- ẢNH HƯỞNG OXYTRETRACYCLIN LÊN ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH TỰ NHIÊN CỦA TÔM THẺ CHÂN TRẮNG (Litopenaeus vannamei). - CẢM NHIỄM Vibrio parahaemolyticus Trần Việt Tiên và Đặng Thị Hoàng Oanh. - Thí nghiệm được tiến hành để đánh giá ảnh hưởng của oxytetracyclin lên các chỉ tiêu miễn dịch và tính mẫn cảm của tôm chân trắng (Litopenaeus vannamei) với bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (AHPND). - Tôm g/con) được bố trí ngẫu nhiên (30 con/bể) với bốn nghiệm thức (NT) (lặp lại 3 lần), gồm: (NT1) đối chứng không cảm nhiễm. - (NT2) đối chứng cảm nhiễm. - Tổng tế bào máu, hoạt động của phenoloxidase (PO), superoxide dimutase (SOD) và phóng thích các gốc oxy tự do (RBs) giảm ở NT2, NT3 và NT4 sau 36 giờ cảm nhiễm.. - Ảnh hưởng oxytretracyclin lên đáp ứng miễn dịch tự nhiên của tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) cảm nhiễm Vibrio parahaemolyticus. - Trong số các bệnh nguy hiểm, bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (AHPND) do vi khuẩn Vibrio paraheamolyticus đã gây nhiều thiệt hại cho người nuôi tôm. - Không giống ở động vật có xương sống, khả năng đáp ứng miễn dịch là gồm có đáp ứng miễn dịch đặc hiệu và không đặc hiệu (miễn dịch tự nhiên), động vật không xương sống (trong đó có tôm) chủ yếu dựa vào miễn dịch không đặc hiệu bao gồm những cơ chế miễn dịch tế bào và miễn dịch thể dịch góp phần vào những phản ứng bảo vệ tôm bằng cách hạn chế sự xâm nhập hoặc làm sạch và giết những mầm bệnh vi sinh xâm nhập vào mô và máu (Yodmuang et al., 2006). - Tuy tôm có khả năng đề kháng mầm bệnh vi sinh vật thông qua hệ miễn dịch tự nhiên, nhưng tác nhân gây bệnh vẫn có thể xâm nhiễm và gây ra tỉ lệ chết cao khi hệ miễn dịch bị suy giảm dưới sự tác động của các yếu tố môi trường (Takahasi et al., 1995), trong đó kháng sinh là những nhân tố góp phần làm suy giảm hệ miễn dịch và tăng sự mẫn cảm của tôm với mầm bệnh (Ren et al., 2014).. - Trong nghiên cứu này, kết quả về ảnh hưởng của oxytetraxyclin lên đáp ứng miễn dịch tự nhiên của tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) cảm nhiễm Vibrio parahaemolyticus được trình bày nhằm bổ sung thông tin làm cơ sở khoa học cho việc sử dụng kháng sinh hợp lý trong nuôi tôm thẻ chân trắng.. - 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Hệ thống thí nghiệm. - Thí nghiệm được thực hiện tại trại thực nghiệm, Bộ môn Bệnh học Thuỷ sản, Khoa Thuỷ Sản, Trường Đại học Cần Thơ. - Nước dùng trong thí nghiệm có độ mặn 25‰. - được khử trùng bằng chlorine (30 ppm) và sục khí liên tục để loại bỏ chlorine trước khi bố trí thí nghiệm và trong suốt thời gian thí nghiệm.. - 2.2 Tôm thí nghiệm. - thì bố trí thí nghiệm. - Sau khi bố trí vào các bể thí nghiệm, tôm được thuần dưỡng 3 ngày rồi mới tiến hành thí nghiệm.. - 2.3 Chuẩn bị vi khuẩn và gây cảm nhiễm Chủng vi khuẩn V. - parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tụy cấp từ bộ sưu tập vi khuẩn của Khoa Thủy sản, Trường Đại học Cần Thơ sau khi lấy ra từ tủ -80C được nuôi trong môi trường nutrient broth (NB, Merck) có bổ sung 1,5% NaCl (NB. - ủ ở 28C trong 18 giờ, sau đó vi khuẩn được cấy sang đĩa tryptic soy agar (TSA, Merck) có bổ sung 1,5%. - Ghi nhận màu sắc và hình dạng khuẩn lạc, nhuộm Gram để kiểm tra tính thuần của vi khuẩn. - Khuẩn lạc vi khuẩn thuần được nuôi tăng sinh trong môi trường NB + ở 28C. - Sau đó, đo và xác định mật độ vi khuẩn bằng máy so màu quang phổ ở bước sóng 610 nm để xác định mật độ vi khuẩn (CFU/ml). - Tôm được gây cảm nhiễm bằng cách ngâm trong dung dịch vi khuẩn (mật độ 10 8 CFU/ml) trong 15 phút. - Sau đó cho tôm và dung dịch vi khuẩn vào bể thí nghiệm.. - lượng nước trong bể, sau đó siphon đáy bể 2 ngày/lần, mỗi lần 30% lượng nước trong bể cho đến khi kết thúc thí nghiệm.. - 2.4 Bố trí và theo dõi thí nghiệm. - Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 4 nghiệm thức (NT), mỗi NT lặp lại 3 lần (mật độ bố trí 30 tôm/bể), gồm có: (NT1) Đối chứng không cảm nhiễm. - (NT2) Đối chứng cảm nhiễm vi khuẩn V. - và (NT4) cảm nhiễm vi khuẩn V.. - parahaemolyticus, cho ăn thức ăn trộn oxytetracylin (2 g/kg thức ăn) sau 1 ngày cảm nhiễm.. - Thí nghiệm được theo dõi trong thời gian 14 ngày sau cảm nhiễm. - Tôm được cho ăn thức ăn Grobest với lượng thức ăn bằng 2% trọng lượng thân (do sau khi cảm nhiễm tôm thường giảm ăn) và cho ăn 4 lần/ngày trong suốt thời gian thí nghiệm 14 ngày. - Các chỉ tiêu môi trường được đo hàng ngày trong suốt 14 ngày thí nghiệm gồm pH, NH 3 /NH 4. - Mẫu tôm thí nghiệm (3 tôm/bể) được thu sau 3 ngày sau cảm nhiễm (số tôm thu mẫu phân tích các chỉ tiêu miễn dịch không tính vào tỉ lệ tôm chết tích lũy) để cố định khối gan tụy trong dung dịch Davidson ’ s AFA trong khoảng 48 giờ, sau đó chuyển sang cồn 70 o (Lightner, 1996). - 2.6 Phương pháp xác định các chỉ tiêu miễn dịch. - Mẫu tôm (3 tôm/bể/lần thu mẫu) được thu trước khi gây cảm nhiễm và vào ngày 3, 6 và 9 sau khi cảm nhiễm để lấy máu phân tích các chỉ tiêu miễn dịch. - Số tôm thu mẫu phân tích các chỉ tiêu miễn dịch không tính vào tỉ lệ tôm chết tích lũy.. - Tổng tế bào máu (THC) được xác định theo phương pháp của Le Moullac et al. - Số lượng tế bào máu được đếm (lặp lại 2 lần) bằng buồng đếm hồng cầu và quan sát dưới kính hiển vi (40X) và tính bằng công thức: THC = C * 10 * 5 x 10 (tb/mm 3 ) (C là tổng số tế bào máu trên 5 vùng đếm).. - Hoạt tính của phenoloxidase (PO) được xác định theo phương pháp của Herández-López et al.. - 100 µL mẫu máu pha loãng trong dung dịch chống đông sau khi được ly tâm, loại bỏ phần dịch phía trên, phần tế bào máu được hòa tan trong dung dịch đệm cacodylate-citrate, rồi ủ với 50 µL trypsin (1 mg/ml) trong 10 phút ở 26°C trước khi thêm 50 µL L-DOPA (3 mg/ml) và 800 µl cacodylate buffer.. - Hoạt tính phóng thích các gốc oxy tự do (RBs) được xác định theo phương pháp của Song and Hsieh (1994). - L-lysine (0,2%) để tăng sự kết dính của tế bào. - Tế bào máu được rửa 3 lần với 100 µL dung dịch Hanks, nhuộm với 100 µl NBT solution (0,3%) trong 30 phút, loại bỏ NBT solution, sau đó rửa 3 lần với 100 µL methanol (70%) và để khô. - Hoạt tính của superoxide dismutase (SOD) được xác định theo phương pháp của Beauchamp and Fridovich (1971). - Sự khác biệt về tỉ lệ tôm chết tích lũy và các chỉ tiêu miễn dịch giữa các nghiệm thức thí nghiệm được xử lý thống kê ANOVA 1 nhân tố (ở mức ý nghĩa P<0,05) bằng phần mềm SPSS 16.. - Ở hai nghiệm thức cảm nhiễm vi khuẩn V.. - Tôm ở hai nghiệm thức không cảm nhiễm vi khuẩn V.. - Tuy nhiên, ở NT2 và NT4 (cảm nhiễm vi khuẩn V. - parahaemolyticus) gan tụy tôm có những biến đổi mô bệnh học, đặc trưng là ống gan tụy teo, giảm số lượng B, R và F (Hình 2B), tế bào gan tụy thoái hóa bong tróc rơi vào lòng ống và tế bào máu xuất hiện quanh các cụm vi khuẩn. - Lightner et al.. - Hình 2: Mô gan tụy trên tôm sau khi cảm nhiễm. - (A) Nghiệm thức không cảm nhiễm. - (B) Nghiệm thức cảm nhiễm AHPND. - Mũi tên chỉ các tế bào gan thoái hóa và rơi vào lòng ống, các tế bào máu tập. - trung quanh các cụm vi khuẩn trong vùng bị hoại tử 3.3 Tỉ lệ tôm chết tích lũy. - Kết quả thí nghiệm cho thấy, tỷ lệ tôm chết cao nhất ở NT2 với tỷ lệ tôm chết tích lũy sau 14 ngày cảm nhiễm là khác biệt có ý nghĩa thống kê (P<0,05) so với 3 nghiệm thức còn lại là NT1, NT3 và NT4 lần lượt là . - Hình 3: Tỷ lệ tôm chết tích lũy ở các nghiệm thức sau 14 ngày thí nghiệm 3.4 Các chỉ tiêu miễn dịch. - 3.4.1 Tổng tế bào máu. - Trước khi cảm nhiễm vi khuẩn, tổng tế bào máu ở tôm thí nghiệm ở tất cả các nghiệm thức không có sự khác biệt. - Ở nghiệm thức đối chứng không cảm nhiễm (NT1), THC vẫn không đổi giữa các lần thu mẫu trước và sau cảm nhiễm (Bảng 1). - không đổi đến kết thúc thí nghiệm đối với NT3 và NT4. - Riêng NT2, THC có xu hướng phục hồi và tăng lại ở ngày thứ 6 sau cảm nhiễm. - THC giảm ở các nghiệm thức cảm nhiễm vi khuẩn và sử dụng kháng sinh phù hợp với nghiên cứu của Hsieh et al. - (2008) and Ren et al. - Nghiên cứu của Hsieh et al. - (2008) còn ghi nhận THC tăng sau 3 ngày cảm nhiễm gần bằng với giá trị trước cảm nhiễm.. - Bảng 1: Sự biến động các chỉ tiêu miễn dịch ở tôm thí nghiệm trước và sau khi cảm nhiễm vi khuẩn V. - thức trước cảm nhiễm 3 ngày. - sau cảm nhiễm 6 ngày. - sau cảm nhiễm 9 ngày sau cảm nhiễm Tổng tế bào máu (10 2 tb/mm 3. - 3.4.2 Hoạt tính của phenoloxidase. - Sau cảm nhiễm, hoạt tính của PO ở NT2, NT3 và NT4 giảm rồi tăng dần. - Ở NT2 (cảm nhiễm), hoạt tính của PO duy trì không đổi đến ngày thứ 6 sau cảm nhiễm và tăng vào ngày thứ 9. - Hoạt tính của PO ở NT3 và NT 4, giảm đến ngày thứ 6 và tăng trở lại vào ngày thứ 9 nhưng vẫn thấp hơn so với trước cảm nhiễm (Bảng 1).. - Nghiên cứu của Ren et al. - (2014) chỉ ra rằng hoạt tính của PO giảm dần khi cho tôm ăn thức ăn trộn florfenicol và chỉ tăng trở lại khi ngưng sử dụng kháng sinh. - Trong nghiên cứu này, tôm được cho ăn oxytetracylin trong 5 ngày (NT3 và NT4) và hoạt tính PO giảm trong thời gian ăn kháng sinh và tăng khi ngưng cho ăn oxytetracylin.. - Hoạt tính của respiratory burst không có sự khác biệt giữa các nghiệm thức trước khi cảm nhiễm và giữa các lần thu mẫu. - Tuy nhiên, ngày thứ 3 sau cảm nhiễm, hoạt tính RBs giảm có ý nghĩa thống kê (P<0,05) ở NT2 (cảm nhiễm), NT3 (cho ăn oxytetracylin) và NT4 (cảm nhiễm và cho ăn oxytetracylin) so với nghiệm thức 1 (không cảm nhiễm). - Riêng ở NT4, hoạt tính RBs tăng chậm và vẫn thấp hơn có ý nghĩa thống kê so với NT1, NT2 và NT3 (Bảng 1).. - Theo nghiên cứu của Song and Hsieh (1994), superoxide anion và hydrogen peroxide (H 2 O 2 ) được giải phóng ra từ các tế bào máu có vai trò quan trọng trong quá trình tiêu diệt mầm bệnh ở tôm. - Sự gia tăng hoạt tính RBs chứng tỏ các gốc oxy tự do được tế bào máu tôm giải gióng ra để diệt khuẩn (Sarathi et al., 2008). - Tuy nhiên trong nghiên cứu này, hoạt tính của RBs giảm sau khi cảm nhiễm chứng tỏ, khả năng phóng thích các gốc oxy tự do của tôm giảm gây ảnh hưởng đến sự đề kháng chống lại vi khuẩn cảm nhiễm.. - 3.4.4 Hoạt tính của superoxide dismutase Hoạt tính của superoxide dismutase (SOD) ở NT1 không có sự khác biệt giữa các lần thu mẫu trước và sau cảm nhiễm. - Tuy nhiên sau 3 ngày cảm nhiễm, hoạt tính của SOD ở NT3 và NT4 giảm mạnh hơn so với NT2 và tăng trở lại sau 6 ngày cảm nhiễm (nhanh nhất ở NT 2 và chậm nhất ở NT4).. - Hoạt động của SOD là một trong những cơ chế bảo vệ chính, giúp cơ thể chống stress oxy hóa gây ra bởi ô nhiễm, bệnh truyền nhiễm, tình trạng thiếu oxy (hypoxia), quá nhiều oxy (hyperoxia), nhiệt độ và các chất kích thích miễn dịch (Neves et al., 2000).. - Hoạt tính của SOD ở tôm giảm trong thí nghiệm này phù hợp với kết quả của Li et al. - (2008) khi ghi nhận sự giảm hoạt tính của chỉ tiêu miễn dịch khi tôm cảm nhiễm vi khuẩn V. - Ren et al. - (2014) sử dụng flofenicol để tìm hiểu ảnh hưởng của kháng sinh này trên hệ miễn dịch của tôm thẻ chân trắng cũng ghi nhận hoạt tính SOD giảm nhanh so với các chỉ tiêu khác và tăng lại sau 4 ngày cảm nhiễm.. - Kết quả phân tích các chỉ tiêu miễn dịch cho thấy, cho tôm ăn OTC (liều 2 g/kg thức ăn) liên tục trong 5 ngày (trong trường hợp tôm không cảm nhiễm vi khuẩn) sẽ làm suy giảm các chỉ tiêu miễn dịch THC, PO, RBs và SOD gây ảnh hưởng tiêu cực đến sức khỏe tôm. - Mặc dù chưa có nhiều minh chứng về tác dụng phụ của OTC lên đáp ứng miễn dịch của tôm, nhưng tác dụng phụ của OTC lên đáp miễn dịch của cá đã được nhiều tác giả công bố.. - OTC ức chế hệ miễn dịch cá chép (Grondel et al., 1985), làm khả năng thực bào của đại thực bào và làm giảm hoạt tính RBs ở cá hồi, cá bơn và cá chép (Wishkovsky et al., 1987. - Tafalla et al., 2002).. - Các chỉ tiêu miễn dịch THC, PO, RBs và SOD giảm khi cho tôm thẻ chân trắng ăn thức ăn có bổ sung oxytetracylin khi cảm nhiễm và không cảm nhiễm vi khuẩn V. - parahaemolyticus gây hoại tử gan tụy cấp tính. - Kết quả trên cho thấy sử dụng oxytetracylin để phòng bệnh hay trị bệnh đều làm suy giảm miễn dịch và có thể gây chết tôm.