Bước đầu đánh giá khả năng loại trừ vi khuẩn gây bệnh hoại tử gan tụy cấp (AHPND) Vibrio parahaemolyticus bằng phương pháp sử dụng hệ sợi nấm trong hệ thống nuôi tôm

- BƯỚC ĐẦU ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG LOẠI TRỪ VI KHUẨN GÂY BỆNH HOẠI TỬ GAN TỤY CẤP (AHPND) Vibrio parahaemolyticus BẰNG PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG HỆ SỢI NẤM TRONG HỆ THỐNG NUÔI TÔM.
- Ngành nuôi tôm ở Việt Nam đang bị đe doạ bởi sự bùng nổ của nhiều loại dịch bệnh, đặc biệt là bệnh hoại tử gan tụy do vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây ra, tỉ lệ chết lên đến 100% trong thời gian ngắn ở các trang trại nuôi tôm.
- Việc sử dụng hệ sợi nấm kiểm soát dịch bệnh AHPND trên tôm với lợi thế chi phí thấp và thân thiện với môi trường là một phương pháp đầy tiềm năng.
- Trong nghiên cứu này, hệ sợi nấm gồm có Schizophyllum commune, Pleurotus ostreatus và Pycnoporus sanguineus được sử dụng để kiểm tra khả năng kiểm soát vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus.
- Tôm được gây cảm nhiễm bằng cách thêm dịch huyền phù Vibrio parahaemolyticus ở nồng độ 10 5 CFU/mL.
- Khoảng 5 gam cơ chất bao phủ bởi các sợi tơ nấm được áp dụng trên từng bể nuôi tôm Penaeus vannamei PL30-35 riêng lẻ, mẫu tôm được thu để đánh giá khả năng kiểm soát vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus của từng loại nấm.
- Kết quả cho thấy, hệ sợi nấm Pycnoporus sanguineus có khả năng loại bỏ 99% vi khuẩn V.parahaemolyticus, mặc dù tỉ lệ sống của tôm thẻ chân trắng còn thấp, vào khoảng 65% sau thí nghiệm.
- Cần có thêm nhiều nghiên cứu nhằm tối đa hóa khả năng kiểm soát vi khuẩn gây bệnh AHPND trên tôm của hệ sợi nấm để có thể ứng dụng thực tế trong nuôi tôm..
- Bước đầu đánh giá khả năng loại trừ vi khuẩn gây bệnh hoại tử gan tụy cấp (AHPND) Vibrio parahaemolyticus bằng phương pháp sử dụng hệ sợi nấm trong hệ thống nuôi tôm.
- Bệnh hoại tử gan tụy cấp trên tôm (EMS/AHPND) được gây ra do các chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus có chứa các gen quy định độc tố PirA và PirB tương tự như độc tố của Photorhabdus spp (Han et al., 2015).
- Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng hệ sợi nấm có khả năng loại bỏ một số loài vi khuẩn và kim loại nặng khỏi nước (Stamets, 2005.
- Tuy nhiên, hiện nay chưa có nhiều nghiên cứu về việc sử dụng hệ sợi nấm trong kiểm soát mầm bệnh do vi khuẩn gây ra trên tôm.
- Nghiên cứu này được tiến hành nhằm mục đích kiểm tra tính hiệu quả và tính khả thi của việc áp dụng hệ sợi nấm của 3 loài nấm phân hủy gỗ: Schizophyllum commune, Pleurotus ostreatus và Pycnoporus sanguineus nhằm kiểm soát mầm bệnh trên tôm gây ra bởi Vibrio parahaemolyticus trong hệ thống nuôi trồng thủy sản..
- Các công dụng dịch khuẩn, ức chế khả năng phát triển của vi khuẩn của các loài nấm này cũng đã được nghiên cứu.
- Theo nghiên cứu của Pham et al.
- (2017), Pycnoporus sanguineus có khả năng ức chế sự phát triển của 7 chủng vi khuẩn bao gồm Bacillus subtilis, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio cholerae, và Salmonella typhi.
- Loài Schizophyllum commune có thể kiểm soát và ức chế 82% và 97.8% lượng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus trong môi trường nuôi cấy lỏng sau lần lượt 6 và 8 giờ theo kết quả nghiên cứu của Ngo et al., 2016.
- Ngoài ra, với khả năng ức chế và kiểm soát được sự sinh trưởng của một số loài vi khuẩn khác nhau như Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis, Candida parapsilosis (Mustafa et al., 2015) thì Pleurotus ostreatus cũng là một loài nấm có tiềm năng ứng dụng trong việc kiểm soát V.
- parahaemolyticus trong nghiên cứu này..
- Nghiên cứu này được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Thủy sinh Ứng dụng, Đại học Quốc tế, Đại học Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh.
- Ba loài nấm phân hủy gỗ mục khác nhau được sử dụng trong nghiên cứu này, bao gồm Schizophyllum commune, Pleurotus ostreatus và Pycnoporus sanguineus được cung cấp bởi Phòng thí nghiệm Thủy sinh Ứng dụng.
- Chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây.
- Sau ba tháng, sợi nấm của các chủng nấm sẽ bao phủ toàn bộ bề mặt và cơ chất của túi, và sẵn sàng để sử dụng trong các thí nghiệm..
- 2.4 Xác định đường cong tăng trưởng của Vibrio parahaemolyticus.
- Vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây ra bệnh AHPND được cấy truyền từ ống trữ đông (bảo quản bằng glycerol ở -80 o C) vào môi trường thạch Tryptone Soya Agar (TSA) và môi trường lỏng Tryptone Soya Broth (TSB) bổ sung 2% NaCl..
- Đường cong sinh trưởng của chủng vi khuẩn được thực hiện để xác định điểm thích hợp nhất để tiến hành thí nghiệm gây cảm nhiễm trên tôm.
- 1 mL dịch huyền phù vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus được chuyển vào 50 mL môi trường TSB và ủ ở 30 0 C..
- Mật độ quang (OD) của dịch huyền phù vi khuẩn được đo định kì sau và 14 giờ ở bước sóng 600 nm bằng máy đo quang phổ.
- Dịch huyền phù vi khuẩn đã được trải trên môi trường TSA để kiểm chứng số lượng vi khuẩn có trong dịch huyền phù ngay tại các thời điểm của đường cong sinh trưởng..
- 2.5 Nuôi tôm ở điều kiện thí nghiệm chuẩn bị cho quy trình cảm nhiễm.
- Tôm thí nghiệm được nuôi trong bể composite 500 L với nước biển có độ mặn 20 ppt, pH 7,0-7,8 đến giai đoạn PL30-35.
- Tôm thẻ chân trắng sau đó được chuyển vào bể thủy tinh thí nghiệm để thích nghi trước với môi trường thí nghiệm..
- 2.6 Thí nghiệm xác định độc tính của sợi nấm trên PL10 Paneus vannamei.
- Để kiểm tra các độc tố có thể được tạo ra bởi ba loại nấm khác nhau có thể ảnh hưởng đến tôm, thí nghiệm xác định độc tính của sợi nấm đã được tiến hành dựa trên cơ sở của nghiên cứu bởi Mentor et al.
- Tôm được theo dõi tỉ lệ sống để đánh giá độc tính của các loại nấm..
- 2.7 Xác định nồng độ vi khuẩn thích hợp cho thí nghiệm cảm nhiễm.
- Thí nghiệm thăm dò đã được tiến hành để xác định nồng độ vi khuẩn thích hợp sử dụng trong nghiên cứu gây cảm nhiễm vi khuẩn V..
- Nồng độ vi khuẩn được sử dụng trong thí nghiệm này được xác định bằng cách đo OD của dịch huyền phù vi khuẩn trước khi cảm nhiễm tại thời điểm được chọn từ đường cong tăng trưởng của vi khuẩn.
- Hai nồng độ được sử dụng cho thí nghiệm này là 10 7 và 10 6 CFU/mL.
- Tỉ lệ sống của tôm được ghi nhận sau một ngày thí nghiệm..
- 2.8 Đánh giá hiệu quả của hệ sợi nấm ức chế vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus.
- Chuẩn bị bình thí nghiệm và áp dụng hệ sợi nấm Các bình chứa nhỏ đã được chuẩn bị chứa 10 con tôm trong 500 mL nước biển độ mặn 20 ppt, có sục khí.
- chất bả mía chứa sợi nấm đã được lấy ra và đưa vào túi vải, mỗi túi chứa 5 gam cơ chất, tương tự như thí nghiệm xác định độc tính của nấm..
- Đánh giá hiệu quả của hệ sợi nấm.
- Thí nghiệm được lặp lại 2 lần.
- Các túi chứa sợi nấm được đưa vào các bình chứa một giờ trước khi thử nghiệm.
- 5 mL huyền phù vi khuẩn với nồng độ tương đương 10 5 CFU/mL được cảm nhiễm vào bình đối chứng dương và các bình nghiệm thức chứa hệ sợi nấm..
- Thời gian thí nghiệm kéo dài trong bốn ngày.
- Mẫu nước từ bể được thu thập và trải trên đĩa thạch TCBS sau khi cảm nhiễm 2 giờ và vào ngày cuối cùng của thí nghiệm..
- Hai đoạn mồi được sử dụng trong thí nghiệm này là: VpPirA-284F (5'- TGACTATTCTCACGATTGGGG-3.
- 3 KẾT QUẢ.
- 3.1 Quan sát quá trình tăng trưởng của chủng vi khuẩn.
- Sự phát triển của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus được theo dõi thường xuyên từ giờ thứ tư sau khi tăng sinh bằng cách sử dụng máy quang phổ ở bước sóng 600 nm đo dịch huyền phù nuôi khuẩn.
- Dịch huyền phù vi khuẩn có giá trị OD từ 0.9 đến 1.0 được trải lên thạch TCBS để đếm mật độ vi.
- Kết quả cho thấy, giá trị OD từ 0,9 đến 1,0 sẽ tương ứng với mật độ vi khuẩn khoảng 10 8 CFU/mL..
- |kết quả đo OD ở 600nm (n=1) 3.2 Thí nghiệm xác định độc tính của các.
- Trong thí nghiệm độc tính, tôm được nuôi trong, các bình chứa với các túi chứa cơ chất và sợi nấm của 3 loài nấm: Schizophyllum commune, Pleurotus ostreatus và Pycnoporus sanguineus, và một bình.
- Hình 2: Tỉ lệ sống của tôm thẻ chân trắng PL10 sau bốn ngày sống trong nước ngâm giá thể chứa sợi nấm.
- 3.3 Cảm nhiễm để xác định nồng độ vi khuẩn.
- Để xác định nồng độ vi khuẩn thích hợp cho thí nghiệm cảm nhiễm, hai nồng độ vi khuẩn đã được thử nghiệm, và sau 24 giờ đầu tiên, nồng độ có tỉ lệ.
- Từ các kết quả được biểu hiện ở hình 3, nồng độ 10 6 CFU / mL đã được quyết định là phù hợp cho thí nghiệm vì có tỉ lệ tử vong cao sau một ngày..
- Thí nghiệm được lặp lại hai lần với 10 tôm mỗi bể.
- 3.4 Đánh giá hiệu quả bảo vệ của hệ sợi nấm kháng Vibrio parahaemolyticus.
- Ảnh hưởng của sợi nấm đến tỉ lệ sống của tôm thẻ chân trắng.
- Tôm trong nghiệm thức đối chứng dương chết do AHPND sau 4 ngày thử nghiệm, trong khi tỉ lệ sống của đối chứng âm là 90% vào cuối thời gian thí nghiệm..
- Trong thí nghiệm này, tỉ lệ sống của tôm trong ba nghiệm thức đều trên 50%.
- Trong số đó, tỉ lệ sống của nghiệm thức chứa nấm P.ostreatus cao nhất.
- trong khi tỉ lệ sống của S.
- Nghiệm thức sử dụng P.
- sanguineus khác biệt đáng kể so với đối chứng dương (p<0,05), nhưng không khác với đối chứng âm (p>0,05) .Tuy nhiên, tỉ lệ sống của S.
- Bảng 1: Tỉ lệ sống của tôm trong thí nghiệm.
- Khả năng ức chế vi khuẩn của sợi nấm trong môi trường nuôi trồng thủy sản.
- Trong thí nghiệm này, các mẫu nước được lấy tại hai thời điểm khác nhau và được trải đĩa tương tự như các thí nghiệm trước đó.
- Cụ thể, số lượng vi khuẩn V.
- sanguineus, cũng là tỉ lệ loại bỏ cao nhất.
- commune cho thấy có tỉ lệ loại bỏ vi khuẩn lên đến 91,8%, thì tỉ lệ loại bỏ vi khuẩn của P..
- Hình 4: Khả năng loại bỏ vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus sau khi kết thúc thí nghiệm Kết quả PCR của thí nghiệm đánh giá hiệu quả.
- parahaemolyticus của sợi nấm bằng phương pháp ngâm cơ chất nuôi nấm vào nước nuôi tôm.
- Hình 5: Kết quả PCR định danh Vibrio parahaemolyticus trên tôm sống và chết trong thí nghiệm Kết quả cho thấy rõ rằng trong thí nghiệm này.
- chỉ có tôm chết là mang mầm bệnh vi khuẩn với 2 band rõ rệt ở vị trí 284 và 392 bp.
- Kết quả thí nghiệm cảm nhiễm cho thấy, liều lượng thích hợp để gây nhiễm tôm thẻ chân trắng với Vibrio parahaemolyticus là 10 7 CFU / mL, tương ứng với kết quả OD bằng 0,9.
- (2014), mật độ vi khuẩn cảm nhiễm thông thường dao động từ 10 5 đến 10 6 CFU/mL.
- Khi thực hiện thí nghiệm, OD của dịch vi khuẩn là khoảng 0,9 nhưng cho dịch vào bể nuôi, kết quả đếm đĩa cho thấy mật.
- Nồng độ này thấp hơn mật độ vi khuẩn sử dụng trong thí nghiệm cảm nhiễm, nhưng nó vẫn được chấp nhận dựa trên các thí nghiệm từ các nghiên cứu khác..
- Tương tự, Pycnoporus sanguineus đã được báo cáo là có hoạt tính kháng khuẩn đối với nhiều loài vi khuẩn trong nghiên cứu của Smfinia (1995).
- Trong thí nghiệm ngâm trực tiếp sợi nấm, tỉ lệ sống của tôm trong các nghiệm thức cao đáng kể..
- Tuy nhiên, các phân tích thống kê chỉ ra rằng không có sự khác biệt đáng kể giữa các nghiệm thức có nấm và đối chứng dương và âm trong thời gian thí nghiệm ngoại trừ thời điểm 15 giờ.
- Tỉ lệ sống của tôm ở hai nghiệm thức P.
- Tuy nhiên, tỉ lệ sống của tôm trong nghiệm thức sử dụng S.
- sanguineus có thể kiểm soát sự phát triển của mầm bệnh bằng phương pháp ngâm và giữ tôm khỏe mạnh, nhưng sợi nấm của S.
- Sau 4 ngày thí nghiệm, không chỉ tỉ lệ sống của tôm là tương đối cao (65-75.
- Trong khi tỉ lệ loại bỏ mầm bệnh của P.
- commune lớn hơn 90%, thì tỉ lệ loại bỏ mầm bệnh của P.
- Đáng chú ý là tuy tỉ lệ loại bỏ vi khuẩn của P.
- Điều này có thể do tác động của các hợp chất sinh học được bài tiết bởi loài nấm này, có khả năng ức chế vi khuẩn ở mức độ thấp hơn hai loài kia, nhưng không làm ảnh hưởng nhiều đến sự sinh trưởng của tôm.
- Hơn nữa, kết quả PCR cho thấy rằng chỉ tôm chết trong thí nghiệm này mới nhiễm V..
- Các thí nghiệm sử dụng sợi nấm trong điều trị bệnh AHPND ở tôm nuôi nên được thực hiện trong tương lai để có thể ứng dụng thực tế trong nuôi tôm..
- Tóm lại, các thí nghiệm trong nghiên cứu này sử dụng hệ sợi nấm trên cơ chất cho thấy tiềm năng ức chế vi khuẩn V.
- Trong số ba loại nấm phân hủy gỗ được sử dụng trong nghiên cứu này, thì nghiệm thức sử dụng Pycnoporus sanguineus và Pleurotus ostreatus là những nghiệm thức có tỉ lệ tôm sống cao nhất và hiệu quả ức chế hoạt động của mầm bệnh tốt nhất trong 15 giờ thí nghiệm (p<0,05)..
- Nghiên cứu này được tiến hành nhằm tạo tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo về hướng xử lí vi khuẩn gây bệnh trên môi trường nước nuôi thủy sản.
- Chính vì vậy, các nghiên cứu tìm hiểu về phương pháp cải tiến và phát triển quy trình chế tạo màng lọc sinh học từ tơ nấm trên cơ chất đang được tiến hành nhằm đẩy mạnh hiệu suất sản xuất cơ chất chứa sợi tơ nấm cho hiệu suất xử lí vi khuẩn gây bệnh cao và hiệu quả hơn hiện tại.