngày đầu tăng giống nhau không có sự khác biệt (p >. - Ở mỗi chu kỳ mật độ luân trùng thường sẽ đạt giá trị cao vào ngày thứ 3, mật độ luân trùng ở nghiệm thức B7 + B41 ở chu kỳ 1 là cao nhất, mật độ đạt 1.000,78 cá thể/mL, mật độ trung bình cũng cao nhất là 401,62 cá thể/mL, thấp nhất là ở nghiệm thức ĐC là 92,46 cá thể/mL. - Ở nghiệm thức B7 + B41 và nghiệm thức Pro W thì mật độ luân trùng trung bình đều có giá trị cao hơn so với nghiệm thức ĐC. - Kết quả này hoàn toàn không chịu ảnh hưởng bởi yếu tố thức ăn vì lượng thức ăn cung cấp vào cho luân trùng ở tất cả các nghiệm thức đều như nhau. - Ở chu kỳ 1 mật độ luân trùng cao nhất ở nghiệm thức B7 + B41, ở các chu kỳ sau. - mật độ luân trùng bắt đầu ổn định nên không tăng cao. - Do một chu kỳ chỉ kéo dài 4 ngày sẽ không thấy rõ sự khác biệt giữa các nghiệm thức nên đến chu kỳ 2, 3 mới thấy rõ sự tăng trưởng và phát triển của quần thể luân trùng.. - Phân tích cho thấy ở nghiệm thức ĐC thì mật độ luân trùng khác biệt có ý nghĩa thống kê với hai nghiệm thức còn lại (p <. - 0,05), điều này chứng tỏ khi bố trí vi khuẩn cũng như chế phẩm vi sinh sẽ làm cho mật độ luân trùng tăng đáng kể do môi trường nuôi ngày càng xấu cũng như mật độ luân trung càng cao sẽ làm mật độ luân trùng giảm dần vào cuối mỗi chu kỳ nuôi, ảnh hưởng đến kết quả sự phát triển của luân trùng.. - Theo Hagiwata (1995, trích bởi Rombaut, 2001), thì một số vi khuẩn trong hệ thống nuôi luân trùng có thể được luân trùng sử dụng làm nguồn thức ăn bổ sung tác dụng kích thích sự tăng trưởng và phát triển của luân trùng, một số vi khuẩn có tác dụng ức chế sự phát triển của các dòng vi khuẩn có hại tạo điều kiện tốt cho luân trùng phát triển.. - Hình 6: Biến động mật độ luân trùng qua các chu kỳ nuôi trong thí nghiệm b. - Biến động mật độ và tỷ lệ luân trùng mang tr ứng. - Tỷ lệ luân trùng mang trứng được thể hiện ở Hình 7, mật độ luân trùng mang trứng sẽ gia tăng theo mật độ luân trùng, tỷ lệ mang trứng của luân trùng ngày đầu bố trí ở các nghiệm thức nằm trong khoảng từ con/mL), ở chu kỳ 1 nghiệm thức B7 + B41 thì mật độ luân trùng mang trứng cao nhất trung bình đạt 46,89 con/mL, số luân trùng cao nhất đạt 143,12 con/mL đạt 18,8%, hệ số trứng đạt 5,3%. - mật độ luân trùng mang trứng cao ở nghiệm thức B7 + B41 chứng tỏ luân trùng có sử dụng vi khuẩn, chu kỳ hai thấy rõ được mật độ luân trùng mang trứng ở nghiệm thức ĐC thấp nhất, ở chu kỳ 2 và 3 mật độ luân trùng mang trứng cũng tăng cao ở nghiệm thức có bổ sung vi khuẩn và chế phẩm vi sinh so với nghiệm thức ĐC. - Do môi trường nước có lượng thức ăn dư thừa cùng với mật độ trứng tăng nên tỷ lệ luân trùng mang trứng giảm vào cuối mỗi chu kỳ nuôi. - Điều này chứng tỏ mật độ mang trứng của luân trùng phụ thuộc rất nhiều vào môi trường và thức ăn.. - Hình 7: Biến động mật độ luân trùng mang trứng qua các chu kỳ nuôi trong thí nghiệm 3.2 Thí nghiệm 2: Gây cảm nhiễm luân. - trùng với vi khuẩn Vibrio. - Sau khi kết thúc thí nghiệm 1, sử dụng luân trùng được nuôi với vi khuẩn Bacillus để gây cảm nhiễm với Vibrio harveyi, mật độ trung bình là 19×10 7 CFU/mL. - bổ sung vi khuẩn thì mật độ Vibrio giảm đáng kể trung bình chỉ con 0,7×10 3 CFU/mL, quần thể luân trùng cũng giảm. - Theo Moriaty (1999) trích bởi Ngô Thị Huyền (2011), mật độ vi khuẩn Vibrio vượt quá 10 3 CFU/mL thì sẽ gây hại đến đối tượng nuôi, quần thể luân trùng ban đầu từ 463,8 con/mL giảm còn 19,7 con/mL.. - Tốc độ suy giảm của luân trùng nhanh nhất là ở nghiệm thức ĐC, luân trùng chết hoàn toàn ở ngày thứ 6 ở Hình 8, các nghiệm thức còn lại mật độ luân trùng cũng giảm rõ sau 6 ngày thí nghiệm.. - Đặc biệt là ở các nghiệm thức luân trùng có bổ sung Bacillus ở thí nghiệm trước, loại vi khuẩn có thể hạn chế sự phát triển của vi khuẩn có hại nên. - có tác dụng duy trì mật độ luân trùng đồng thời kìm hãm sự phát triển của Vibrio. - Các nghiệm thức khác biệt không có ý nghĩa thống kê, do sau 16 ngày thí nghiệm nên quần thể luân trùng đã bắt đầu chậm gia tăng mật độ, nên khi gây thí nghiệm cảm nhiễm mật độ luân trùng sẽ mau suy tàn hơn.. - Bảng 1: Biến động mật độ vi khuẩn Vibrio trước và sau khi bổ sung. - Hình 8: Biến động mật độ luân trùng khi được gây cảm nhiễm với Vibrio harveyi 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT. - Mật độ bố trí ban đầu là 30 cá thể/mL với ba nghiệm thức thì nghiệm thức B7 + B41 (Bacillus amyloliquefaciens) thì mật độ luân trùng mang trứng trung bình đạt 46,89 con/mL cũng như mật độ luân trùng đạt 1.000,78 cá thể/mL, mật độ trung bình đạt 401,62 cá thể/mL cao hơn so với nghiệm thức ĐC và nghiệm thức Pro W. - Mật độ vi khuẩn Bacillus dao động từ CFU/mL, cao nhất ở nghiệm thức B7 + B41 có giá trị trung bình từ CFU/mL, nghiệm thức đối chứng thấp nhất có giá trị trung bình CFU/mL nên môi trường nuôi có bổ sung chế phẩm vi sinh hay vi khuẩn Bacillus thì năng suất nuôi luân trùng sẽ được nâng cao cũng như môi trường nước được cải thiện đáng kể. - Các nghiệm thức có bổ sung vi khuẩn cũng như chế phẩm vi sinh thì. - Luân trùng qua thời gian bổ sung với Bacillus có khả năng duy trì tỷ lệ sống tốt hơn khi gây cảm nhiễm với vi khuẩn V. - Cần có nhiều hơn những nghiên cứu về sức sống cũng như khả năng tăng trưởng của luân trùng thông qua việc bổ sung vi khuẩn và chế phẩm vi sinh. - Cần tìm hiểu sâu hơn về khả năng lọc của luân trùng đối với việc bổ sung vi khuẩn có lợi vào hệ thống nuôi. - Nghiên cứu các thí nghiệm liên quan đến sự kiểm soát hệ vi sinh trong môi trường nuôi luân trùng nhằm chọn lọc giống luân trùng có chất lượng tốt hơn.. - Nghiên cứu thiết lập hệ thống nuôi kết hợp luân trùng (Brachionus plicatilis) với bể nước xanh. - Nghiên cứu hệ thống nuôi luân trùng năng suất cao và ổn định thích hợp với điều kiện Việt Nam