- DOI:10.22144/ctu.jvn.2019.141 ẢNH HƯỞNG CỦA THỨC ĂN CÓ BỔ SUNG CHITOSAN LÊN MỘT SỐ CHỈ TIÊU. - Nghiên cứu bổ sung chitosan vào thức ăn cá tra nhằm đánh giá khả năng ảnh hưởng của chitosan lên một số chỉ tiêu miễn dịch không đặc hiệu của cá tra.. - Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên với 4 nghiệm thức g/kg thức ăn), ba lần lặp lại. - Tiến hành thu mẫu sau 2 và 4 tuần cho cá ăn thức ăn có bổ sung chitosan. - Kết quả nghiên cứu cho thấy chỉ tiêu huyết học hoạt tính lysozyme của cá ở các nghiệm thức được bổ sung chitosan tăng cao hơn có ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức đối chứng ở các lần thu mẫu. - ictaluri, tỉ lệ chết của cá ở các nghiệm thức có bổ sung chitosan thấp hơn so với nghiệm thức đối chứng (60. - nghiệm thức bổ sung 1 g chitosan/kg thức ăn có tỉ lệ chết thấp nhất (40. - Kết quả nghiên cứu cho thấy bổ sung chitosan ở mức 1 g/kg thức ăn làm tăng khả năng đáp ứng miễn dịch cá tra và tăng khả năng kháng vi khuẩn ở cá.. - Ảnh hưởng của thức ăn có bổ sung chitosan lên một số chỉ tiêu miễn dịch không đặc hiệu ở cá tra (Pangasianodon hypophthalmus). - Ngoài ra, một số nghiên cứu bổ sung chitosan vào thức ăn làm tăng miễn dịch của cá hồi (Meshkini et al., 2012), cá chép (Aathi et al., 2013), đồng thời nghiên cứu của Maqsood et al. - (2010) còn chỉ ra việc bổ sung 2% chitosan vào thức ăn có thể làm giảm tỉ lệ chết của cá chép khi cảm nhiễm với vi khuẩn Aeromonas hydrophila. - 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Bố trí thí nghiệm bổ sung chitosan Cá tra giống khỏe có kích cỡ 10 - 15 g/cá được chuyển về phòng thực nghiệm Bộ môn Bệnh học Thủy sản, Khoa Thủy sản, Đại học Cần Thơ và thuần dưỡng trong 2 tuần để cá thích nghi với điều. - Thí nghiệm bổ sung chitosan (Sigma) vào thức ăn được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên lặp lại ba lần với bốn nghiệm thức: NT1 (đối chứng – 0 g chitosan/kg thức ăn), NT2 (1 g chitosan/kg thức ăn), NT3 (5 g chitosan/kg thức ăn) và NT4 (10 g chitosan/kg thức ăn), mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần. - Tiến hành thu mẫu ở tuần thứ 2 và tuần thứ 4 sau khi cá được cho ăn thức ăn có bổ sung chitosan. - Mỗi lần thu mẫu máu của 15 cá/nghiệm thức để phân tích các chỉ tiêu huyết học, hoạt tính lysozyme và bổ thể.. - Vi khuẩn E. - Sau 4 tuần cho ăn thức ăn có bổ sung chitosan, cá được tiến hành cảm nhiễm với vi khuẩn E.. - Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 5 nghiệm thức, bao gồm 1 nghiệm thức đối chứng (tiêm 0,1 mL nước muối sinh lý) và 4 nghiệm thức bổ sung chitosan g được tiêm vi khuẩn E. - ictaluri, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần.. - Mật độ hồng cầu: Sau 2 tuần bổ sung chitosan, mật độ hồng cầu ở các nghiệm thức có bổ sung chitosan dao động từ tb/mm 3 . - Chỉ NT2 (1 g chitosan/kg) có mật độ hồng cầu tb/mm 3 ) tăng cao hơn so với nghiệm thức. - trong khi các nghiệm thức NT3 và NT4 đều có mật độ hồng cầu thấp hơn đối chứng, tuy nhiên sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê (p>0,05) (Bảng 1). - Sau 4 tuần bổ sung chitosan, mật độ hồng cầu (HC) dao động trong khoảng x10 6 tb/mm 3 và tăng cao có ý nghĩa thống kê ở tất cả các nghiệm thức được bổ sung chitosan so với nghiệm thức đối chứng (1,92 x10 6 tb/mm 3 ) (p<0,05). - khác biệt có ý nghĩa thống kê so với các nghiệm thức còn lại. - Ngoài ra, mật độ hồng cầu của các nghiệm thức bổ sung chitosan ở lần thu mẫu thứ 2 (sau 4 tuần) cũng tăng cao có ý nghĩa thống kê so với lần thứ 1 (sau 2 tuần) (p<0,05).. - Kết quả thí nghiệm này cho thấy bổ sung chitosan vào thức ăn làm gia tăng tế bào hồng cầu ở cá. - Nghiên cứu trước đây cũng đã ghi nhận sự gia tăng mật độ hồng cầu và trị số hematocrite của cá trôi (Cirrhina mrigala) khi bổ sung 1% chitin và chitosan vào thức ăn (Mari et al., 2014). - Một nghiên cứu khác, bổ sung chitosan dạng nano (0, 1, 3 và 5 g/kg) vào thức ăn cho cá rô phi trong 70 ngày, kết quả cho thấy mật độ hồng cầu của cá được bổ sung nano chitosan tăng cao hơn so với cá nhóm đối chứng (p<0,05). - Cá được bổ sung 5 g chitosan có mật độ hồng cầu tăng cao nhất và khác biệt có ý nghĩa thống kê so với các nghiệm thức khác (p<0,05). - Ngoài ra, hàm lượng hemoglobin của cá ở nhóm bổ sung 3 và 5 g chitosan tăng cao và khác biệt thống kê với cá đối chứng (p<0,05) (El- Naby et al., 2019).. - Bảng 1: Mật độ tổng hồng cầu (x10 6 tb/mm 3 ) và tổng bạch cầu (x10 3 tb/mm 3 ) của cá tra ở tuần 2 và tuần 4 sau khi ăn thức ăn bổ sung chitosan. - Nghiệm Thức Hồng cầu (x10 6 tb/mm 3 ) Tổng bạch cầu (x10 3 tb/mm 3. - Tổng bạch cầu: Tương tự, mật độ tổng bạch cầu ở các nghiệm thức có bổ sung chitosan dao động trong khoảng x10 3 tb/mm 3 và tăng cao hơn so với nghiệm thức đối chứng (306,2 x10 3 tb/mm 3. - nghĩa thống kê sau 2 tuần bổ sung chitosan (p>0,05) (Bảng 1). - Sau 4 tuần, mật độ tổng bạch cầu của cá được bổ sung chitosan tăng cao có ý nghĩa thống kê so với cá đối chứng. - Đặc biệt, cá được bổ sung 1 g chitosan có tổng bạch cầu cao nhất (373,8 x10 3. - tb/mm 3 ) và khác biệt có ý nghĩa so với các nghiệm thức còn lại (p<0,05). - Ngoài ra, tổng bạch cầu của cá được bổ sung chitosan trong 4 tuần cao hơn so với cá bổ sung 2 tuần, tuy nhiên sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p>0,05).. - (2019) cũng đã chỉ rõ, tổng bạch cầu của cá được bổ sung chitosan dạng nano cũng tăng cao hơn so với cá đối chứng, tuy nhiên chỉ có nghiệm thức bổ sung 5 g/kg cho kết quả tăng cao nhất và có ý nghĩa thống kê so với các nghiệm thức còn lại. - Nghiên cứu bổ sung 1% chitin và chitosan vào thức ăn ở cá mú cho thấy tổng bạch cầu của nhóm cá được bổ sung. - chitin và chitosan tăng cao hơn cá ở nhóm đối chứng từ tuần thứ 1 sau khi được bổ sung và tiếp tục tăng cao ở tuần thứ 2, thứ 3 (Harikrishnan et al., 2012a, b).. - Bạch cầu đơn nhân: Sau 2 tuần bổ sung chitosan, mật độ các loại tế bào bạch cầu đơn nhân (BCĐN) của cá ở các nghiệm thức bổ sung chitosan tăng cao hơn nghiệm thức đối chứng (14,3-18,8. - trong đó nghiệm thức bổ sung 1%. - chitosan có mật độ bạch cầu đơn nhân cao nhất (18,8 x10 3 tb/mm 3. - tuy nhiên sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức đối chứng (13,7 x10 3 tb/mm 3 ) (p>0,05) (Hình 1). - Tương tự ở tuần 4, các nghiệm thức được bổ sung chitosan có mật độ tế bào đơn nhân cao hơn ở nghiệm thức đối chứng. - Đặc biệt, mật độ bạch cầu đơn nhân của nghiệm thức bổ sung 1% cao hơn có ý nghĩa thống kê so với các nghiệm thức khác (p<0,05).. - Hình 1: Mật độ bạch cầu đơn nhân của cá tra sau khi bổ sung chitosan. - Bạch cầu trung tính: Sau khi bổ sung chitosan, mật độ bạch cầu trung tính của cá được bổ sung đều tăng cao hơn cá ở nghiệm thức đối chứng trong cả hai lần thu mẫu (Hình 2). - Ở lần thu mẫu thứ 2 (4 tuần), sự gia tăng bạch cầu trung tính của cá ở các nghiệm thức bổ sung chitosan có ý nghĩa thống kê. - so với nghiệm thức đối chứng (p<0,05). - Riêng nghiệm thức bổ sung 1 g/kg chitosan, có mật độ bạch cầu trung tính cao nhất tb/mm 3. - khác biệt thống kê so với các nghiệm thức còn lại (p<0,05).. - Nồng độ chitosan bổ sung vào thức ăn (g/kg thức ăn) 2 tuần 4 tuần. - Hình 2: Mật độ bạch cầu trung tính của cá tra sau khi bổ sung chitosan. - Tế bào lympho: Mật độ tế bào lympho ở các nghiệm thức có bổ sung chitosan đều cao hơn so với nghiệm thức đối chứng trong cả 2 lần thu mẫu, tuy nhiên sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê (p>0,05) (Bảng 2). - Bên cạnh đó, mật độ lympho ở lần thu mẫu 2 đều tăng cao hơn so với lần thu mẫu 1 ở tất cả các nghiệm thức.. - tuy nhiên chỉ có nghiệm thức NT2 và NT3 là khác biệt có ý nghĩa thống kê với đối chứng. - Sau 4 tuần bổ sung chitosan, mật độ tiểu cầu giảm nhiều so với lần thu mẫu đầu tiên, chỉ có nghiệm thức NT2 (1 g/kg thức ăn) có mật độ tiểu cầu cao hơn có ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức đối chứng (p<0,05).. - Bảng 2: Mật độ bạch cầu lympho, tiểu cầu của cá tra sau khi bổ sung chitosan. - Nghiệm Thức Lympho (×10 3 tb/mm 3 ) Tiểu cầu (×10 3 tb/mm 3. - Kết quả cho thấy các chỉ tiêu huyết học bao gồm bạch cầu, tế bào lympho, bạch cầu trung tính và hoạt tính lysozyme trong huyết thanh đều tăng đáng kể so với nghiệm thức đối chứng từ tuần 1 – 4. - (2014) đã nghiên cứu bổ sung chitosan với các hàm lượng. - Kết quả cũng cho thấy các chỉ tiêu huyết học ở các nghiệm thức được bổ sung chitosan tăng đáng kể và khác biệt có ý nghĩa thống kê với nghiệm thức đối chứng (p<0,05). - Một nghiên cứu khác bổ sung 2%. - Kết quả cho thấy, ở các nghiệm thức có bổ sung chitin và chitosan có số lượng các tế bào bạch cầu tăng lên đáng kể so với nghiệm thức đối chứng. - Tế bào lympho, bạch cầu đơn nhân, bạch cầu trung tính tăng lên đáng kể ở các nghiệm thức có bổ sung chitosan so với các nghiệm thức còn lại (Harikrishnan et al., 2012a). - (2012b) tiếp tục bổ sung 1% chitosan vào chế. - Kết quả cho thấy mật độ hồng cầu, bạch cầu trung tính, bạch cầu đơn nhân và tế bào lympho ở các nghiệm thức bổ sung chitosan tăng lên đáng kể so với nghiệm thức đối chứng.. - 3.2 Kết quả hoạt tính lysozyme và bổ thể Sau 2 tuần bổ sung chitosan, hoạt tính lysozyme. - trong huyết thanh cá có sự biến động chênh lệch dao động từ 70 - 95 µg/mL, tuy nhiên sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p>0,05) giữa các NT có bổ sung chitosan với NT đối chứng. - Sau 4 tuần cho ăn, hoạt tính lysozyme trong huyết thanh của cá ở các nghiệm thức được bổ sung chitosan đều tăng cao hơn so với lần thu mẫu đợt 1. - Hình 3: Hoạt tính lysozyme trung bình của các nghiệm thức sau khi cho ăn 2 tuần và 4 tuần (µg/mL) Các giá trị cùng mang mẫu tự (A, B) hay (a, b) giống nhau thể hiện sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p>0,05).. - Kết quả thí nghiệm này cho thấy hoạt tính lysozyme của cá được bổ sung chitosan tăng lên, hoàn toàn phù hợp với các nghiên cứu trước đây. - (2012a) đã bổ sung 2% chitin và chitosan vào khẩu phần ăn cá mú trong 4 tuần. - Kết quả cho thấy hoạt tính lysozyme trong huyết thanh của cá được bổ sung 2% chitin và chitosan tăng cao hơn đáng kể so với cá đối chứng. - Một thí nghiệm khác đã bổ sung β-1,3 glucan, chitosan và raffinose vào khẩu phần ăn cá chép Koi (Cyprinus carp) trong 8 tuần. - Kết quả cho thấy β-1,3 glucan kích thích gia tăng hoạt tính lysozyme, hoạt tính NBT, khả năng chống oxy hóa thông qua chỉ tiêu superoxide dismutase của cá ở các nghiệm thức bổ sung chitosan và raffinose và được duy trì cho đến ngày thứ 56 (Lin et al., 2011). - (2006) khi nghiên cứu bổ sung chitosan vào thức ăn cho cá chép trong thời gian 90 ngày cho thấy hoạt tính lysozyme tăng có ý nghĩa thống kê so với đối chứng ở mức p<0,001. - Trong 2 ngày đầu sau khi tiêm vi khuẩn gây cảm nhiễm, cá ở tất cả các nghiệm thức đều bình thường,. - đến ngày thứ 3 nghiệm thức không bổ sung chitosan bắt đầu có cá chết. - Cá ở các nghiệm thức có bổ sung chitosan bắt đầu chết vào ngày thứ 4 sau khi cảm nhiễm, các cá còn lại ở các nghiệm thức có dấu hiệu bơi lờ đờ và bơi tập trung ở các nơi sục khí. - Sau 14 ngày thí nghiệm, tỷ lệ chết của cá ở nghiệm thức không bổ sung chitosan có tỷ lệ chết cao nhất, đạt. - nghiệm thức NT2 (1 g/kg thức ăn) có tỷ lệ chết thấp nhất là 43,3%. - Trong khi đó, nghiệm thức NT3 và NT4 có tỷ lệ chết lần lượt là 56,6% và 53%.. - Nghiệm thức đối chứng âm (NTĐC) tiêm nước muối sinh lý, cá hoạt động bình thường và không chết.. - Hình 5: Biểu đồ tỷ lệ chết tích lũy của cá tra ở các nghiệm thức bổ sung chitosan khi cảm nhiễm với E.. - ictaluri gây bệnh gan thận mủ thấp nhất ở nghiệm thức NT2. - Cá được bổ sung chitosan có đáp ứng miễn dịch tốt nhất ở nghiệm thức NT2 (1 g/kg thức ăn) thể hiện qua việc kích thích sản sinh tổng bạch cầu, bạch cầu đơn nhân, bạch cầu trung tính, tiểu cầu và hoạt tính lysozyme. - Kết quả cho thấy các chỉ tiêu huyết học, hoạt tính thực bào, hoạt tính lysozym và bổ thể đều tăng cao ở các nghiệm thức bổ sung chitosan. - Tỷ lệ chết của cá ở nghiệm thức có bổ sung 1% chitosan là 10% thấp hơn so với nghiệm thức đối chứng (25. - Thí nghiệm bổ sung chitosan với các hàm lượng g/kg thức ăn cá chẽm và gây cảm nhiễm với Vibrio anguillarum. - Kết quả cũng ghi nhận nghiệm thức bổ sung 10 g chitosan/kg thức ăn có tỉ lệ chết thấp nhất là 25% (Ranjan et al., 2014). - Kết quả cho thấy nghiệm thức kết hợp bổ sung chitosan và B. - veronii ở mức cao, có ý nghĩa thống kê so với các nghiệm thức bổ sung chitosan và B. - (2012) đều cho thấy cá được bổ sung chitosan thì có tỷ lệ chết thấp hơn khi cảm nhiễm với tác nhân gây bệnh so với nghiệm thức đối chứng.. - Cá tra được ăn thức ăn có bổ sung chitosan trong 4 tuần cho thấy có sự kích thích đáp ứng miễn dịch thông qua việc gia tăng một số chỉ tiêu tế bào huyết học như mật độ tổng bạch cầu, bạch cầu đơn nhân, bạch cầu trung tính. - ictaluri, tỉ lệ chết của cá được bổ sung chitosan giảm đáng kể. - Như vậy, từ kết quả thí nghiệm cho phép kết luận bổ sung chitosan vào thức ăn sẽ kích thích đáp ứng miễn dịch của cá, đồng thời có thể phòng vệ cho cá tra chống lại tác nhân gây bệnh gan thận mủ. - Nên bổ sung chitosan vào thức ăn cá ở liều 1%